響應(yīng)面法優(yōu)化超聲波-微波協(xié)同提取黑果枸杞葉總黃酮工藝

段亞云，李建穎，程瑤，李金榮

（天津商業(yè)大學(xué)生物技術(shù)與食品科學(xué)學(xué)院，天津市食品生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津300134）

黑果枸杞（Lycium ruthenicum）為茄科（Solanaceae）枸杞屬（Lycium）植物，主要生長(zhǎng)在荒地、沙漠等較干旱地區(qū)。在我國(guó)主要分布于山西北部、寧夏、甘肅、青海、新疆等省份[1]，是我國(guó)西北荒漠地區(qū)極其珍貴的藥食兩用珍品，亟待開(kāi)發(fā)[2]。其果實(shí)可以滋肝補(bǔ)腎，調(diào)節(jié)氣血，明目降壓[3]，其葉可以制茶，降血脂，抗衰老。黃酮類物質(zhì)是植物中重要的次生代謝產(chǎn)物之一，具有吸收紫外線、抗癌、抗氧化、免疫等多種功效[4-5]，目前廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)、醫(yī)療保健和化妝品等行業(yè)[6]?，F(xiàn)代研究表明[7-8]，黑果枸杞葉中含有豐富的黃酮類物質(zhì)，且其具有廣泛的生理活性和營(yíng)養(yǎng)保健作用。研究黑果枸杞葉總黃酮的提取工藝對(duì)于進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用黑果枸杞具有重要意義。

超聲波對(duì)黃酮類化合物的提取主要源于其空化作用，致使溶液內(nèi)部產(chǎn)生較強(qiáng)的沖擊波，同時(shí)伴有強(qiáng)烈的機(jī)械效應(yīng)和熱效應(yīng)，能從整體上提高提取過(guò)程的傳質(zhì)速率和效果，縮短提取時(shí)間[9-10]。微波對(duì)分子間作用力以及氫鍵等具有較強(qiáng)的破壞力，是一種非電離的電磁輻射。相比較超聲波來(lái)說(shuō)，微波可使溶劑和溶質(zhì)均勻受熱，克服了熱水浸提法易糊化的缺點(diǎn)，有利于細(xì)胞中有效成分的溶出，且時(shí)間短，用量少，效率高。因此，超聲波-微波協(xié)同提取法可以將兩種方法結(jié)合起來(lái)，實(shí)現(xiàn)優(yōu)勢(shì)互補(bǔ)，從而可獲得更高的提取率[11]。本試驗(yàn)將采用超聲波-微波協(xié)同提取技術(shù)，研究不同因素條件對(duì)黑果枸杞葉總黃酮提取率的影響，通過(guò)響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)確定最佳工藝條件，為黑果枸杞葉的綜合開(kāi)發(fā)提供理論依據(jù)和數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

黑果枸杞葉：甘肅省民勤縣；蘆?。⊿tandard）：德國(guó)Dr.Ehrdnstorfer Gmbh公司；乙醇（AR）：天津市凱通化學(xué)試劑科技有限公司；鹽酸（AR）、氫氧化鈉（AR）、硝酸鋁（AR）、亞硝酸鈉（AR）：天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司。

BSA224S-CW分析天平：德國(guó)Sartorius集團(tuán)；RV10DIGITAL旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：德國(guó)IKA公司；UV-2600紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：日本Shimadzu；RV10DIGI TALXO-SM50超聲波-微波協(xié)同反應(yīng)系統(tǒng)：南京先歐儀器制造有限公司；Spex 6875冷凍研磨儀：美國(guó)Spex；DW-86L290（J）超低溫保存箱：青島海爾特種電器有限公司；DH-101電熱鼓風(fēng)干燥箱：上海精密科學(xué)儀器有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 樣品預(yù)處理

將黑果枸杞葉置于100℃烘箱中殺青30 min，后放入60℃干燥箱中，烘干至恒重，粉碎后過(guò)100目篩，置于干燥器中備用。

1.2.2 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的制定

準(zhǔn)確稱取0.0200g蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品，置于100.0mL容量瓶中，用70%乙醇溶解定容，制成濃度為0.2000mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液[12]。將上述溶液用70%乙醇稀釋成濃度為 0.000、0.010、0.020、0.040、0.080、0.120、0.160、0.180、0.200 mg/mL溶液。各取1 mL置于試管中，向其中分別加入1 mL70%乙醇和0.5 mL 5%的NaNO2溶液，混勻后靜置6 min。再加入0.5 mL 10%的Al（NO3）3溶液，搖勻后放置6 min，最后加入2 mL 4%NaOH，混勻后放置15 min。測(cè)定每組溶液在510 nm下的吸光度值。以蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液濃度（C）為橫坐標(biāo)，吸光度（A）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得回歸曲線方程A=9.515 15C+0.090 866 7（R2=0.999 3），線性范圍：0.008 mg/mL～0.028 mg/mL。

1.2.3 總黃酮提取工藝

準(zhǔn)確稱量2.000 g處理好的黑果枸杞葉粉末，采用超聲波-微波協(xié)同反應(yīng)系統(tǒng)（超聲頻率為40 kHz），通過(guò)改變微波功率、液料比、提取時(shí)間和乙醇濃度4個(gè)條件進(jìn)行提取，旋蒸后將提取液置于-80℃超低溫保存箱內(nèi)進(jìn)行預(yù)凍24 h，將處理好的樣品進(jìn)行冷凍干燥48 h，即得樣品粉末。

1.2.4 總黃酮含量的測(cè)定

取一定質(zhì)量的待測(cè)樣品粉末，用70%乙醇溶解后取一定體積的樣品液，用70%乙醇定容至某一體積。取定容后的溶液1 mL，置于試管中。按1.2.2的方法測(cè)定待測(cè)溶液在510 nm下的吸光度值，帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線中，求出粗提物中總黃酮的含量。根據(jù)算得的樣品液中總黃酮濃度，按如下公式，計(jì)算總黃酮提取率。

式中：x為樣品中總黃酮提取率，%；C為由回歸方程算得的樣液濃度，mg/mL；V1為樣液體積，mL；V2為樣品定容體積，mL；V3為顯色反應(yīng)測(cè)定時(shí)取用樣品的體積，mL；m 為樣品質(zhì)量，mg。

1.2.5 單因素試驗(yàn)

1.2.5.1 微波功率對(duì)總黃酮提取率的影響

采用超聲波-微波協(xié)同提取的方法，以60%乙醇為提取溶劑，在液料比為25∶1（mL/g），超聲功率為200 W，提取時(shí)間12 min的條件下，分別在100、125、150、175、200 W的微波功率下提取黑果枸杞葉總黃酮。

1.2.5.2 液料比對(duì)總黃酮提取率的影響

采用超聲波-微波協(xié)同提取的方法，以60%乙醇為提取溶劑，在微波功率為200 W，超聲功率為200 W，提取時(shí)間 12 min的條件下，分別設(shè)定 10 ∶1、15 ∶1、20 ∶1、25 ∶1、30 ∶1（mL/g）的液料比條件，提取黑果枸杞葉總黃酮。

1.2.5.3 提取時(shí)間對(duì)總黃酮提取率的影響

采用超聲波-微波協(xié)同提取的方法，以60%乙醇為提取溶劑，在液料比為25∶1（mL/g），微波功率為200 W，超聲功率為200 W的條件下，分別設(shè)定6、8、10、12、14 min的提取時(shí)間，提取黑果枸杞葉總黃酮。

1.2.5.4 乙醇濃度對(duì)總黃酮提取率的影響

采用超聲波-微波協(xié)同提取的方法，在液料比為25∶1（mL/g），微波功率為 200 W，超聲功率為 200 W，提取時(shí)間12 min的條件下，分別采用50%、60%、70%、80%、90%的乙醇為提取溶劑，提取黑果枸杞葉總黃酮。

1.2.5.5 超聲功率對(duì)總黃酮提取率的影響

采用超聲波-微波協(xié)同提取的方法，以60%乙醇為提取溶劑，在液料比為25∶1（mL/g），微波功率為200 W，提取時(shí)間12 min的條件下，分別考察超聲功率為 100、200、300、400、500 W 對(duì)黑果枸杞葉總黃酮提取率的影響，發(fā)現(xiàn)超聲功率對(duì)其影響極不顯著，從節(jié)約能耗角度考慮，最終選擇超聲功率200 W。

1.2.6 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，運(yùn)用Design-Expert 8.0軟件，根據(jù)Box-Behnken中心組合試驗(yàn)原理[13]，分別選取微波功率（A）、液料比（B）、提取時(shí)間（C）及乙醇濃度（D）4個(gè)因素，以總黃酮提取率為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn)，因素和水平見(jiàn)表1。

表1 響應(yīng)面分析因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface methodology

2 結(jié)果與分析

2.1 微波功率對(duì)總黃酮提取率的影響

微波功率對(duì)黑果枸杞葉總黃酮提取率的影響如圖1所示。

圖1 微波功率對(duì)總黃酮提取率的影響Fig.1 Effect of microwave power on the extraction rate of total flavonoids

隨著微波功率的增大，提取率逐漸增大，在功率為175 W的時(shí)候，提取率達(dá)到最大值，因?yàn)槌跏茧A段，隨著功率的增大，微波作用逐漸加強(qiáng)，加速黃酮物質(zhì)的溶解。但功率繼續(xù)增大時(shí)，提取率下降明顯，可能是因?yàn)殡S著功率的進(jìn)一步加強(qiáng)，溫度升高，會(huì)破壞一些黃酮物質(zhì)[14]，也會(huì)導(dǎo)致部分溶劑揮發(fā)，致使提取率降低。所以微波功率以175 W左右為宜。

2.2 液料比對(duì)總黃酮提取率的影響

液料比對(duì)總黃酮提取率的影響如圖2所示。

圖2 液料比對(duì)總黃酮提取率的影響Fig.2 Effect of liquid-soild ratio on the extraction rate of total flavonoids

隨著液料比的逐漸增加，溶劑對(duì)黃酮類物質(zhì)進(jìn)行更加充分的溶解，在液料比為20∶1（mL/g）時(shí)達(dá)到最大。但隨著液料比的進(jìn)一步增大，可能會(huì)導(dǎo)致一些其他雜質(zhì)成分溶出，降低總黃酮提取率[14]。最終選擇液料比為 20 ∶1（mL/g）。

2.3 提取時(shí)間對(duì)總黃酮提取率的影響

提取時(shí)間對(duì)總黃酮提取率的影響如圖3所示。

隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，總黃酮提取率逐漸增大，并在提取時(shí)間為10 min時(shí)達(dá)到最大值，但隨著時(shí)間的進(jìn)一步延長(zhǎng)，可能會(huì)導(dǎo)致部分黃酮類物質(zhì)發(fā)生分解，致使提取率降低。所以，最終選擇提取時(shí)間為10 min。

圖3 提取時(shí)間對(duì)總黃酮提取率的影響Fig.3 Effect of extraction time on the extraction rate of total flavonoids

2.4 乙醇濃度對(duì)總黃酮提取率的影響

乙醇濃度對(duì)總黃酮提取率的影響如圖4所示。

圖4 乙醇濃度對(duì)總黃酮提取率的影響Fig.4 Effect of ethanol concentration on the extraction rate of total flavonoids

隨著乙醇濃度的逐漸增大，總黃酮的提取率快速提高，但在乙醇濃度達(dá)到70%之后，提取率基本不再發(fā)生改變，可能是黑果枸杞葉黃酮更易溶于高濃度乙醇，為降低成本，最終選擇乙醇濃度為70%。

2.5 響應(yīng)面優(yōu)化黑果枸杞葉總黃酮提取條件

2.5.1 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

以單因素試驗(yàn)結(jié)果為基礎(chǔ)，依據(jù)Box-Behnken中心組合試驗(yàn)原理，以黑果枸杞葉總黃酮提取率為響應(yīng)值，進(jìn)行響應(yīng)面分析，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Result of response surface test

續(xù)表2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果Continue table 2 Result of response surface test

2.5.2 模型方程的建立與顯著性檢驗(yàn)

采用Design-Expert 8.0軟件進(jìn)行方差分析，獲得黑果枸杞葉總黃酮提取率對(duì)編碼自變量微波功率、液料比、提取時(shí)間和乙醇濃度的二次多項(xiàng)回歸。根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果建立的模型方程為：Y=0.99+0.021A-0.15B-0.027C-0.075D+0.022AB+0.028AC-0.035AD+0.071BC-0.12BD-0.002 8CD-0.24A2-0.32B2-0.39C2-0.27D2，分析結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 回歸模型的方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

續(xù)表3 回歸模型的方差分析Continue table 3 Variance analysis of regression model

模型方程中，各項(xiàng)系數(shù)的絕對(duì)值相對(duì)大小直接反映各因素對(duì)響應(yīng)值的影響情況。此方程的二項(xiàng)式系數(shù)為負(fù)數(shù)，故方程圖像開(kāi)口向下有最大值，可進(jìn)行優(yōu)化分析。由一次項(xiàng)系數(shù)分析得出，各因素對(duì)黑果枸杞葉總黃酮提取率的相對(duì)影響程度為：B（液料比）＞D（乙醇濃度）＞C（提取時(shí)間）＞A（微波功率）。由表3可知此模型極為顯著（P＜0.01），液料比與乙醇濃度為極顯著因素（P＜0.01），BD 交互極為顯著（P＜0.01），BC 交互顯著（0.01＜P＜0.05）。失擬項(xiàng)不顯著（P＞0.05），說(shuō)明模型與實(shí)際情況擬合較好，使用該方程進(jìn)行試驗(yàn)分析是可行的。

2.5.3 響應(yīng)面圖分析

為進(jìn)一步研究各因素之間交互作用的影響，通過(guò)Design-Expert繪制的黑果枸杞葉總黃酮提取率三維響應(yīng)面進(jìn)行分析。響應(yīng)面坡度都相對(duì)平緩，表明可以忍受處理?xiàng)l件的變異，等高線圖中同一橢圓型區(qū)域內(nèi)表示提取率相同，中心最高，越向邊緣擴(kuò)散越低，且橢圓曲線排列越密表明該因素對(duì)總黃酮提取率影響越大。同時(shí)等高線越接近圓型，說(shuō)明兩因素交互作用越弱，越接近橢圓型，說(shuō)明交互作用越顯著[15]。液料比和提取時(shí)間、乙醇濃度兩個(gè)因素之間的交互作用顯著（圖5、圖6），提取時(shí)間和微波功率之間交互作用較弱（圖7）。

圖5 液料比和提取時(shí)間對(duì)總黃酮提取率的交互作用Fig.5 Effect of interaction between liquid-soild ratio and extraction time on the extraction rate of total flavonoids

圖6 液料比和乙醇濃度對(duì)總黃酮提取率的交互作用Fig.6 Effect of interaction between liquid-soild ratio and ethanol concentration on the extraction rate of total flavonoids

2.5.4 驗(yàn)證試驗(yàn)

由優(yōu)化后的模型方程求解，可得出在試驗(yàn)范圍內(nèi)黑果枸杞葉總黃酮的最佳提取工藝：微波功率175.93 W，液料比 18.88 ∶1（mL/g），提取時(shí)間 9.89 min，乙醇濃度69.09%，在此條件下黑果枸杞葉總黃酮的提取率理論上可達(dá)1.01%。在實(shí)際試驗(yàn)條件下，最佳提取工藝為：微波功率 175 W，液料比 18.9 ∶1（mL/g），提取時(shí)間9.9 min，乙醇濃度69%，并在此條件下進(jìn)行3組平行試驗(yàn)，所得的總黃酮提取率為（0.997±0.015）%，理論預(yù)測(cè)值為1.01%，結(jié)果與預(yù)測(cè)值基本符合，證明該模型有效。

圖7 提取時(shí)間和乙醇濃度對(duì)總黃酮提取率的交互作用Fig.7 Effect of interaction between extraction time and ethanol concentration on the extraction rate of total flavonoids

3 結(jié)論

本文采用響應(yīng)面法優(yōu)化黑果枸杞葉總黃酮的提取工藝，通過(guò)對(duì)微波功率、液料比、提取時(shí)間和乙醇濃度4個(gè)因素的考察，液料比和乙醇濃度達(dá)到顯著水平，主次關(guān)系依次為：液料比＞乙醇濃度＞提取時(shí)間＞微波功率。利用Design-Expert 8.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，并在實(shí)際試驗(yàn)條件的矯正下，結(jié)果表明黑果枸杞葉總黃酮的最佳提取工藝為：微波功率175 W，超聲功率為200 W，液料比 18.9 ∶1（mL/g），提取時(shí)間 9.9 min，乙醇濃度69%。在此條件下提取得到的黑果枸杞葉總黃酮提取率為（0.997±0.015）%。利用超聲波-微波協(xié)同提取法對(duì)黑果枸杞葉總黃酮進(jìn)行提取，最高提取率可達(dá)1.01%，明顯優(yōu)于李淑珍等[16]乙醇浸提法，極大程度縮短了提取時(shí)間，且提取率明顯提高。