超聲輔助法提取柿子葉中總黃酮工藝的研究

張立攀，周莉，關(guān)炳峰，王法云，劉紅偉，高火亮，賈艷，羅蓓蓓，李鵬沖

（河南省商業(yè)科學(xué)研究所有限責(zé)任公司，河南鄭州450000）

我國(guó)柿和柿子葉資源非常豐富，柿的種類(lèi)超過(guò)40種，種植地域廣泛，在東部、南部山區(qū)，華北、東北平原和西北高原地區(qū)均有分布[1-3]。現(xiàn)代社會(huì)對(duì)柿子的產(chǎn)品開(kāi)發(fā)水平較高，包括各種即食、保健、發(fā)酵食品和美容及清潔產(chǎn)品，但是對(duì)柿子葉的產(chǎn)品開(kāi)發(fā)較少。近來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，柿子葉中復(fù)雜的化學(xué)成分中，某些成分對(duì)人體健康有很大益處，可用于咳喘、肺氣脹的治療以及其他臨床疾病[4-10]的治療。這些有益成分包括黃酮、酚類(lèi)有機(jī)酸[11-14]、維生素類(lèi)與微量元素等營(yíng)養(yǎng)成分[15-17]。其中，黃酮是最重要的組分且含量較高。柿子葉資源豐富、來(lái)源廣泛，而作為柿子葉中有益成分重要的組成，黃酮類(lèi)化合物具有很多對(duì)健康有益的生理作用[18-19]，因此柿子葉總黃酮的研究及其相關(guān)的深加工產(chǎn)品開(kāi)發(fā)，是對(duì)現(xiàn)有資源的深入開(kāi)發(fā)和利用，具有良好的前景。

從各種植物中提取總黃酮的方法，經(jīng)過(guò)幾十年的發(fā)展，總的來(lái)說(shuō)包括這幾種：常溫、低溫、高溫和高壓提取法[20-23]。這些方法普遍存在一些弊端，如能耗高，工藝操作復(fù)雜，得率較低，設(shè)備要求高等。近年來(lái)，隨著超聲波技術(shù)的發(fā)展，開(kāi)始有學(xué)者將超聲波技術(shù)應(yīng)用到提取植物中總黃酮類(lèi)化合物中[24-32]。在提取植物有效成分時(shí)使用超聲波技術(shù)有幾大優(yōu)勢(shì)：一是提取得率明顯升高；二是提取速度快；三是可以做到對(duì)有效成分的無(wú)損提取[33]。應(yīng)用超聲波技術(shù)研究提取柿子葉中總黃酮，確定總黃酮的得率為考量的指標(biāo)，分別進(jìn)行單因素和正交試驗(yàn)，得到高效的柿子葉黃酮類(lèi)物質(zhì)的提取工藝，為柿子葉的深度開(kāi)發(fā)提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

柿子葉：河南省商業(yè)科學(xué)研究所有限責(zé)任公司林地；蘆?。ㄒ合酀舛取?8%）：北京索萊寶科技有限公司；無(wú)水乙醇（C2H5OH）、亞硝酸鈉（NaNO2）、九水合硝酸鋁（Al（NO3）3·9H2O）、苛性鈉（NaOH）均為分析純。

UV-8000ST雙光束紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：上海元析儀器有限公司；RE-2000A快速旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上?？粕齼x器有限公司；KQ-700DE型超聲波發(fā)生器：上海昆山儀器有限公司；QJ-08B粉碎機(jī)：上海兆申科技有限公司；DHG-9052A型臺(tái)式電熱干燥箱：上海捷呈實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；FA2004電子天平：上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司；AL204-ICF分析天平：梅特勒-托利多國(guó)際貿(mào)易有限公司；分樣篩：上虞市五四儀器廠。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 柿子葉預(yù)處理

柿子葉經(jīng)自然風(fēng)干后，在電熱干燥烘箱烘焙至干，其烘制程序設(shè)定溫度為50℃，時(shí)間為6 h；用粉碎機(jī)將烘干的樣品磨碎，然后過(guò)60目分樣篩并收集。

1.2.2 柿子葉總黃酮超聲波輔助提取工藝

試驗(yàn)對(duì)象為預(yù)處理后的柿子葉粉。稱(chēng)取設(shè)定質(zhì)量的柿子葉粉，加入到設(shè)定濃度和體積的溶劑中；然后，按照設(shè)定的超聲浸提時(shí)間、超聲浸提溫度和超聲浸提次數(shù)進(jìn)行提取。提取物經(jīng)過(guò)濾，少量溶劑潤(rùn)洗濾渣；所有濾液旋干，殘留物用60%乙醇（體積比）溶解，并定容至100 mL容量瓶中，為樣品待測(cè)儲(chǔ)備液。

1.2.3 柿子葉總黃酮含量的測(cè)定

1.2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

根據(jù)方法[24]測(cè)定蘆丁的標(biāo)準(zhǔn)曲線為：y=9.173 2x-0.006 1，R2=0.999 7。標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)圖1。

1.2.3.2 總黃酮含量的測(cè)定

為提高試驗(yàn)的精密性，統(tǒng)一設(shè)定預(yù)處理柿子葉粉的稱(chēng)取重量為2.00 g，樣品待測(cè)儲(chǔ)備液的移取量為4.00 mL，定容至50 mL，按照方法[24]中的操作步驟進(jìn)行測(cè)定。公式如下：

得率/%=（測(cè)定液中總黃酮的質(zhì)量/柿子葉粉樣品的質(zhì)量）×25×100

圖1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of rutin

計(jì)算不同試驗(yàn)組提取液的柿子葉提取物總黃酮含量。

1.3 柿子葉總黃酮超聲波輔助提取單因素試驗(yàn)

1.3.1 溶劑中乙醇濃度的影響

取超聲浸提溫度50℃，并保持恒溫狀態(tài)，料液比取1∶20（g/mL），超聲浸提時(shí)間取15 min，溶劑中乙醇濃度分別取 0、30%、50%、60%、70%、80%、95%，進(jìn)行提取試驗(yàn)。研究不同溶劑中乙醇濃度與提取物得率的相互變化關(guān)系與趨勢(shì)。

1.3.2 超聲浸提溫度的影響

溶劑中乙醇濃度恒定取60%，超聲浸提時(shí)間取15 min，料液比取 1 ∶20（g/mL），超聲浸提溫度分別取30、40、50、60、70 ℃，進(jìn)行提取試驗(yàn)。研究不同超聲浸提溫度與提取物得率的相互變化關(guān)系與趨勢(shì)。

1.3.3 超聲浸提時(shí)間的影響

溶劑中乙醇濃度恒定取60%，料液比取1∶20（g/mL），超聲浸提溫度取60℃，超聲浸提時(shí)間分別取10、25、40、55、70、85 min，進(jìn)行提取試驗(yàn)。研究不同超聲浸提時(shí)間與對(duì)提取物得率的相互變化關(guān)系與趨勢(shì)。

1.3.4 料液比

溶劑中乙醇濃度恒定取60%，超聲浸提時(shí)間取40 min，超聲浸提溫度取60℃，料液比分別取1∶10、1 ∶15、1 ∶20、1 ∶25、1 ∶30（g/mL），進(jìn)行提取試驗(yàn)。研究不同料液比與提取物得率的相互變化關(guān)系與趨勢(shì)。

1.3.5 超聲浸提次數(shù)的影響

溶劑中乙醇濃度恒定取60%，料液比取1∶25（g/mL），超聲浸提溫度取60℃，超聲浸提時(shí)間取40 min，超聲浸提次數(shù)分別取1、2、3、4分別進(jìn)行試驗(yàn)。研究不同超聲浸提次數(shù)與提取物得率的相互變化關(guān)系與趨勢(shì)。

1.4 柿子葉總黃酮超聲波輔助提取的正交試驗(yàn)

通過(guò)對(duì)單因素試驗(yàn)結(jié)果的分析，得知超聲浸提次數(shù)對(duì)提取物得率的影響較小。故選擇影響因素較大的溶劑中乙醇濃度、超聲浸提溫度、超聲浸提時(shí)間和料液比進(jìn)行正交試驗(yàn)。因素水平表見(jiàn)表1。

表1 正交試驗(yàn)因素水平Table 1 Factors and levels of orthogonal test

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 溶劑中乙醇濃度的影響

溶劑中乙醇濃度與柿子葉總黃酮提取得率的變化關(guān)系見(jiàn)圖2。

圖2 溶劑中乙醇濃度與柿子葉總黃酮提取得率的變化關(guān)系Fig.2 Effect of ethanol concentration on extraction rate of total flavonoids from persimmon leaves

由圖2可知：在設(shè)定的溶劑中乙醇濃度范圍內(nèi)，當(dāng)溶劑中乙醇濃度低于60%時(shí)，隨著溶劑中乙醇濃度的增加，得率先升高，在達(dá)到60%時(shí)開(kāi)始下降。這可能因?yàn)榇笥诖藵舛葧r(shí)，柿子葉中某些脂溶性物質(zhì)溶出增加，對(duì)得率造成影響[34]。故選取溶劑中乙醇濃度為55%～65%。

2.1.2 超聲浸提溫度的影響

超聲浸提溫度與柿子葉總黃酮提取得率的變化關(guān)系見(jiàn)圖3。

圖3 超聲浸提溫度與柿子葉總黃酮提取得率的變化關(guān)系Fig.3 Effect of extraction temperature on the yield of total flavonoids from persimmon leaves

由圖3可知，在設(shè)定的超聲浸提溫度范圍內(nèi)，得率以60℃為分界點(diǎn)表現(xiàn)出先升高后降低的趨勢(shì)。這是由于溫度繼續(xù)升高時(shí)，可溶性蛋白質(zhì)溶出變性，溶液黏度增大，影響細(xì)胞的破裂，抑制了黃酮類(lèi)物質(zhì)的溶出，降低了得率[34]。故選擇超聲浸提溫度58℃～62℃。

2.1.3 超聲浸提時(shí)間的影響

超聲浸提時(shí)間與柿子葉總黃酮提取得率的變化關(guān)系見(jiàn)圖4。

圖4 超聲浸提時(shí)間與柿子葉總黃酮提取得率的變化關(guān)系Fig.4 Effect of ultrasonic time on the yield of total flavonoids frompersimmon leaves

由圖4可知，按照設(shè)定的超聲浸提時(shí)間范圍，提取物得率迅速升高，在達(dá)到40 min以后出現(xiàn)輕微下降。這可能是在超聲波作用下，目的物的溶出在較短的時(shí)間內(nèi)就達(dá)到平衡了，而后隨著時(shí)間的增加，溶劑有逸失造成的[35]。故選擇超聲浸提時(shí)間40 min～55 min。

2.1.4 料液比的影響

料液比與柿子葉總黃酮提取得率的變化關(guān)系見(jiàn)圖5。

圖5 料液比與柿子葉總黃酮提取得率的變化關(guān)系Fig.5 Effect of solid-liquid ratio on the yield of total flavones from persimmon leaves

由圖5可知，在設(shè)定的料液比范圍內(nèi)，得率隨著溶劑量的增加而逐漸增大，在料液比1∶25（g/mL）時(shí)，再增加溶劑，得率反而趨于穩(wěn)定。增加溶劑，使得黃酮類(lèi)化合物分子傳質(zhì)到溶液中的總量在增多，在料液比達(dá)到1∶25（g/mL）以后黃酮類(lèi)的浸出趨于穩(wěn)定，繼續(xù)增加溶劑量只會(huì)增加雜質(zhì)的浸出。故選擇料液比為1 ∶22（g/mL）～1 ∶27（g/mL）。

2.1.5 超聲浸提次數(shù)的影響

超聲浸提次數(shù)與柿子葉總黃酮得率的變化關(guān)系見(jiàn)圖6。

圖6 超聲浸提次數(shù)與柿子葉總黃酮得率的變化關(guān)系Fig.6 Effect of extraction times on the yield of total flavonoids from persimmon leaves

根據(jù)圖6可得到結(jié)論：在超聲浸提次數(shù)2次時(shí)，得率迅速達(dá)到最大值并保持基本恒定，且提取次數(shù)取1和2時(shí)，得率相差較小。這說(shuō)明超聲波輔助提取的效率的確是較高的，同時(shí)一定程度上也說(shuō)明超聲提取次數(shù)對(duì)得率的影響因素相對(duì)較小。故選擇提取次數(shù)為2次。

2.2 柿子葉總黃酮提取的正交試驗(yàn)

據(jù)因素水平表，并按照試驗(yàn)中提取物的操作步驟進(jìn)行正交試驗(yàn)分析結(jié)果見(jiàn)表2，方差分析見(jiàn)表3。

表2 正交結(jié)果Table 2 Results of orthogonal test

表3 方差分析Table 3 Variance analysis of orthogonal test method

續(xù)表3 方差分析Continue table 3 Variance analysis of orthogonal test method

根據(jù)表2、表3的結(jié)果，可以判斷出：對(duì)柿子葉中提取物總黃酮得率影響，在各個(gè)因素條件中，溶劑中乙醇濃度具有較大顯著性；各因素條件的影響大小依次為：溶劑中乙醇濃度＞料液比＞超聲浸提溫度＞超聲浸提時(shí)間。說(shuō)明溶劑中乙醇濃度在超聲輔助提取柿子葉總黃酮的過(guò)程中起著首要作用。正交優(yōu)化后的最優(yōu)提取條件組合為A2B2C2D3，即溶劑中乙醇濃度取60%，超聲浸提溫度取60℃，超聲浸提時(shí)間取50 min，料液比取1∶27（g/mL）；為驗(yàn)證正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)的結(jié)果，在此最優(yōu)條件下，5次平行驗(yàn)證試驗(yàn)提取物總黃酮的得率平均值達(dá)到4.82%。

3 結(jié)論

首先設(shè)計(jì)單因素試驗(yàn)，研究了各個(gè)因素條件與提取物總黃酮得率的相互變化關(guān)系或趨勢(shì)；并在此基礎(chǔ)上，通過(guò)正交設(shè)計(jì)優(yōu)化試驗(yàn)得到最優(yōu)工藝。結(jié)果表明提取物總黃酮得率的影響因素的主次順序?yàn)椋喝軇┲幸掖紳舛龋玖弦罕龋境暯釡囟龋境暯釙r(shí)間；最優(yōu)工藝條件為：超聲浸提次數(shù)2次、超聲浸提時(shí)間50 min、超聲浸提溫度60℃、溶劑中的乙醇濃度60%、料液比1∶27（g/mL）；在此最優(yōu)組合條件下，測(cè)定提取物的得率為4.82%。