牛骨髓油脂肪酸組成與活性研究

帕爾哈提·柔孜，阿布力米提·伊力，木合布力·阿布力孜，馬爾霍夫·木合布力，克依沙爾·艾斯卡爾，趙超然，王成如

（1.中國科學院新疆理化技術(shù)研究所，新疆烏魯木齊830011；2.中國科學院大學，北京100049；3.新疆醫(yī)科大學藥學院，新疆烏魯木齊830011；4.新疆法拉丁生物科技有限責任公司研發(fā)中心，新疆烏魯木齊830011）

畜禽骨骼主要由骨膜、骨質(zhì)及骨髓等構(gòu)成。骨髓是骨之精華，又是造血基質(zhì)，含有蛋白質(zhì)、脂肪、礦物質(zhì)、骨膠原、軟骨素以及維生素等對人體有營養(yǎng)滋補和藥效功能的活性物質(zhì)，其具有添骨髓、增血液、減緩衰老、延年益壽等保健功效[1-3]。盡管骨髓中含有多種活性成分，并且這些活性成分具有各式各樣的功效，但由于技術(shù)及認識等方面的欠缺，經(jīng)常被浪費或加工成附加值很低的產(chǎn)品[4-5]。國內(nèi)科研單位和企業(yè)早已開展相關(guān)研究開發(fā)，但產(chǎn)品尚未得到大力推廣，副產(chǎn)物-骨髓資源仍然未能被充分利用。

骨髓在我國中醫(yī)藥和民族醫(yī)藥中具有較廣的使用范圍，中醫(yī)認為其味甘，性溫，具有補血益精、止渴、止血、止帶作用，主治精血虧損、虛勞贏瘦、消渴、吐衄、便血及崩漏帶下等[6]。牛骨髓在民族藥中被用于治療消腫止痛，舒筋健骨等復方制劑[7]。雖然國內(nèi)外學者對骨髓的蛋白與油脂進行了相關(guān)研究，但主要研究集中在疾病與骨髓移植等方面[8-9]，對藥效與功能性食品研發(fā)尚處于初步階段。

研究表明，骨骼中含有許多功能成分，其中生長素是人體所需營養(yǎng)保健的精華[10]，具有促進骨骼發(fā)育和骨傷愈合作用。利用這些特點，本研究團隊研發(fā)出法拉丁牌增高用牛骨髓復合食品（國家發(fā)明專利號：ZL201410118797.5，新疆醫(yī)科大學）并投入市場，該產(chǎn)品具有一定的提高免疫力和增高作用。骨髓中含有大量的油脂，一般含量達到90%～95%。骨髓脂肪具有治療骨頭壞死，促進糖皮質(zhì)激素治療作用，降低膽固醇含量，提高脂聯(lián)素免疫等功效。隨著對動植物脂肪酸活性的不斷開發(fā)研究[11]，脂肪酸的營養(yǎng)價值，以及對心腦血管和腫瘤等疾病的預防作用受到普遍關(guān)注。牛骨髓屬于藥食兼用食品，對其蛋白和油脂部分化學成分和生物活性尚未深入研究，作用機制和構(gòu)效關(guān)系不明，導致其資源的二次回收利用率低。因此，開展牛骨髓油脂類活性物質(zhì)基礎(chǔ)研究，對其質(zhì)量標準的建立，尤其是含牛骨髓健康類復合產(chǎn)品開發(fā)及骨髓資源綜合利用提供科學依據(jù)等方面具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

牛骨髓：烏魯木齊華凌市場牛羊肉市場D座（防疫鑒定），由新疆醫(yī)科大學藥學院木合布力·阿布力孜教授鑒定為新疆褐牛（Xinjiang Brown Cattle）的骨髓，經(jīng)去除骨頭碎片和洗去血跡后存于4℃冰箱備用。

石油醚、正己烷（分析純）：天津市百世化工有限公司；無水乙醇（分析純）：天津市匯杭化工科技有限公司；無水硫酸鈉（分析純）、無水甲醇（分析純）：天津市河東區(qū)紅巖試劑廠；硫酸亞鐵（分析純）：天津基準化學試劑有限公司；二甲基亞砜、水楊酸、H2O2、甲苯等均為國產(chǎn)分析純；白色念球菌（批號ATCC10231）、大腸桿菌（批號ATCC11229）：中國醫(yī)學細菌保藏管理中心；二苯基苦基苯肼（DPPH）：Sigma公司生產(chǎn)。

1.2 儀器與設(shè)備

Agilent 7890A氣質(zhì)聯(lián)用儀：美國安捷倫科技公司；RE252A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠；DHG-9123A電熱恒溫鼓風干燥箱：上海精宏實驗設(shè)備有限公司；DF-10IS集熱式恒溫加熱磁力攪拌器：鄭州長城工貿(mào)有限公司；DT200電子分析天平：常熟市衡器廠。

1.3 方法

1.3.1 樣品前處理

牛骨髓先用冷水或溫水清洗3次～5次，去除血跡與骨頭碎片。按骨液比1∶5（g/mL）加二次去離子水蒸煮（4 h）制備牛骨髓油，用4種溶劑（石油醚、正己烷、無水甲醇、無水乙醇）進行提取。

1.3.2 正己烷提取

稱取牛骨髓油50 g，加正己烷150 mL，置于索氏提取器中，80℃浸提8 h，經(jīng)減壓蒸餾除去正己烷，得到黃色澄清液體。

1.3.3 石油醚提取

稱取牛骨髓油 50 g，加石油醚（60-90）150 mL，置于索氏提取器中，80℃浸提8 h，經(jīng)減壓蒸餾除去石油醚，得到黃色澄清液體。

1.3.4 無水甲醇提取

稱取牛骨髓油5 g于圓底燒瓶（50 mL）中，加無水甲醇30 mL，置于集熱式恒溫加熱磁力攪拌器，75℃提取8 h，經(jīng)減壓蒸餾除去無水甲醇，得到黃色澄清液體。

1.3.5 無水乙醇提取

稱取牛骨髓油5 g于圓底燒瓶（50 mL）中，加無水乙醇30 mL，置于集熱式恒溫加熱磁力攪拌器，75℃提取8 h，經(jīng)減壓蒸餾除去無水乙醇，得到黃色澄清液體。

1.3.6 甲酯化

稱取4種提取溶劑所制備的油脂0.1 g，經(jīng)參考文獻甲酯化處理[12]后，取1 mL溶液，進行氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（GC-MS）分析。

1.3.7 氣相色譜條件

1.3.7.1 色譜條件

Superco石英彈性毛細管柱（100 m×0.25 mm，0.25 μm）；載氣為高純氦氣（99.999%），恒定流量為1.0 mL/min；進樣量為 1 μL，分流比為 50 ∶1；程序升溫：140℃保持5 min，以4℃/min升溫到200℃，保持1 min，以3℃/min升溫到220℃，保持26 min；進樣口溫度230℃。

1.3.7.2 液相色譜條件

EI源，電子能量70 eV，離子源溫度 230℃，全掃描方式，傳輸線溫度230℃，質(zhì)量掃描范圍40 u～500 u。在脂肪酸的分析中，根據(jù)GC-MS中各組分保留時間以及質(zhì)譜圖，采用峰面積歸一化法計算各脂肪酸的相對含量。

1.3.8 抗氧化活性比較

1.3.8.1 DPPH自由基清除能力[13]

取4種溶劑制備的油脂各1 mL于具塞試管中，用無水乙醇配成1 mg/mL樣品溶液，各加入1 mL配制好的0.2 mmol/L DPPH-無水乙醇溶液1 mL，搖勻，37℃恒溫箱恒溫30 min，以蒸餾水作為參比，用酶標儀517 nm處測定吸光度。用1 mL蒸餾水代替樣品溶液作為空白組，用1 mL甲醇代替DPPH-無水乙醇溶液作為對照組。樣品對DPPH自由基的清除率按公式1計算。

式1中：A0為空白組吸光度；Ai為樣品組吸光度；Aj為對照組吸光度。

1.3.8.2 羥自由基清除能力[13]

取4種溶劑制備的油脂各1 mL于具塞試管中，用無水乙醇配成1 mg/mL樣品溶液，各加入1 mL配制好的6 mmol/L FeSO4·7H2O溶液，1 mL水楊酸-乙醇溶液，混合均勻，之后加入1 mL過氧化氫溶液使反應啟動，37℃恒溫箱恒溫30 min，蒸餾水作為參比，510 nm處測定吸光度。用1 mL蒸餾水代替樣品溶液作為空白組，用1 mL水代替過氧化氫溶液作為對照組。樣品對羥自由基的清除率按公式2計算。

式2中：A0為空白組吸光度；Ai為樣品組吸光度；Aj為對照組吸光度。

1.3.9 抗菌活性比較

用兩種試菌白色念球菌，大腸桿菌，利用孔穴法檢測其抗菌活性。取各油脂樣品20 mg，用二甲基亞砜溶解，將已滅菌的濾紙片浸泡在4種溶劑所制備的油脂二甲基亞砜溶液中，至過飽和后取出晾干，用無菌鑷子貼在涂有不同供試菌50 μL的培養(yǎng)基上，細菌37℃條件下培養(yǎng)24 h，記錄抑菌圈直徑的大小，取平均值[14]。每板貼4片，重復3組，以氨芐為陽性對照，以無待測樣的二甲基亞砜試液作為空白，抑菌圈直徑≤7 mm時認為樣品無抑菌活性。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同提取溶劑脂肪酸含量

4種提取溶劑所含的脂肪酸組成及含量見表1。

表1 4種提取溶劑脂肪酸組成及含量Table 1 Fatty acids composition and contents of four kinds of extract solvents

續(xù)表1 4種提取溶劑脂肪酸組成及含量Continue table 1 Fatty acids composition and contents of four kinds of extract solvents

由表1可知，4種溶劑提取的脂肪酸中不飽和脂肪酸含量均高于飽和脂肪酸，其中石油醚和正己烷、無水甲醇和無水乙醇提取方法所制備的各類脂肪酸組分和含量較接近，但也有一定差別。

4種溶劑提取的油脂中飽和脂肪酸含量均40%以上，甲醇提取部位含量最高（45.56%）；主要以肉豆蔻酸（C14：0）、棕櫚酸（C16：0）、軟脂酸（C17：0）及硬脂酸（C18：0）為主，其中棕櫚酸含量最高，其次是硬脂酸為主。單不飽和脂肪酸總含量均在50%以上，含量最高的是石油醚部位（54.64%）；主要以肉豆蔻腦酸（C14：1），（Z）-十六烯酸（C16：1），順-10-十七碳一烯酸（C17：1），油酸（C18：1）為主，其中油酸（C18：1）含量最高。多不飽和脂肪酸含量均 2%以上，主要以亞油酸（C18：2）為主，正己烷部位含量最高（3.9%），比甲醇部位多1.89倍；甲醇提取部位中高級不飽和脂肪酸種類較多。從飽和與不飽和比例來看，排序為：正己烷＞石油醚＞無水乙醇＞無水甲醇。其中正己烷提取部位不飽和脂肪酸含量較高，故選用正己烷較好。

從飽和脂肪酸成分來分析，牛骨髓硬脂酸含量（13.41%～16.49%），棕櫚酸含量（22%～24%），與人乳和常見動物乳等含量相當[15]。膳食中的棕櫚酸和油酸可代替月桂酸和肉豆蔻酸[16]，能夠治療血栓，由此可見，棕櫚酸也是有益成分之一。硬脂酸能夠減少腸道對膽固醇的吸收，降低血清和肝臟中的膽固醇含量，同時可能會對膽酸的生成有調(diào)節(jié)作用。此外，骨髓油硬脂酸含量也相當高，也是一種功能成分。

2.2 牛骨髓油4種溶劑主要脂肪酸總離子圖譜

圖1主要對4種溶劑所提取的脂肪酸組分相對含量高于1%的峰進行收集比較。以出峰時間為參比，每一個提取物選取了10個主要的峰，出峰時間在14 min～24 min之間，其中無水甲醇提取物分離時間較長，出峰時間在13 min～30 min之間，含量較高的脂肪酸均在19 mim～24 min之間出峰。

2.3 牛骨髓4種溶劑主要脂肪酸含量

每個提取部位脂肪酸中選取含量相對較高的10種脂肪酸進行對比分析，其出峰時間、脂肪酸含量及定性結(jié)果見表2。

圖1 4種溶劑提取部位甲酯總離子流圖Fig.1 Total ionchromatograms of four kinds of extract solvents

表2 4種溶劑提取部位主要脂肪酸組成及相對含量Table 2 Main fatty acid composition and contents of extracts from four kinds of extract solvents

表1、表2和圖1中的各組分定性結(jié)果由人工檢索質(zhì)譜標準圖（Famedb23.L，NIST14.L）和人工解釋所確定。石油醚、正己烷、無水甲醇、無水乙醇物中總共分離出23、37、41、27個組分，每個提取溶劑脂肪酸主峰中選用含量較高10種脂肪酸進行對比分析。石油醚提取中峰數(shù)目較少，但與正己烷提取相比，主要成分的出峰時間和含量大致相同。其中飽和脂肪酸占41.48%，不飽和脂肪酸占58.52%，且油酸在21.185 min時出峰，含量26.96%，不飽和脂肪酸（UFA）在21 min后出峰。正己烷提取中飽和脂肪酸占41.71%，不飽和脂肪酸占58.29%。其中油酸在22.405 min時出峰，含量達到25.24%。UFA在20 min后出峰，主要以油酸等為主。無水甲醇提取中組分較多，飽和脂肪酸占45.56%，不飽和脂肪酸占54.70%。其中油酸在22.710 min出峰，含量達到44.51%。UFA在25 min后出峰，主要以ω-6和ω-9為主。與其它提取物相比，該部位出現(xiàn)了二十碳五烯酸（EPA），α-亞麻酸等UFA成分。無水乙醇提取中飽和脂肪酸占44.45%，不飽和脂肪酸占55.75%。油酸在21.174 min時出峰，含量達到28.91%，UFA在21 min后出峰。比較四種溶劑提取物的出峰時間發(fā)現(xiàn)其飽和與不飽和脂肪酸交叉出峰；不飽和脂肪酸總含量大于飽和脂肪酸，但其數(shù)量和種類差別不大，牛骨髓油UFA均在20 min后出峰，這可能是骨髓油脂肪酸分離的特異性之一。經(jīng)綜合分析，考察相對含量和出峰時間等因素，選用正己烷作為提取溶劑較為理想。

2.4 抗氧化活性比較

4種不同溶劑所提取的油脂用無水乙醇溶解，配制1 mg/mL的樣品溶液，測定其抗氧化能力，兩種自由基的清除能力如圖2。

圖2 4種溶劑提取的脂肪酸DPPH·與·OH清除能力Fig.2 DPPH·and·OH radical scavenging activity of oils from four kinds of extract solvents

由圖2可知，4種溶劑提取所得的牛骨髓油脂對DPPH·與·OH均有清除作用，清除率均在25%以上。無水甲醇部位的清除能力最高，清除率分別為50.56%和44.46%，這可能與無水甲醇制備中出現(xiàn)EPA和α-亞麻酸等有關(guān)，雖然含量極小，但這些高級多不飽和脂肪酸及其代謝產(chǎn)物具有激活免疫細胞活性、抗炎、等作用，而且（UFA）因自身分子結(jié)構(gòu)特點，具有較強的抗氧化活性[17]。與其他3種骨髓油不同的是正己烷提取的骨髓油對·OH自由基清除能力高于DPPH·。無水甲醇提取物的抗氧化作用明顯強于其他溶劑提取部位，但甲醇毒性較大，不適合用作食品類產(chǎn)品的提取溶劑，故建議不使用。4種不同溶劑提取部位對DPPH·和·OH的清除能力與VC相比，清除自由基作用較低，這可能由于油脂樣品對自由基的清除能效具有一定的選擇性，所以可另加多種抗氧化指標來進一步綜合評價。

2.5 抗菌作用比較

4種不同溶劑所提取的油脂用二甲基亞砜溶解，配制20 mg/mL的樣品溶液，測定其抗菌能力，兩種試菌的抑制能力見表3。

表3 4種不同溶劑提取脂肪酸的抗菌效果Table 3 Antimicrobial activity of oils from four kinds of extract solvents

由表3可知，4種溶劑提取的油脂對兩種供試菌的生長均有抑菌作用，這可能與牛骨髓中游離脂肪酸對病原微生物（包括包膜病毒、衣原體和細菌）的抑制作用相關(guān)。隨著脂肪酸鏈長增加抗菌活性增強，C8-C12酸的三、六和十縮甘油酯一般有抗菌括性，其中以癸酸和月桂酸多縮甘油脂的活性最強[18]。在不飽和脂肪酸中，棕櫚油酸抗菌活性最強[19]；當分子中增加第二個雙鍵時（亞油酸）抗菌活性增強，在順、反異構(gòu)體中，順式脂肪酸有明顯的抗菌活性。4種溶劑提取的脂肪酸中棕櫚酸含量均在15%以上，且組分中順式脂肪酸含量較高，足以證明骨髓脂肪酸有抗菌活性。其中，無水甲醇提取物對兩種試菌的抑制作用均強于其它3種，但在分析各提取溶劑所含成分及其可能對抗菌影響的同時，不能忽視有機溶劑殘留對細菌的抑制作用，甲醇作為高極性溶劑，抑菌性能也隨之較高，但對人體的神經(jīng)系統(tǒng)和血液系統(tǒng)影響最大，它經(jīng)消化道、呼吸道或皮膚攝入均會產(chǎn)生毒性反應，甲醇蒸氣能損害人的呼吸道粘膜和視力，故不選用。

對抗菌和抗氧化活性綜合比較可知，甲醇處于優(yōu)勢位置，但對其殘留的控制以及使用后對人和動物存在的健康隱患進行考慮，選用正己烷作為牛骨髓油提取溶劑較為適宜。

3 討論與結(jié)論

骨油在食品加工行業(yè)用途頗廣，因動物油脂均有特有的香味，是其它植物油不能代替的品種。大量用于油炸方便面、糕點起酥、速凍食品風味香精等，還可以直接加工硬脂酸、油酸、肥皂、香皂、潤滑劑、日用化妝品、蠟紙和甘油提取等[20]。骨油中含有的不飽和脂肪酸有利于膽固醇的代謝與分布，能夠減少動脈硬化、防止心血管疾病，可防止肥胖，是一種新型的保健油脂[21]。從飽和度來看，牛骨髓油脂肪酸與人乳和常見動物乳等含量相當[15]。前期，豬骨油精煉和油微膠囊化包埋技術(shù)[21-22]，牦牛[23]，羊骨[24]與雞骨油[25]等成分研究也取得了相關(guān)進展。但這些方法未將骨髓和骨頭分開提取，與骨髓油提取率（90%～95%）相比，其提取率較低[21]，導致對資源的高附加值利用程度較低。加之，動物骨油常溫下呈固態(tài)，將其直接用作醫(yī)藥原料、食品配料等帶來一定的困難。若對其進行不飽和脂肪酸的富集，高效包埋能避免氧化劣變，掩蓋特殊異味，應用范圍也能得到拓展。

研究發(fā)現(xiàn)，動物骨油SFA主要以棕櫚酸，硬脂酸為主；UFA主要以油酸，亞油酸為主；兩者比例接近于1∶1，與國際膳食營養(yǎng)素參考攝入量比例一致[21，26]。牛骨髓脂肪酸成分和含量與上述報道基本相似，其中UFA含量53%～58%，SFA含量41%～45%，棕櫚酸為22%～24%，硬脂酸為13%～16%，油酸為45%～49%，亞油酸為1.9%～3%。這些數(shù)據(jù)進一步表明骨髓營養(yǎng)價值遠遠高于骨頭，可作為營養(yǎng)素應用。亞油酸的改善免疫功能和促進生長作用較強[27]，一般組織的生長依次為骨骼、皮、肌肉和脂肪，某種程度上骨髓UFA對骨細胞和脂肪細胞分化增殖方面也有一定的功效。一般牛骨做成骨湯、膠原蛋白、肽及油等，用來治療關(guān)節(jié)炎、預防骨質(zhì)疏松、NK細胞活化及提高機體免疫功能等[28-31]，可推測牛骨骼藥用開發(fā)利用前景廣闊。骨蛋白抗氧化活性研究報道顯示其清除DPPH·能力為14.95%～33.18%[32]，本試驗提取的牛骨髓油清除DPPH自由基能力30.45%～50.56%，比較可知，骨髓油抗氧化能力強于骨蛋白。動物油抗菌活性方面，鴕鳥油[33]對金黃色葡萄球菌無抑制活性而對白色念球菌和青霉菌有較好的抗性。另外，馬油[34]對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、青霉菌、黑曲霉、變形桿菌、酵母菌的抑菌作用不顯著，但對白色念珠菌的抑菌作用顯著。本試驗所提取的骨髓油對金黃色葡萄球菌均無抑制作用，對白色念球菌和大腸桿菌具有抑制活性，這可能是不同動物油的抗菌活性成分組成差異，飽和與不飽和脂肪酸含量比例關(guān)系等不同所致，但還需要多種抗菌試驗加以驗證。今后針對牛骨髓脂肪酸活性物質(zhì)鑒定和保健食品開發(fā)，必須要增加活性評價指標，才能發(fā)現(xiàn)關(guān)于牛骨髓的新生物活性，從而提高應用價值。

綜上所述，牛骨髓飽和與不飽和脂肪酸比例較合理，且其中含有的不飽和脂肪酸有利于膽固醇的代謝與分布、減少動脈硬化、防止心血管疾病、改善免疫功能和促進骨骼生長等方面具有潛在的開發(fā)應用效益。四種溶劑（石油醚、正己烷、無水乙醇、無水甲醇）提取的牛骨髓油 SFA/UFA比例分別為 1/1.4，1/1.41，1/1.20，1/1.25，其中正己烷提取物不飽和脂肪酸含量最高，達58.42%。對抗菌和抗氧化活性綜合比較發(fā)現(xiàn)，正己烷作為提取溶劑較為理想。這對含牛骨髓類功能食品與藥品研發(fā)及其質(zhì)量標準的建立提供參考依據(jù)。