肢體遠隔缺血適應對急性ST段抬高型心肌梗死直接經皮冠狀動脈介入治療患者循環(huán)血微小核糖核酸-208b水平及術后心功能影響

劉燦章，謝蓮娜，郎明非，曾凱東，蔣夢，王麗君，解澤宙，魏顯敬，王凱君

肢體遠隔缺血適應（RIC）指對肢體實施短暫反復的缺血適應，減輕再灌注對心肌帶來的損傷，從而減少心肌梗死面積，改善患者臨床遠期預后[1，2]。miR-208b是一種小分子microRNA，在組織出現微小損傷時可快速釋放入血，并在心肌組織中特異性高表達[3，4]。在急性心肌梗死時升高，可作為早期心肌損傷的標記物[5]。動物實驗提出心肌缺血再灌注損傷后miR-208b表達水平升高[6]，在急性心肌梗死患者中缺血適應可以調節(jié)microRNA的表達水平[7，8]，但急性ST段抬高型心肌梗死（STEMI）患者中RIC對微小核糖核酸-208b（miR-208b）表達量變化的影響少見報道。本課題將觀察肢體RIC對STEMI直接經皮冠狀動脈介入治療（PCI）患者外周血miR-208b水平的影響。

1 資料與方法

對象及分組：入選2016-01至2017-07在大連大學附屬中山醫(yī)院循環(huán)四科連續(xù)入院接受PCI術的STEMI患者。STEMI診斷標準：缺血性胸痛持續(xù)30 min以上，休息或含服硝酸甘油后癥狀不能緩解；心電圖相鄰2個導聯ST段抬高大于0.1 mV（V2～3導聯ST段抬高大于0.2 mV）；心肌壞死標記物[肌鈣蛋白或肌酸激酶同工酶（CK-MB）大于正常范圍2倍以上]。入選標準：（1）符合STEMI診斷標準的患者；（2）18歲＜年齡＜80歲；（3）冠狀動脈造影示梗死相關血管（IRA）為閉塞性病變，IRA遠端無側支循環(huán)；（4）持續(xù)性胸痛開始至IRA血流再灌注≤12 h；（5）同意參與本試驗人群。排除標準：（1）既往明確的陳舊性心肌梗死；（2）已知嚴重的外周動脈疾?。唬?）惡性腫瘤；（4）合并腎臟疾病并導致嚴重腎功能不全（血清肌酐 ＞353 μmol/L）；（5） 并發(fā)心臟驟停、心原性休克；（6）罪犯血管未成功開通者；（7）術后退出本研究患者。本研究獲得大連大學附屬中山醫(yī)院倫理委員會批準，研究對象均簽署知情同意書。分組：患者根據不同梗死部位按入院順序2:1比例分為肢體RIC組50例（前壁20例、非前壁30例）及對照組25例（前壁10例、非前壁15例）。肢體RIC組行直接PCI術聯合肢體RIC操作，對照組將袖帶綁好后不進行加壓操作，僅進行直接PCI術。

直接PCI：患者到達醫(yī)院急診科完成12/18導聯心電圖，明確STEMI診斷后，立即給予雙聯抗血小板及阿托伐他汀口服，并直接送入導管室，行冠狀動脈造影檢查，明確梗死相關血管后，即刻行介入治療開通梗死相關血管。介入治療術中的具體操作包括是否進行血栓抽吸、球囊及支架大小等由術者決定。成功PCI標準:殘余狹窄≤30%，心肌梗死溶栓治療臨床試驗（TIMI）2～3級血流且無急性并發(fā)癥。術后應用藥物依據患者病情及相關指南推薦應用。

肢體RIC操作方法：肢體RIC組進入導管室躺在手術床上后與直接PCI術同時開始，即刻于右下肢距膝關節(jié)上方3～5 cm處綁縛無創(chuàng)血壓袖帶，立即開始時充氣加壓至 200 mmHg（ 1 mmHg =0.133 kPa）以阻斷下肢血流，以足背動脈搏動消失為準。充氣5 min，放氣5 min，循環(huán)至血管開通。如血管開通時未完成3次循環(huán)，則繼續(xù)完成3次循環(huán)。以上操作與PCI術同時進行。

心肌梗死面積：術前、術后 6 h、12 h、18 h、24 h、48 h、72 h采靜脈血2 ml，送大連大學附屬中山醫(yī)院檢驗科采用西門子advia1200全自動生化分析儀運用化學發(fā)光法測定血漿CK-MB水平。應用 Origin Pro 8 軟件繪制心肌酶-時間曲線并計算曲線下面積（AUC），評估心肌梗死面積[5]。

住院期間心功能：于PCI術后3天內心臟超聲科對所有患者進行超聲檢查，應用改良Simpson's法測左心室射血分數（LVEF）。

血清miR-208b檢測：（1）血標本采集及保管：術前、術后即刻、術后24 h、術后48 h各4 ml血液標本，用Z Serum Clot Activator 血清分離膠管收集，采集后即刻離心，離心機設置為3500轉，10 min。離心后取上層血清移至200 μl EP管中做好標記 -80℃保存，用以miR-208b的批量檢測。（2）血清總RNA的提?。喝?50 μl血清并與750 μl 總RNA提取試劑（Trizol LS，美國）充分混勻，室溫孵育10 min，加入 5 nmol線蟲 microRNA（cel-miR-39-3p）5 μl作為外參，再用氯仿抽提，血清總RNA位于所生成的最上層上清液中 ，最后經異丙醇沉淀、離心后，將所得的總RNA溶于20 μl焦碳酸二乙酯處理（DEPC）水中，立即使用或存放于-80℃。（3）血清總RNA的反轉錄：采用PrimeScript RT試劑盒（寶生物，大連）在聚合酶鏈反應（PCR）儀（北京東勝創(chuàng)新，北京）上進行反轉錄，反應條件：42℃，15 min；85℃，5 s，cel-miR-39-3p及hsa-miR-208b-3p的反轉錄引物購自廣州銳博生物科技有限公司，反轉錄反應生成的cDNA于-20℃保存?zhèn)溆?。?）血清miR-208b的相對表達量的檢測：用CFX-Connect實時熒光定量PCR儀（Bio-Rad，美國），按照SYBR?Premix Ex TaqTMII qPCR試劑盒（寶生物）方法檢測miR-280b的表達。反應條件：95℃ 30 s；95℃ 5 s，60℃ 30 s，40個循環(huán)。所有RT-qPCR引物購自廣州銳博。用2-ΔΔCt方法計算血清miR-208b的相對表達量，使用均數±標準差（）表示。

統(tǒng)計學方法：數據采用IBM SPSS.19.0軟件進行相關數據統(tǒng)計分析。數據都應檢驗是否符合正態(tài)性分布及方差齊性檢驗分析。其中計量資料均采用來表示，組間比較通過獨立樣本t檢驗，組內4個時間點比較通過單因素方差析驗；計數資料采用率的百分比來表示，結果以雙側P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

一般資料：兩組患者基線臨床資料比較差異無統(tǒng)計學意義（表1）。

兩組患者CK-MB比較及住院期間心功能評估（表2，圖1）: 住院期間肢體RIC組CK-MB AUC及CK-MB Peak均低于對照組（P＜0.05），LVEF高于對照組（P＜0.01），差異均有統(tǒng)計學意義。肢體RIC組NT-proBNP較對照組有降低趨勢，但差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

表2 兩組患者CK-MB比較及住院期間心功能評估[例(%)]

圖1 CK-MB釋放平均濃度曲線下面積比較

兩組患者血清miR-208b表達量比較（表3）:對照組直接PCI術后即刻較術前升高（P=0.032），術后24 h明顯下降（與術前比較P=0.015，與術后即刻比較P=0.018），術后48小時進一步下降（與術前比較P=0.017，與術后即刻比較P=0.013，與術后24 h比較P=0.526）。肢體RIC組術后即刻較術前降低（P=0.028），術后24 h明顯下降（與術前比較P=0.014，與術后即刻比較P=0.015），術后48 h進一步下降（與術前比較P=0.017，與術后即刻比較P=0.015，與術后24 h比較P=0.678）。

兩組患者之間循環(huán)miR-208b表達量比較（表3）：術后即刻肢體RIC組低于對照組（P=0.021），差異有統(tǒng)計學意義；術前（P=0.874）、術后24 h（P=0.637）及術后48 h（P=0.874），兩組間差異無統(tǒng)計學意義。

表3 兩組miR-208b表達量比較（）

表3 兩組miR-208b表達量比較（）

注：RIC：遠隔缺血適應。與術前比較*P＜0.05； 與術后即刻比較ΔP＜0.05；與對照組比較▲P＜0.05

組別 術前 術后即刻 術后24 h 術后48 h對照組 77.8±9.4 84.1±9.0* 29.9±12.1*Δ 16.8±8.6*Δ肢體 RIC 組 77.4±8.8 71.0±9.3*▲ 28.6±19.2*Δ 17.1±11.3*Δ

肢體RIC組術后血清miR-208b與CK-MB AUC相關性分析（圖2）:Pearson相關性分析顯示，肢體RIC組患者術后血清miR-208b的表達水平與CK-MB AUC 呈明顯正相關（r=0.498，P＜0.001）。

圖2 肢體RIC組術后血清miR-208b與CK-MB AUC相關性分析

3 討論

肢體RIC通過對遠隔靶器官的遠端組織實施短暫反復的缺血適應，從而對靶器官的再灌注損傷產生保護作用。由于其操作簡便、安全無創(chuàng)等優(yōu)點，避免了對罪犯血管的過度干預。Murry等[9]在動物實驗中發(fā)現RIC可以降低心肌再灌注40 min時的心肌梗死面積，國內外臨床研究表明RIC可以減少急性心肌梗死患者心肌梗死面積及臨床遠期預后[10，11]，本研究同樣得出肢體RIC組酶學心肌梗死面積及平均濃度酶峰低于對照組，進一步證實肢體RIC具有保護心肌的作用。

miR-208b是一種心肌特異性表達因子，分子量小在組織出現微小損傷時可快速釋放入血，國內外研究提出急性心肌梗死時表達量升高，顯示其在急性心肌梗死患者血漿中增加了1 600倍，健康人則無表達[3，4，12]。本研究通過對患者術前血液標本的檢測發(fā)現，miR-208b有較高的表達水平，這與既往研究結果一致，在心肌損傷早期釋放入血，可作為診斷心肌損傷的標記物。在Bian及Andersson動物實驗提出心肌缺血再灌注損傷后miR-208b表達水平較再灌注前升高[13]，國內研究發(fā)現STEMI患者再灌注后miR-19a/b表達量變化[14]，但關于miR-208b的臨床實驗尚少見報道，本試驗通過對照組術前、術后的血液分析，發(fā)現急性STEMI患者再灌注后miR-208b表達水平較再灌注前升高，這與動物實驗結果相符。提示心肌再灌注后帶來的額外心肌細胞損傷，使miR-208b快速釋放入血。Cortezdias等[7]及Zhu等[8]發(fā)現RIC可以調節(jié)急性心肌梗死患者中microRNA的表達水平，在離體小鼠模型中發(fā)現RIC同樣可調劑多種microRNA的表達，但在動物實驗及臨床實驗中RIC對miR-208b的調節(jié)少見報道[15-18]，本試驗通過急性STMEI患者肢體RIC操作，得出肢體RIC組患者術后較術前表達量降低，可以調劑miR-208b的表達量。兩組術前術后表達量變化分析，術前表達量相似，對比術后發(fā)現對照組患者表達量升高，肢體RIC組表達量降低，并且低于術前水平。

國內外多項研究證實分別對100例、696例、258例STEMI患者實施短暫的肢體RIC可以減少心肌梗死面積[19-22]。本研究結果提示肢體RIC組患者梗死面積減小，并且峰值降低，這與既往研究相符，提示肢體RIC可以保護心肌細胞。但國內相關實驗對46例STEMI患者行肢體RIC，提出酶學梗死面積無明顯減少[23]?？紤]與納入實驗患者數量少，并未采用影像學評估梗死面積低估了肢體RIC的保護作用的局限性有關。國內研究[22]發(fā)現肢體RIC可以提高術后LVEF，改善心功能。本研究通過術后心臟超聲評估提出相同結論，肢體RIC組術后LVEF提高，NT-proBNP有降低趨勢。通過對肢體RIC術后血清miR-208b與CK-MB AUC 相關性分析發(fā)現其存在明顯的正相關。肢體RIC組酶學梗死面積減少，術后即刻血清miR-208b表達量降低，提示我們miR-208b不僅能作為心肌損傷的標記物，并可通過其表達量來推斷心肌梗死面積的大小。

不足之處：本研究是單中心小型臨床試驗，而且僅觀察了肢體RIC對成功直接PCI的STEMI患者血清miR-208b水平的影響，有關肢體RIC所致血清miR-208b水平變化的臨床意義尚需更大規(guī)模的臨床研究進一步探討。

本研究提示肢體RIC降低STEMI直接PCI術患者循環(huán)血miR-208b水平，并可以改善患者心功能。