“探究pH對酶活性影響”實驗的拓展

王永梅 張 鋒

(1 福建省漳州市第一中學 漳州 363000； 2 福建省普通教育教學研究室 福州 350003)

1 引言

“探究影響酶活性的因素”是人教版高中生物學必修1第5章第1節(jié)第2課時的內(nèi)容。該實驗一方面可加深學生對酶作用和酶本質(zhì)的深入理解，同時也為光合作用和呼吸作用的學習做知識和實驗探究的鋪墊。在完成教材實驗后，學生提出一些在探究實驗中產(chǎn)生的疑問： 如何使肝臟研磨液中的酶活性保持更久？在中學現(xiàn)有條件下，有沒有較為簡便的方法能達到多設(shè)幾個pH梯度的目的？是否有其他快速簡便檢測影響酶活性因素的方法？圍繞這些問題，教師引導學生進行進一步的探索。將高中生物學拓展實驗中固定化酶技術(shù)、逐級稀釋法等應用于該實驗，并在此基礎(chǔ)上應用尿糖試紙進行pH對酶活性影響的實驗探究。

2 實驗原理與方法

2.1 肝臟過氧化氫酶固定 固定化酶技術(shù)是通過化學或物理的處理方法，使原來水溶性的酶與固定態(tài)的水不溶載體相結(jié)合或被載體包埋。傳統(tǒng)的固定化酶技術(shù)可分為吸附法、共價鍵結(jié)合法、交聯(lián)法、包埋法。本實驗運用吸附法固定肝臟過氧化氫酶。將干凈、干燥的濾紙片放入潔凈托盤，倒入新鮮肝臟研磨液，靜置一段時間后取出濾紙晾干，剪成4cm×4cm大小備用。

2.2 逐級稀釋法配置HCl和NaOH溶液 實驗需要配置不同pH的酸堿溶液。該過程操作繁瑣。借用化學試劑配制的逐級稀釋法可極大簡化操作。分別以100mL的5%HCl和10%NaOH為母液；取10mL母液，加入90mL蒸餾水，配制成稀釋10倍的B試液；再取10mL B試液稀釋到100mL，配制成稀釋100倍的C試液(由于未配置pH計，采用pH試紙進行測定，結(jié)果顯示試液pH呈現(xiàn)明顯的梯度變化)。

2.3 市售尿糖試紙 尿糖試紙是采用固定化酶技術(shù)制成的商品化產(chǎn)品，用來檢查尿糖患者尿糖情況的專用試紙。根據(jù)葡萄糖在葡萄糖氧化酶的催化作用下形成葡萄糖酸和過氧化氫，H2O2在過氧化氫酶的催化作用下形成水和原子氧，以及原子氧可以將某種無色的化合物氧化成有色的化合物的原理，將上述兩種酶和無色化合物固定在紙條上，制成測試尿糖含量的酶試紙。商品化的尿糖試紙購買方便，均一性強，批次間差異小，可用于替代含新鮮肝臟研磨液的濾紙片。

3 結(jié)果與分析

3.1 固定化酶技術(shù)在探究pH對過氧化氫酶活性影響實驗中的應用 先將等面積的含酶濾紙片分別放入相應梯度pH試液及蒸餾水中處理相同時間(5min)，夾出轉(zhuǎn)移至對應的潔凈培養(yǎng)皿中，往上面滴加等量3% H2O2溶液，1min后觀察產(chǎn)生氣泡的量并記錄。

表1 梯度pH條件下的過氧化氫酶活性檢測

(注： -代表沒氣泡，+表述產(chǎn)生氣泡的量)

結(jié)果顯示(表1)，5%HCl處理組沒有氣泡產(chǎn)生(記為“-”)；蒸餾水處理組有大量氣泡產(chǎn)生(記為“++++”)；10%NaOH處理組有少量氣泡產(chǎn)生(記為“+”)。由此可見酸或堿會極大影響過氧化氫酶的活性，酸對過氧化氫酶的影響大于堿。

取室溫保存2d和7d的含酶濾紙片做酶活性的對比實驗，發(fā)現(xiàn)兩者都產(chǎn)生大量氣泡，說明含酶濾紙片室溫(福建9月的平均氣溫在37℃以上)保存一周仍具有較高活性。

3.2 逐級稀釋法配置不同pH梯度的HCl和NaOH溶液 運用逐級稀釋法對質(zhì)量分數(shù)為0.1g/mL的NaOH和體積分數(shù)為5%的HCl進行10倍倍比稀釋，用pH試紙進行測定，與標準比色圖譜比較，記錄結(jié)果(表2)。

表2 逐級稀釋法配置不同pH梯度溶液的可行性研究

通過逐級稀釋，溶液pH確實呈現(xiàn)梯度變化，借助此方法可輕松準確配置一系列pH梯度的溶液，解決配液難的問題。

3.3 尿糖試紙檢測pH對過氧化氫酶活性影響實驗 尿糖試紙上吸附有過氧化氫酶。未使用的尿糖試紙是淡藍色的。10個小燒杯中，各加入1mL 3% H2O2溶液，按照表3加入對應滴數(shù)的5% HCl和5% NaOH，搖勻后將尿糖試紙放入，30s后取出，與瓶簽上的標準比色圖譜比較，記錄結(jié)果(表3)。

表3 尿糖試紙?zhí)娲笧V紙片的初步研究

(注：“+”越多，棕色越深，說明酶活性越高；“-”代表沒反應，說明酶活性喪失)

若反應體系中有氧氣產(chǎn)生，則試紙轉(zhuǎn)變?yōu)樽厣?，棕色越深，代表氧氣產(chǎn)生量越大，過氧化氫酶的酶活性越高。試紙顯色結(jié)果明顯顯示出加入不同滴數(shù)的酸溶液或堿溶液對過氧化氫酶活性的影響。加入3滴5% HCl后基本沒有反應，酶活性變化很大。5% NaOH溶液對酶活影響較酸小很多，但也能明顯影響酶活性。這與含酶濾紙片進行的實驗結(jié)果相吻合，說明尿糖試紙的替代性使用是可行的。

4 討論

含酶濾紙片制備簡單方便、快捷、均一性良好，保存簡單。用于教材實驗效果顯著，免去溶液混合的步驟，保證實驗在預設(shè)pH下進行，有效控制單一變量。整個實驗在濾紙片上進行，避免手部直接接觸強酸強堿，安全性高。保存7d的濾紙片一開始產(chǎn)生氣泡的速度較慢，但不影響整體實驗結(jié)果的判斷，可以較好滿足班級多、實驗周期長的需求。

商品化的尿糖試紙購買方便，價格實惠，均一性強，批次間差異小，可用于替代含新鮮肝臟研磨液的濾紙片，省去購買肝臟、制備研磨液、制備含新鮮肝臟研磨液的濾紙片等步驟，買來即可使用，2～3min出結(jié)果，簡化操作。尿糖試紙的使用，將原實驗氣泡的觀察，轉(zhuǎn)變?yōu)楸壬?，更加直觀。由于反應體系小，通過優(yōu)化操作，讓實驗更加科學。通過實驗，筆者發(fā)現(xiàn)過氧化氫酶的活性較容易受到酸性條件的影響，而在堿性條件下能保持較高活性，推測過氧化氫酶的最適pH偏堿。

在此基礎(chǔ)上，引導學生利用已經(jīng)梯度稀釋的酸堿和H2O2溶液進行不同pH條件下酶活性的探究，小組內(nèi)成員合作，短時間內(nèi)完成多個梯度pH下酶活性的探究。不同小組間平行重復實驗，幾分鐘內(nèi)便可得到大批準確的實驗結(jié)果，極大提高了課堂效率。學生通過操作體驗學習到課本以外的科學方法，豐富了知識，提高了實驗技能。