血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子基因多變與骨肉瘤發(fā)生的可能性研究

張洪飛 閆加鵬 韓桂全

【摘 要】目的：探索VEGF-2578C/A，936C/T和-460T / C基因多態(tài)性在骨肉瘤發(fā)展過(guò)程中的表達(dá)水平，從而研究二者可能存在的先關(guān)性。方法：將我院自2014年1月至2017年01月的90例骨肉瘤患者和90例健康對(duì)照組成員納入本研究進(jìn)行基因多態(tài)性的對(duì)比分析。結(jié)果：對(duì)照組的VEGF-2578C/A和-460T / C基因型頻率符合哈迪-溫伯格平衡參數(shù)，但936C/T基因型頻率并不在此范圍內(nèi)。骨肉瘤患者-2578C/A 的AA基因型（OR = 1.90；95%可信區(qū)間 = 1.00-3.78）和CA+AA基因型（OR = 1.53；95%可信區(qū)間 = 1.00-2.25）相對(duì)于CC基因型而言是顯著增加的。結(jié)論：-2578C/A的AA基因型與CA+AA 基因型提高了骨肉瘤的患病率。

【關(guān)鍵詞】血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子；基因多態(tài)性；骨肉瘤

【中圖分類(lèi)號(hào)】R181.3+2 【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】

A

【文章編號(hào)】1005-0019（2018）11-065-01

骨肉瘤來(lái)源于間葉組織，好發(fā)于長(zhǎng)干骨如股骨遠(yuǎn)端、脛骨和肱骨的骨骺端。骨肉瘤多見(jiàn)于兒童和青少年，約有3 / 1000000的發(fā)病率[1]。骨肉瘤的發(fā)展是個(gè)復(fù)雜的、多步驟的、多因素參與的過(guò)程[2]，腫瘤干細(xì)胞及其潛在性導(dǎo)致了腫瘤的發(fā)生，這也提示遺傳因素在骨肉瘤的發(fā)展過(guò)程中起著重要的作用[3、4]。研究證實(shí)，腫瘤的潛在侵襲性與血管內(nèi)皮細(xì)胞中新生的血管有關(guān)[5、6]，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子及新生血管的形成是腫瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的一個(gè)基本步驟[7]。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）是一種強(qiáng)效的促血管生長(zhǎng)因子，VEGF的多態(tài)性可以通過(guò)改變內(nèi)部的轉(zhuǎn)錄和翻譯來(lái)影響該基因的表達(dá)[8]，一些單核苷酸多態(tài)性比如-2578C/A、936C/T和460T/C被證實(shí)可以影響VEGF蛋白的合成。越來(lái)越多的研究證實(shí)VEGF多態(tài)性和腫瘤之間的關(guān)聯(lián)性[9-11]，但目前只有兩個(gè)研究報(bào)道了VEGF基因與骨肉瘤患病風(fēng)險(xiǎn)性之間的關(guān)聯(lián)[12、13]。本研究旨在探索VEGF-2578C/A， +936C/T 和-460T/C基因多態(tài)性在骨肉瘤發(fā)生發(fā)展中表達(dá)水平的變化。

研究方法

研究人群：本課題將濰坊醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院自2014年1月至2017年01月的90例骨肉瘤患者和90例年齡和性別無(wú)差異的健康對(duì)照組成員納入本研究進(jìn)行研究分析。所有的骨肉瘤患者都是初次患病，由兩位病理學(xué)醫(yī)生分別進(jìn)行了確診，從臨床和病理兩方面來(lái)獲取骨肉瘤患者資料，其中包括性別、年齡、腫瘤分期、腫瘤部位、腫瘤轉(zhuǎn)移和腫瘤家族史。對(duì)照組成員為我院健康體檢的志愿者，均為非骨肉瘤患者，且自身沒(méi)有任何癌癥病史，無(wú)一級(jí)親屬骨肉瘤患病家族史。本研究方案經(jīng)由濰坊醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)通過(guò)，根據(jù)赫爾辛基宣言對(duì)所有參與者簽署書(shū)面知情同意書(shū)。

研究方法：用DNA提取試劑盒從外周血白細(xì)胞中提取DNA，PCR-RFLP法來(lái)研究VEGF-2578C/A，936C/T和460T/C基因多態(tài)性表達(dá)差異。通過(guò)分子檢測(cè)3.1軟件來(lái)為VEGF-2578C/A，936C/T和460T/C設(shè)計(jì)PCR引物。PCR反應(yīng)的步驟如下：在Perkin-Elmer 9700的熱循環(huán)儀里進(jìn)行94°C下8分鐘的初始變性，然后在94°C下 30秒內(nèi)進(jìn)行30個(gè)周期變性，在60°C退火30秒，在72°C 下進(jìn)行1分鐘延伸。PCR產(chǎn)物被NlaIII限制性?xún)?nèi)切酶（紐英倫公司，貝弗利，MA）進(jìn)行酶解。由此產(chǎn)生的DNA片段，經(jīng)3.5%瓊脂糖凝膠下進(jìn)行電泳，經(jīng)過(guò)ethidum染色，在可視化的紫外線(xiàn)照射下透視。

使用SPSS 16版統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，連續(xù)變量之間的差異采用t檢驗(yàn)評(píng)估，分類(lèi)變量之間均采用皮爾遜x2檢驗(yàn)來(lái)評(píng)估。對(duì)照組中VEGF-2578C/A，+936C/T 和 -460T/C基因多態(tài)性的哈代-溫伯格均衡參數(shù)用皮爾遜x2檢驗(yàn)。組間的基因型頻率存在的差異則用皮爾遜x2檢驗(yàn)手段、比值比（OR）和95%可信區(qū)間（CI）來(lái)評(píng)估。P值<0.05具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

結(jié)果

骨肉瘤患者和對(duì)照組的特性如表1所示，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組之間在年齡（P = 0.69）、性別（P = 1）、腫瘤家族史（P = 0.44）方面無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，其中骨肉瘤組平均年齡為21.3±11.5歲，對(duì)照組平均年齡為21.2±11.9歲。實(shí)驗(yàn)組中68.89%的骨肉瘤發(fā)生在長(zhǎng)管狀骨，其余31.11%位于軀干中軸骨骼；38.89%的骨肉瘤組患者出現(xiàn)腫瘤轉(zhuǎn)移，其余的61.11%患者未發(fā)生轉(zhuǎn)移。對(duì)照組的VEGF-2578C/A和460T/C基因頻率在哈迪-溫伯格平衡參數(shù)內(nèi)，但936C/T基因型頻率不在哈迪-溫伯格平衡參數(shù)內(nèi)（表2）。對(duì)照組中的VEGF-2578C/A，936C/T和460T/C的次要等位基因頻率（MAF）與中國(guó)大眾人口NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中的相一致。同-2578C/A的 CC基因亞型相比，-2578C/A 的AA基因型（OR = 1.90；95%可信區(qū)間 = 1.00-3.78）和CA+AA基因型（OR = 1.53；95%可信區(qū)間 = 1.00-2.25）在骨肉瘤風(fēng)險(xiǎn)中是顯著增加的（表3） 。+936C/T和-460T / C基因多態(tài)性與骨肉瘤風(fēng)險(xiǎn)之間的關(guān)聯(lián)性并沒(méi)有顯著的意義。

討論

遺傳因素和某些導(dǎo)致DNA損傷的環(huán)境因素與骨肉瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)[14]，VEGF基因被認(rèn)為是其中的一個(gè)重要遺傳因素[12、13]。本研究旨在探索VEGF基因多態(tài)性與中國(guó)人口中骨肉瘤風(fēng)險(xiǎn)之間的關(guān)聯(lián)性，證實(shí)了-2578C/A的AA基因型和CA+AA基因型與骨肉瘤風(fēng)險(xiǎn)增加有關(guān)。新的血管生成在腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移過(guò)程中起著重要作用，而血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子是血管生成的關(guān)鍵因子，它能促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖和改變血管細(xì)胞外基質(zhì)[15]。研究證實(shí)，在多種腫瘤中都有血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的高度表達(dá)，并且它與促進(jìn)腫瘤組織血管密度呈正相關(guān)[16]。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的基因多態(tài)性被證實(shí)與乳腺癌、肺癌、大腸癌、胃癌和前列腺癌等多種腫瘤的敏感性有關(guān)。目前僅有兩個(gè)針對(duì)VEGF基因多態(tài)性與骨肉瘤風(fēng)險(xiǎn)性之間關(guān)聯(lián)性的研究，Tie[12]將單核苷酸與骨肉瘤的患病率之間相關(guān)性進(jìn)行了研究分析，證實(shí)了VEGF-2578C/A和-634G / C的多態(tài)性可能增加骨肉瘤患病率。Wang[13]等人發(fā)現(xiàn)VEGF基因中的三個(gè)常見(jiàn)單核苷酸多態(tài)性對(duì)于骨肉瘤的敏感性有著潛在影響，認(rèn)為-634G/C 的T等位基因可能與中國(guó)人群的骨肉瘤多態(tài)性有關(guān)，但這都需要進(jìn)一步的研究來(lái)證實(shí)。

本研究證實(shí)VEGF -2578C/A的AA和CA基因亞型可能增加了中國(guó)人群中骨肉瘤的患病率，血管生長(zhǎng)因子在骨肉瘤病因?qū)W中起著重要的作用。

參考文獻(xiàn)

[1] Mirabello L， Troisi RJ， Savage SA （2009）. Osteosarcoma incidence and survival rates from 1973 to 2004： Data from the surveillance， epidemiology， and end results program. Cancer. 115：1531-1543.

[2] Powers M， Zhang W， Lopez-Terrada D， Czerniak BA， Lazar AJ （2010）. The molecular pathology of sarcomas. Cancer biomarkers： section A of Disease markers. 9：475-491.