青花菜黑腐病致病菌的分離和鑒定

劉莉莉 文正華 單曉政 張文慧 賀麗霞 宋文芹 孫德嶺 江漢民

摘 要： 黑腐病是影響青花菜生產(chǎn)的主要病害之一，為了更好地研究該致病菌的致病機(jī)制和十字花科蔬菜對(duì)其抗性的分子機(jī)制，從發(fā)病田間采集具有典型癥狀的病害標(biāo)樣，對(duì)病原菌進(jìn)行分離、純化，并對(duì)其形態(tài)特征、理化特性和致病性進(jìn)行了分析，同時(shí)測(cè)定了該菌株23S rDNA和hrcC基因序列，分析了與近緣細(xì)菌23S rDNA和hrcC基因序列的同源性，構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)生樹，比較了2種基因?qū)ο嗨萍?xì)菌的檢測(cè)和鑒別能力，結(jié)果表明，hrcC基因用于該致病菌的鑒定更具優(yōu)越性。根據(jù)分離菌的表型特征及分子特征，判定該分離菌為青花菜黑腐病的致病菌-野油菜黃單胞桿菌野油菜致病變種。

關(guān)鍵詞： 青花菜；黑腐??；23S rDNA；hrcC基因

Abstract： The black rot caused by Xanthomonas campestris pv. Campestris is one of the main disease affecting broccoli production. In order to study the pathogenic mechanism of the pathogenic bacteria and the molecular mechanism of crucifer resistance to the pathogen， diseased samples with typical symptom were collected and representative strains were selected to determine morphology， cultural characters， straining reaction， physiological and biochemical reactions and pathogenicity of pathogen. In addition， the 23S rDNA and hrcC gene were partially sequenced and compared with the sequences deposited in databased， molecular phylogentic trees were constructed based on two genes. The results showed that hrcC gene analysis may be a more useful tool for interspecies identification. The isolates were identified as Xanthomonas campestris pv. Campestris based on their phenotepic and molecular characteristics.

Key words： Broccoli； Black rot； 23S rDNA； hrcC gene

青花菜又名青花椰菜、西蘭花。十字花科蕓薹屬甘藍(lán)種中以綠花球?yàn)楫a(chǎn)品的一個(gè)變種，是國際暢銷的一種名特蔬菜，具有很高的營養(yǎng)保健價(jià)值。近年來隨著消費(fèi)需求逐年增加，種植面積不斷擴(kuò)大，輪作倒茬時(shí)限越來越短，黑腐病的危害呈逐年加重的趨勢(shì)，該病的成因及預(yù)防也是科研工作者關(guān)注的焦點(diǎn)問題。十字花科黑腐病由革蘭氏陰性植物病原菌Xanthomonas campestris pv. campestris （Xcc）引起的，是一種能使全球范圍內(nèi)所有十字花科植物形成黑腐病的重要病害[1]，其發(fā)病普遍且危害嚴(yán)重，染病后引起葉脈變黑、葉片枯死，影響植株光合作用，造成產(chǎn)量和花球品質(zhì)的下降。該病對(duì)危害甘藍(lán)類蔬菜（Brassica oleracea）（包含青花菜）的生產(chǎn)，流行年份枯死率可達(dá)30%以上[2-4]，許多科研工作者致力于十字花科植物特別是甘藍(lán)類蔬菜抗黑腐病的遺傳規(guī)律，以及對(duì)致病菌侵染的應(yīng)答模式、基因的篩選及抗病機(jī)制的探尋等方面的探尋[5-7]。筆者特別針對(duì)危害本地區(qū)青花菜生產(chǎn)的黑腐病病原菌進(jìn)行分離、純化，對(duì)其形態(tài)特征、理化特性和致病性進(jìn)行分析，同時(shí)對(duì)該菌的23S rDNA和hrcC基因的部分序列進(jìn)行測(cè)序，比對(duì)分析近緣細(xì)菌23S rDNA和hrcC基因序列的差異，比較2種基因?qū)υ撝虏【臋z測(cè)和鑒別能力，旨在為對(duì)該致病菌的準(zhǔn)確、快速有效鑒定及進(jìn)一步研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 病原菌的分離、純化

青花菜黑腐病發(fā)病葉片采于天津市武清區(qū)大孟莊鎮(zhèn)青花菜種植基地。2016年10月30日取樣，所選取的病樣為典型黑腐病發(fā)病初期葉片，病葉干凈無蟲食，病樣采集后于取樣袋中帶回，4 ℃存放，24 h內(nèi)進(jìn)行分離、純化，具體參照《微生物學(xué)試驗(yàn)技術(shù)》提供的方法進(jìn)行[8]，純化后的菌株命名為TJ4401并保存于NYGB培養(yǎng)基中，-80 ℃存放。每次使用時(shí)在Kings B固體培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)以恢復(fù)細(xì)菌活性，然后回接于青花菜葉片上使其恢復(fù)致病能力，重新分離、純化后用于接種試驗(yàn)[9]。

1.2 病原菌的鑒定

1.2.1 病原菌的回接鑒定 根據(jù)Koch法則，為進(jìn)一步確定所得到的病原菌為青花菜黑腐病的致病菌，將病原菌稀釋成1×108 cfu·mL-1的懸液，針刺法回接到青花菜感病品系上，以接種無菌水的為對(duì)照，接種后24 h保持90%以上的相對(duì)濕度，14 d后觀察發(fā)病情況。

1.2.2 形態(tài)學(xué)及生理生化鑒定 對(duì)分離的單菌落，稀釋后涂布于Kings B固體培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)72 h，對(duì)長(zhǎng)出的菌落進(jìn)行形態(tài)、色澤等方面的觀察。同時(shí)參照Meyer D等[8]的方法對(duì)其進(jìn)行生理生化等方面的鑒定，主要包括鞭毛銀染、明膠液化、淀粉酶水解、革蘭氏染色等。

1.2.3 病原菌的分子鑒定 CTAB法提取病原菌的基因組DNA[10]，根據(jù)GenBank提供的植物病原細(xì)菌23S rDNA的序列設(shè)計(jì)23S rDNA的擴(kuò)增引物，同時(shí)根據(jù)近緣植物病原細(xì)菌hrcC基因的DNA序列設(shè)計(jì)引物，利用多重序列比對(duì)工具ClustalX 2.0分析后，根據(jù)Xcc特有的序列位點(diǎn)設(shè)計(jì)特異引物，具體序列見表1。

采用FastPfu DNA Polymerase進(jìn)行擴(kuò)增，以Xcc菌株B100的基因組DNA為陽性對(duì)照。PCR結(jié)束后1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增結(jié)果。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行純化后，按照pGEM-T easy（Promega，USA）載體試劑盒提供的方法與載體進(jìn)行連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coli感受態(tài)細(xì)胞JM109，挑選陽性克隆進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果在NCBI上進(jìn)行比對(duì)。在GenBank里搜索已發(fā)表的植物病原菌的23S rDNA序列，和本試驗(yàn)所測(cè)序列分別進(jìn)行菌株進(jìn)行比對(duì)。用MEGA 6.0計(jì)算不同菌株之間遺傳距離并建立聚類分析樹狀圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌的菌落特征和形態(tài)

在Kings B固體培養(yǎng)基上菌落近圓形，初呈淡黃色，后變?yōu)槊埸S色，邊緣完整，略凸起，薄或平滑，具光澤，初步確定所分離的病原菌為青花菜黑腐病的致病菌（圖1）。

2.2 病原菌的回接鑒定

將采集的黑腐病病樣經(jīng)分離、純化后，按Koch法則回接到青花菜感病系，14 d后所有接種植株的發(fā)病率為100%，葉片接種部位出現(xiàn)典型的“V”字形病斑。而對(duì)照無菌水接種區(qū)域沒有出現(xiàn)病變。以上說明所分離的病原菌為青花菜黑腐病致病菌（圖2）。

2.3 病原菌的生理生化鑒定

對(duì)病原菌進(jìn)行了革蘭氏染色、鞭毛銀染、明膠液化、淀粉酶水解等生理生化特征的分析和觀察（圖3）。從顯微鏡下觀察到菌體呈桿狀，長(zhǎng)度為0.3～0.7 μm，極生鞭毛，無芽孢，菌體單生或鏈生，革蘭氏染色陰性。

2.4 病原菌的分子鑒定結(jié)果

為進(jìn)一步對(duì)所分離病原菌進(jìn)行鑒定分析，以提取的病原菌基因組DNA為模板，PCR擴(kuò)增23S rDNA，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示2 679 bp處有清晰地電泳條帶，與預(yù)期結(jié)果相符（圖4）。23S rDNA擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序后與GenBank數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比較，結(jié)果顯示所分離的來自發(fā)病葉片的菌株的23S rDNA的序列為該菌種特異性片段，與菌株ATCC33913、B100 ICPM4013、ICPM21080及8004 23S rDNA的序列相似性為99%，但與同屬黃單胞菌屬的近緣細(xì)菌（如Xanthomonas gardneri、Xanthomonas oryzae 、Xanthomonas vesicatoria 、Xanthomonas arboricola 、Xanthomonas gardneri 、Xanthomonas cynarae 、Xanthomonas hortorum 、Xanthomonas bromi 、Xanthomonas arboricolap、Xanthomonas pisi 、Xanthomonas fragariae 、Xanthomonas cucurbitae 、Xanthomonas cassavae 、Xanthomonas vasicola 、Xanthomonas perforans 、Xanthomonas euvesicatoria 、Xanthomonas axonopodis等）的序列同源性也為99%。系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析結(jié)果表明，我們所分離的致病菌菌株TJ4401與菌株17、B100、ATCC 33913及8004位于同一分支（圖5）。

用同樣的方法對(duì)病原菌的致病相關(guān)基因hrcC的部分序列進(jìn)行擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物大小與陽性對(duì)照的擴(kuò)增結(jié)果一致（圖5）。測(cè)序結(jié)果證實(shí)該片段與GenBank公布的Xcc菌株17、B100、ATCC 33913及8004的序列同源性均為100%，與黃單胞菌屬其它致病菌的同源性均低于96%；系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析結(jié)果表明，我們所分離的致病菌菌株TJ4401與菌株17、B100、ATCC 33913及8004位于同一分支（圖6），進(jìn)一步證實(shí)了所分離的病原菌為青花菜黑腐病的致病菌（圖7）。

3 討 論

病原細(xì)菌的鑒定方法很多，形態(tài)學(xué)、生理學(xué)和生態(tài)特征是傳統(tǒng)的鑒定方法，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，DNA序列分析已成為國際上細(xì)菌分類鑒定常用的技術(shù)手段[11]，而細(xì)菌的核糖體RNA基因（rDNA）是細(xì)菌進(jìn)化過程中比較保守的基因，病原細(xì)菌16S和23S rDNA二者結(jié)構(gòu)均由保守區(qū)和可變區(qū)構(gòu)成，不同菌種間，保守區(qū)序列差異較小，可變區(qū)序列隨菌種親緣關(guān)系的親疏不同而各有差異，常被用來研究細(xì)菌進(jìn)化過程的親緣關(guān)系以及作為分類的標(biāo)準(zhǔn)[12]。但相比之下，16S rDNA序列在原核生物中的保守性較高，難以鑒別相近種或同一種內(nèi)的不同菌株。23S rDNA基因分子比較大，其變異性亦高于rDNA基因中其它基因，其變異性更適合進(jìn)行常見致病微生物的鑒別[13]。研究人員常選取該基因的部分保守序列進(jìn)行基因擴(kuò)增，比較不同細(xì)菌種屬間的差異，并用于細(xì)菌的鑒別診斷。筆者基于23S rDNA的序列同源性比對(duì)結(jié)果不能將供試菌株與親緣關(guān)系較近的菌種區(qū)別開來，僅能在系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析上能將其與親緣關(guān)系較近的菌種有效取分；而基于hrcC基因的序列同源性比對(duì)及系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析均可以明顯地將檢索出的近緣菌種區(qū)別開來?？梢姡诤诟≈虏【臋z測(cè)和鑒定方面，hrcC基因比23S rDNA更具優(yōu)越性。

參考文獻(xiàn)

[1] WILLIAMS P H，STAUB T，SUTTON J C.Inheritance of resistance in cabbage to black rot[J].Phytopathology，1972，62：247-252.

[2] MASSOMO SMS，MORTENSEN C N，MABAGALA R B，et al.Biological control of black rot（Xanthomonas campestris pv.Campestris）of cabbage in Tanzania with Bacillus strains[J].Plant Phytopathol，2004，152（2）：98-105.

[3] TAYLOR J D，CONWAY J，ROBERTS S J，et al.Sources and origin of resistance to Xanthomonas campestris pv.campestris in Brassica genomes[J].Phytopathology，2002，92：105-111.

[4] DOW J，DANIELS M.Pathogenicity determinants and global regulation of pathogenicity of Xanthomonas campestris pv.campestris[J].Current Topics in Microbiology & Immunology，1994（192）：29-41.

[5] LI L，LI R F，MING Z H，et al.Identification of a novel type III secretion-associated outer membrane-bound protein from Xanthomonas campestris pv.campestris[J].Scientific Reports，2017（7）：42724.

[6] BOLOT S，GUY E，CARRERE S，et al.Genome sequence of Xanthomonas campestris pv.campestris strain Xca5[J].Genome Announc，2013，1（1）： e00032-12.

[7] QIAN W，JIA Y，REN S X，et al.Comparative and functional genomic analyses of the pathogenicity of phytopathogen Xanthomonas campestris pv.campestris[J].Genome Research，2005，15（6）：757-767.

[8] MEYER D，LAUBER E，ROBY D，et al.Optimization of pathogenicity assays to study the Arabidopsis thaliana Xanthomonas campestris pv.campestris pathosystem[J].Molecular Plant Pathology，2005，6（3）：327-333.

[9] GUY E，GENISSEL A， HAJRI A，et al.Natural genetic variation of Xanthomonas campestris pv.campestris pathogenicity on Arabidopsis revealed by association and reverse genetics[J].Mbio，2013，4（3）：e00538-12.

[10] WILSON K.Preparation of genomic DNA from bacteria[M]//AUSUBEL F M，BRENT R，KINSTON R E.Current Protocols in Molecular Biology，New York： N.Y Greene，1989.

[11] KIM C H，LEE J H，HEO J H，et al.Cloning and expression a novel esterase gene CPoA from Burkholderia cepacia[J].Journal of Applied Microbiology，2004（6）：1306-1316.

[12] WOESE C R.Bacterial evolution[J].Microbiol Review，1987，51（2）：221-271.

[13] LUDWIG W，KIRCHHOF G，KIRCHHOF G，et al.Complete 23S ribosomal RNA sequences of Gram-positive bacteria with a low DNA G+C content[J].Systematic and Applied Microbiology，1992，15（4）：487-501.