越鞠丸對小鼠海馬組織中NO-cGMP信號通路的影響＊

王 薇，賈 蓉，沈琴琴，薛文達(dá)＊＊

（1.南京中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院轉(zhuǎn)化系統(tǒng)生物學(xué)和神經(jīng)科學(xué)研究中心/中醫(yī)腦病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 南京210023；2.南京中醫(yī)藥大學(xué)心理學(xué)院 南京 210023；3.南京中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院 南京210023；4.南通大學(xué)神經(jīng)再生協(xié)同創(chuàng)新中心 南通 226001）

抑郁癥是一種復(fù)雜的情感障礙，常伴有自殺傾向而導(dǎo)致高死亡率和致殘率[1]，不利于個(gè)人的健康和社會(huì)的穩(wěn)定。其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜多元，具體的病因現(xiàn)在仍然不是十分清楚。臨床和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)都證明谷氨酸參與了抑郁樣行為，阻斷NMDA受體能夠產(chǎn)生抗抑郁作用[2]。此外，藥物阻斷NMDA受體如氯胺酮能夠產(chǎn)生很好的抗抑郁作用[3]。與之相類似，高劑量的選擇性5-羥色胺重?cái)z取抑制劑（Selective Serotonin Reuptake Inhibitor，SSRI）抗抑郁類藥物也能夠?qū)MDA受體活性產(chǎn)生影響[4]。研究還發(fā)現(xiàn)抑郁癥自殺者死后的腦組織中存在N-甲基-D-天冬氨酸（N-methyl-D-aspartate，NMDA）受體系統(tǒng)異?，F(xiàn)象[5]。目前臨床上用于治療抑郁癥的藥物大多起效緩慢、作用有限并且長期服用有毒副作用。近年來，氯胺酮的快速持久抗抑郁作用及其相關(guān)機(jī)制研究已成為抗抑郁藥物研究的熱點(diǎn)[6,7]。但是氯胺酮的成癮性、神經(jīng)毒性等副作用限制了其臨床應(yīng)用。中醫(yī)藥治療抑郁癥經(jīng)驗(yàn)豐富，方藥眾多，副作用小。其中，越鞠丸出自《丹溪心法》，是治療郁證的經(jīng)典方。由于抑郁癥與郁證具有相似性，因而越鞠丸也被廣泛應(yīng)用于現(xiàn)代抑郁癥的治療[8]。前期研究發(fā)現(xiàn)，越鞠丸具有與氯胺酮相似的快速起效的抗抑郁作用[9,10]。我們在小鼠模型上的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示越鞠丸和氯胺酮的快速抗抑郁作用需要NMDA信號的參與[11]，如NMDA受體NR1的表達(dá)下降[12]。然而越鞠丸的抗抑郁作用是如何通過NMDA信號通路的仍然不清楚。

研究表明NO-cGMP信號通路參與了抗抑郁藥物的作用，NMDA受體的激活能夠降低NO合成酶（nitric oxide synthase，NOS）的活性，從而降低從L-精氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)镹O的合成[13,14]，并引起細(xì)胞中cGMP含量升高[15]。給予氯胺酮可降低小鼠海馬組織中cGMP含量，提示NO-cGMP信號通路參與了氯胺酮的抗抑郁機(jī)制[16]。NO作為神經(jīng)系統(tǒng)中重要神經(jīng)遞質(zhì)分子在抑郁癥研究中越來越受到重視，有研究顯示大鼠海馬腦區(qū)NO水平的降低可產(chǎn)生抗抑郁效應(yīng)[17]。NO能夠靶定多個(gè)基因，如可溶性鳥苷酸環(huán)化酶（soluble guanylate cyclase，sGC），能夠轉(zhuǎn)化鳥苷-5′-三磷酸（guanosine 5-triphosphate，GTP）為環(huán)鳥苷酸（cyclic guanosine 3,5-monophosphate，cGMP）[18]，從而調(diào)控下游信號通路，參與抗抑郁藥物的作用。NO作為神經(jīng)遞質(zhì)參與中樞神經(jīng)系統(tǒng)的遞質(zhì)如血清素的釋放[19]，包括痛覺，突觸可塑性等，參與了抑郁癥的發(fā)生過程。抑制NOS的活性能夠增強(qiáng)SSRI類藥物的抗抑郁作用[20]。近年研究也發(fā)現(xiàn)，降低NO水平與抗抑郁作用密切有關(guān)，從而支持了NO是參與了抑郁癥的重要分子[21]。NO是cGMP的有效調(diào)節(jié)者，而cGMP參與了抑郁癥的發(fā)生[22]。因此，NO-cGMP信號通路是參與調(diào)控抑郁樣表型的重要通路[23]。因此越鞠丸是如何通過影響NMDA受體，從而調(diào)控NO-cGMP信號通路是亟需要探索的問題。

本研究擬采用ELISA法檢測單次給予越鞠丸后小鼠海馬組織中NO和cGMP含量的動(dòng)態(tài)變化，并通過行為學(xué)測試來分析NO合成底物L(fēng)-精氨酸（L-arg）對越鞠丸抗抑郁作用的影響，以探討越鞠丸對NO-cGMP信號通路的作用影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級昆明小鼠，雄性，7-8周齡，體重為20-25 g，購自南京市青龍山動(dòng)物繁殖場（動(dòng)物合格證號：SCXK(蘇)2014-0002）。實(shí)驗(yàn)前小鼠適應(yīng)飼養(yǎng)環(huán)境1周，屏障間環(huán)境溫度22-24℃，濕度40%-60%，晝夜交替時(shí)間12 h，動(dòng)物可自由攝食飲水。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物

實(shí)驗(yàn)用所用中藥材購自南京中醫(yī)藥大學(xué)國醫(yī)堂門診部藥房。越鞠丸由蒼術(shù)100 g、神曲100 g、香附100g、梔子100 g、川芎100 g組成，將藥材打粉后過篩混勻。將藥粉浸泡于95%乙醇（6倍體積）中，靜置48 h后收集上清液，重復(fù)2次，收集3次獲取的上清液，過濾，于55℃減壓濃縮，獲得醇提越鞠丸。藥物制備好后于-20℃保存?zhèn)溆?。臨用前用生理鹽水配制成所需濃度。

1.3 實(shí)驗(yàn)試劑

本 實(shí)驗(yàn) 所用 NO（JEB-12547）和 cGMP（JEB-12702）ELISA試劑盒購自南京金益柏生物科技公司。L-arg購自阿拉丁試劑公司（貨號：N109208），臨用前用生理鹽水配制成濃度為750 mg·kg-1的藥液[24]。

1.4 ELISA法測定NO和cGMP的含量

小鼠分為兩組：空白對照組和越鞠丸給藥組。給藥組動(dòng)物按越鞠丸濃度13.5 g·kg-1的劑量進(jìn)行灌胃給藥[8]，分別于給藥12 min，24 min，30 min，3 h，24 h后，取小鼠海馬組織，液氮速凍后，于-80℃冰箱凍存?zhèn)溆?。然后按試劑盒說明書進(jìn)行操作，分別測定各組中NO和cGMP濃度。

1.5 行為學(xué)測試分析L-arg對越鞠丸抗抑郁作用的影響

實(shí)驗(yàn)小鼠分為4組：空白對照組、L-arg給藥組、越鞠丸給藥組、L-arg+越鞠丸給藥組。其中，空白對照組：小鼠腹腔注射生理鹽水；L-arg給藥組：小鼠腹腔注射L-arg 30 min后注射生理鹽水；越鞠丸給藥組：小鼠腹腔注射生理鹽水30 min后灌胃給予越鞠丸；L-arg+越鞠丸給藥組：小鼠腹腔注射L-arg 30 min后灌胃給予越鞠丸。以上4組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物最后1次給藥30 min后進(jìn)行行為學(xué)測試。

由于本實(shí)驗(yàn)采用急性給藥方式，因而采用懸尾測試方法來分析L-arg對越鞠丸抗抑郁樣行為的影響。測試前將小鼠提前放入測試房間30 min以適應(yīng)環(huán)境。懸尾測試如下：將小鼠尾部粘貼在鉤子上，倒掛在測試箱中，測試時(shí)間為6 min，記錄后4 min內(nèi)小鼠的累計(jì)不動(dòng)時(shí)間。采用ANY-maze軟件進(jìn)行小鼠的軌跡分析。

開場測試（Open Field Test，OFT）：將小鼠放入方箱（40 cm*40 cm）內(nèi)的底面中心，進(jìn)行5 min的觀察和攝像。記錄在5 min內(nèi)小鼠的總活動(dòng)路程和在中央?yún)^(qū)域的活動(dòng)時(shí)間。采用ANY-maze軟件進(jìn)行小鼠的行為分析。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理，數(shù)據(jù)均采用s表示。各組間兩兩比較采用t檢驗(yàn)，兩種藥物處理數(shù)據(jù)間比較采用兩因素方差分析（Two-Way ANOVA），事后檢驗(yàn)（post hoc）采用 Bonferroni，P＜0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 越鞠丸對小鼠海馬組織中NO含量的影響

單次給予越鞠丸灌胃后，檢測12 min，24 min，30 min，3 h，24 h這幾個(gè)不同時(shí)間點(diǎn)的小鼠海馬組織中NO的含量變化。檢測結(jié)果顯示給予越鞠丸12 min后，小鼠海馬組織中的NO含量顯著下降（P＜0.05），給藥后24 min出現(xiàn)顯著上升（P ＜0.05），之后的30 min、3 h、24 h后NO含量與對照組相比都沒有明顯差異（圖1）。

2.2 越鞠丸對小鼠海馬組織中cGMP含量的影響

由于NO可以調(diào)節(jié)胞內(nèi)cGMP含量，因此我們在單次給予越鞠丸灌胃后，檢測 12 min、24 min、30 min、3 h、24 h這幾個(gè)不同時(shí)間點(diǎn)的小鼠海馬組織中cGMP的含量變化。結(jié)果顯示單次給予越鞠丸12 min后，小鼠海馬組織中的cGMP含量與NO含量變化趨勢一致，也出現(xiàn)了顯著下降（P＜0.05），給藥后24 min出現(xiàn)顯著上升（P＜0.05），之后的3個(gè)時(shí)間點(diǎn)cGMP含量給藥組與對照組相比沒有顯著差異（圖2）。

2.3 L-arg對越鞠丸抗抑郁樣行為的影響

上述結(jié)果顯示越鞠丸能夠快速調(diào)節(jié)胞內(nèi)NO含量，為了進(jìn)一步確認(rèn)NO信號通路參與越鞠丸抗抑郁作用。我們采用NO合成的前提L-arg預(yù)先給藥處理，檢測是否能夠阻斷越鞠丸的抗抑郁作用。懸尾測試結(jié)果顯示，與對照組相比，單次給予越鞠丸，能夠顯著減少小鼠的不動(dòng)時(shí)間（P＜0.01），與越鞠丸組相比，預(yù)先給予L-arg則能夠顯著增加小鼠的不動(dòng)時(shí)間（P＜0.01），另外，與對照組相比，單獨(dú)給予L-arg后小鼠不動(dòng)時(shí)間無明顯變化（圖3A），提示單獨(dú)給予L-arg不能產(chǎn)生抗抑郁作用。

圖1 單次給予越鞠丸后不同時(shí)間點(diǎn)的小鼠海馬組織中NO的含量變化

圖2 單次給予越鞠丸后不同時(shí)間點(diǎn)的小鼠海馬組織中cGMP的含量

為了檢測越鞠丸或者L-arg對小鼠自發(fā)活動(dòng)是否具有影響，我們檢測了單獨(dú)給藥和聯(lián)合用藥后的開場行為。在開場測試中發(fā)現(xiàn)，無論是單獨(dú)給予越鞠丸或L-arg，還是聯(lián)合給藥都不能夠改變小鼠的自發(fā)活動(dòng)性，顯示藥物具有真實(shí)的抗抑郁作用（圖3B）。

3 討論

圖3 預(yù)處理L-arg對于越鞠丸抗抑郁作用的影響

本研究基于越鞠丸快速抗抑郁是與NMDA受體通路有關(guān)，探索越鞠丸調(diào)節(jié)胞內(nèi)NMDA受體下游的NO和cGMP小分子變化，通過不同時(shí)間點(diǎn)的檢測發(fā)現(xiàn)越鞠丸快速降低了小鼠海馬組織的NO和cGMP含量，從而引起下游分子信號的變化，產(chǎn)生快速抗抑郁作用。進(jìn)一步通過預(yù)先給予NO合成前體L-arg，結(jié)果發(fā)現(xiàn)能夠阻斷越鞠丸的抗抑郁作用，并且對于小鼠的自發(fā)活動(dòng)沒有影響，證實(shí)了越鞠丸的抗抑郁作用依賴于NO-cGMP信號通路。

近年來，快速抗抑郁的藥物逐漸成為抑郁癥治療的研究熱點(diǎn)，其中，氯胺酮是這類抗抑郁藥物的典型代表。氯胺酮是一種NMDA受體拮抗劑，單次劑量的氯胺酮便能迅速改善抑郁癥病人的抑郁癥狀[25]和抑郁小鼠的抑郁表型。唐娟娟等研究表明，與氯胺酮相比，越鞠丸可降低前額葉中NR1表達(dá)增強(qiáng)，且持續(xù)時(shí)間更長。夏寶妹等研究顯示，越鞠丸可持久降低獲得性無助模型動(dòng)物的海馬組織中NR1表達(dá)水平的升高。這些研究也提示NMDA受體（尤其是NR1）作為越鞠丸快速持久抗抑郁的靶向分子。NMDA受體可從上游調(diào)控NO-cGMP信號通路，即突觸前膜釋放的谷氨酸作用于NMDA受體，鈣離子內(nèi)流后結(jié)合鈣調(diào)蛋白，激活NO合成酶，催化L-arg合成NO，進(jìn)而NO激活鳥苷酸環(huán)化酶，增加cGMP的合成。NO作為一種重要的新型神經(jīng)遞質(zhì)分子，參與多種生理生化過程，其與血管通透性、神經(jīng)元興奮性、神經(jīng)突觸可塑性有密切關(guān)系[26]。如果NMDA受體被過度激活，則會(huì)生成過量的NO，從而增加對神經(jīng)元的毒性作用。張洪燕等研究發(fā)現(xiàn)血漿NO濃度與抑郁癥狀顯著相關(guān)[27]。Joca等研究顯示大鼠海馬組織中NO濃度的降低可產(chǎn)生抗抑郁作用。而Yazir等研究也顯示抑制NO合成酶和鳥苷酸環(huán)化酶可抑制慢性抑郁的形成[28]。本研究中首次揭示單次給予越鞠丸后12 min時(shí)，越鞠丸給藥組與空白對照組相比，顯著下調(diào)了NO濃度，隨后在24 min時(shí)出現(xiàn)了恢復(fù)性的增加，之后趨于平穩(wěn)，提示越鞠丸通過快速下調(diào)NO濃度產(chǎn)生抗抑郁作用，系統(tǒng)揭示了越鞠丸調(diào)控海馬組織中NO濃度的動(dòng)態(tài)變化過程?？瞻讓φ战M在不同時(shí)間點(diǎn)也出現(xiàn)了NO含量的增加和恢復(fù)，這可能與受到了給藥這一過程的刺激因素有關(guān)，朱東亞等研究顯示應(yīng)激能夠引起胞內(nèi)NO含量的增加[29]，這與本研究的結(jié)果也是相一致的。

以往研究認(rèn)為NO-cGMP信號通路參與了抑郁癥的發(fā)病機(jī)制[30]。cGMP可被G蛋白偶聯(lián)受體激活的蛋白激酶活化，繼而將信息從胞外傳遞至細(xì)胞核。cGMP可改善血管重塑，并在神經(jīng)信號傳遞、細(xì)胞凋亡等方面具有重要作用[31]。果木素（frutalin）的抗抑郁作用依賴于NO-cGMP信號通路[32]。抑郁癥病人研究中也發(fā)現(xiàn)NO含量的增加，與之變化相一致的cGMP含量也顯著增加了[33]。本研究發(fā)現(xiàn)，cGMP的濃度變化在越鞠丸處理后與NO的濃度變化是一致的，都在12 min時(shí)表達(dá)下降，在24 min時(shí)恢復(fù)性增加，隨后恢復(fù)正常水平，提示兩者的濃度變化可能都是越鞠丸的作用所引起的，而這一濃度水平的快速調(diào)整是越鞠丸引起快速抗抑郁作用的重要機(jī)制之一。

進(jìn)一步，為了確證NO在越鞠丸抗抑郁中的關(guān)鍵作用，本研究通過在越鞠丸給藥前預(yù)先給予NO合成的關(guān)鍵前體L-arg，L-arg由eNOS（血管內(nèi)皮一氧化氮合酶）催化合成NO，NO從內(nèi)皮細(xì)胞釋放，用以響應(yīng)刺激和旁分泌過程[34-35]。L-arg能夠在小鼠強(qiáng)迫游泳測試中逆轉(zhuǎn)鋰鹽和胍丁胺的抗抑郁作用，提示兩者的作用依賴于NO信號通路[36]。此外，經(jīng)典抗抑郁藥物丙咪嗪[37]、文拉法辛[38]和鋰鹽[39]的抗抑郁作用都能夠被L-arg所阻斷。在本研究結(jié)果中也發(fā)現(xiàn)L-arg能夠阻斷越鞠丸的抗抑郁作用，說明越鞠丸的抗抑郁作用是依賴于NO-cGMP信號通路來發(fā)揮作用的。同時(shí)為了檢測藥物本身對小鼠自發(fā)活動(dòng)的影響，在開場測試中也檢測發(fā)現(xiàn)無論是L-arg還是越鞠丸或是二者聯(lián)合用藥都不能夠?qū)π∈蟮淖园l(fā)活動(dòng)產(chǎn)生作用，從另一個(gè)方面確立了越鞠丸抗抑郁作用及被L-arg阻斷的真實(shí)性。

本研究通過系統(tǒng)檢測越鞠丸處理后不同時(shí)間點(diǎn)小鼠海馬組織中NO和cGMP濃度的變化，并利用NO合成前體L-arg預(yù)處理阻斷越鞠丸的抗抑郁作用，探討越鞠丸對小鼠海馬腦區(qū)NO-cGMP信號通路的影響。下一步應(yīng)繼續(xù)研究cGMP調(diào)控的下游信號分子，如sGC、nNOS、eNOS等的變化，進(jìn)一步深入分析越鞠丸發(fā)揮快速持久抗抑郁作用的分子機(jī)制，為其臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。