β—tubulinⅢ、ERCC—1在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)和臨床意義

徐德華 鄒先明 張偉

【摘要】 目的：檢測(cè)β-tubulin Ⅲ、ERCC-1在非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）中的表達(dá)情況及其與生存期的關(guān)聯(lián)性。方法：Envision法檢測(cè)資料完整的120例NSCLC中β-tubulin Ⅲ、ERCC-1的表達(dá)，所有病例均予以順鉑或紫杉醇為主的輔助聯(lián)合化療，隨訪生存期。結(jié)果：β-tubulin Ⅲ在NSCLC中的陽(yáng)性表達(dá)率小于正常肺組織中，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。ERCC-1在NSCLC中的陽(yáng)性表達(dá)率明顯大于正常肺組織（P<0.05）。β-tubulin Ⅲ、ERCC-1的表達(dá)和性別、年齡、組織學(xué)類型、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均無(wú)相關(guān)性（P>0.05），β-tubulin Ⅲ的表達(dá)與分化程度相關(guān)（P<0.05）。β-tubulin Ⅲ（-）、ERCC-1（-）生存期最長(zhǎng)，β-tubulin Ⅲ（+）、ERCC-1（+）生存期最短。結(jié)論：β-tubulin Ⅲ可能參與介導(dǎo)肺癌的生長(zhǎng)、侵襲。β-tubulin Ⅲ（-）、ERCC-1（-）的NSCLC患者可能從以順鉑或紫杉醇為主的輔助聯(lián)合化療中受益。

【關(guān)鍵詞】 β-tubulin Ⅲ； ERCC-1； 非小細(xì)胞肺癌； 陽(yáng)性表達(dá)率

【Abstract】 Objective：To detect the expression and the relationship between expression and life of β-tubulin Ⅲ，

ERCC-1 in non-small cell lung cancer.Method：120 cases of NSCLC of expression of beta-tubulin Ⅲ and ERCC-1

were detected by the Envision method，and all cases were treated with cisplatin or paclitaxel based adjuvant chemotherapy，followed up for survival.Result：The positive expression rate of β-tubulin Ⅲ in non-small cell lung cancer was lower than that in normal lung tissue，but there was no significant difference （P>0.05）.The positive expression rate of ERCC-1 in non-small cell lung cancer was significantly higher than that in normal lung tissue （P<0.05）.There was no correlation between the expression of β-tubulinⅢ and ERCC-1 and sex，age，histological type，TNM staging and lymph node metastasis（P>0.05），the expression of β-tubulin Ⅲ was related to the degree of differentiation （P<0.05）.The survival time of β-tubulin Ⅲ（-） and ERCC-1（-） was the longest，and the survival time of β-tubulin Ⅲ（+） and ERCC-1（+） was the shortest.Conclusion：The β-tubulin Ⅲ may be involved in the growth and invasion of lung cancer.The β-tubulin Ⅲ（-） and ERCC-1（-） of patients with NSCLC may benefit from adjuvant chemotherapy based on cisplatin or paclitaxel.

【Key words】 β-tubulin Ⅲ； ERCC-1； Non-small cell lung cancer； Positive expression rate

First-authors address：Traditional Chinese Medicine Hospital of Huizhou City，Huizhou 516000，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2018.20.006

肺癌是目前世界各地中最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，且死亡率增長(zhǎng)最快，WHO肺癌居癌癥死因第一位，對(duì)人類生命健康造成嚴(yán)重威脅。其中綜合治療仍然是占比約80%的非小細(xì)胞性肺癌（NSCLC）的首選治療方式，化療占有重要地位，但5年生存率改善幅度低于5%。探究其化療效果欠佳的原因，主要為化療藥物耐藥，無(wú)法殺傷腫瘤細(xì)胞[1-3]。研究報(bào)道顯示，微管蛋白β-tubulin Ⅲ可能與紫杉醇耐藥有關(guān)，切除修復(fù)交叉互補(bǔ)基因1（ERCC-1）可能與鉑類耐藥有關(guān)[3]。本文采用回顧性研究，檢測(cè)120例非小細(xì)胞肺癌組織β-tubulin Ⅲ、ERCC-1表達(dá)情況及臨床病理特征，表達(dá)水平與生存期的相關(guān)性，為臨床提供依據(jù)，以更高制定科學(xué)合理的化療方案和預(yù)后評(píng)估手段。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2002年10月-2004年11月南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院的120例非小細(xì)胞肺癌組織標(biāo)本，均經(jīng)電子支氣管鏡活檢、經(jīng)皮肺穿或外科手術(shù)切除，作為NSCLC組，所有病例均予以順鉑或紫杉醇為主的輔助聯(lián)合化療，術(shù)前未行放化療，術(shù)后均經(jīng)病理確診為非小細(xì)胞肺癌；排除重大系統(tǒng)嚴(yán)重疾病，并傳染性疾病，不可耐受化療者。其中男67例，女25例，年齡35～79歲，平均（56.3±12.3）歲；病理分型：65例鱗癌（高分化16例，中分化26例，低分化23例），55例腺癌（高分化18例，中分化21例，低分化16例）。另外取10例NSCLC患者的距腫瘤病變>10 cm的無(wú)癌細(xì)胞浸潤(rùn)正常肺組織作為對(duì)照組，男8例，女2例。本研究已通過(guò)本院倫理委員會(huì)審批，患者均知情同意并簽署相關(guān)同意書。術(shù)后隨訪時(shí)間3～5年。

1.2 試劑 即用型β-tubulin抗體購(gòu)自上海美吉生物公司，1∶200 ERCC-1抗體購(gòu)自美國(guó)Amgen生物公司，Envision試劑盒購(gòu)自美吉生物公司，兔抗人多克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Amgen生物公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法 檢測(cè)β-tubulin Ⅲ、ERCC-1表達(dá)情況：采用免疫組化染色（Envision法）。石蠟切片脫蠟和水化后，用pH 7.4的PBS沖洗，3 min/次，共3次，使用微波爐修復(fù)組織抗原，每張切片上滴加

1滴或50 μL 3%H2O2溶液于室溫孵育10 min，以阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶。PBS沖洗，3 min/次，共3次，甩去PBS液，每張切片上滴加1滴或50 μL的第一抗，于室溫孵育60 min。PBS沖洗，3 min/次，共

5次，甩去PBS液，每張切片上滴加1滴或50 μL聚合物增強(qiáng)劑（試劑A），于室溫孵育，20 min。PBS沖洗，3 min/次，共3次，甩去PBS液，每張切片加1滴或50 μL酶標(biāo)抗鼠/兔聚合物（試劑B），在室溫下孵育30 min，PBS沖洗，3 min/次，共3次，甩去PBS液，每張切片上加2滴或100 μL新鮮配制的DAB后，于顯微鏡下觀察3～10 min，若顏色為紅或棕色，為陽(yáng)性。然后用蒸餾水沖洗，添加蘇木素復(fù)染，0.1%鹽酸分化，用自來(lái)水沖洗，PBS沖洗返藍(lán)。將梯度的酒精脫水干燥，中性樹(shù)膠封片。以PBS為陰性對(duì)照，病理科已有的β-tubulin、ERCC-1陽(yáng)性染色的肺癌石蠟切片為陽(yáng)性對(duì)照。

1.4 免疫組化結(jié)果判讀

1.4.1 β-tubulin Ⅲ表達(dá) 瘤細(xì)胞胞漿內(nèi)（包括瘤細(xì)胞核周）出現(xiàn)清晰的黃色著色顆粒為陽(yáng)性。并根據(jù)陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞的占比分為五等級(jí)：（1）0分為陽(yáng)性細(xì)胞<5%；（2）1分為5%≤陽(yáng)性細(xì)胞≤25%；（3）2分為26%≤陽(yáng)性細(xì)胞≤50%；（4）3分為51%≤陽(yáng)性細(xì)胞≤75%；（5）4分為陽(yáng)性細(xì)胞>75%[3]。另外染色強(qiáng)度評(píng)分：0分為無(wú)色；1分為淡黃；2分為棕黃；

3分為棕褐。陽(yáng)性細(xì)胞分值×染色強(qiáng)度分值=總分，當(dāng)總分為9～12分時(shí)為強(qiáng)陽(yáng)性（+++），6～8分時(shí)為陽(yáng)性（++），3～5分時(shí)為弱陽(yáng)性（+），1～2分時(shí)為可疑（±），0分時(shí)為陰性（-），其中（-）和（±）為陰性表達(dá)[4]。

1.4.2 ERCC-1表達(dá) 當(dāng)細(xì)胞核內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽(yáng)性，按陽(yáng)性細(xì)胞占比及染色強(qiáng)度進(jìn)行評(píng)估，陽(yáng)性細(xì)胞≥75%為強(qiáng)陽(yáng)性（+++），50%≤陽(yáng)性細(xì)胞≤74%為陽(yáng)性（++），25%≤陽(yáng)性細(xì)胞≤49%為弱陽(yáng)性（+），陽(yáng)性細(xì)胞<25%為陰性（-）[5]。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，計(jì)數(shù)資料以率（%）表示，比較采用字2檢驗(yàn)或Fisher精確檢驗(yàn)，使用單因素生存分析，采用Kaplan-Meier生存曲線和Log-rank檢驗(yàn)。當(dāng)P<0.05時(shí)表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 β-tubulin Ⅲ、ERCC-1在NSCLC和正常肺組織中的表達(dá) β-tubulin Ⅲ在NSCLC細(xì)胞漿內(nèi)陽(yáng)性表達(dá)率為73.3%（88/120）；低分化癌中大部分以陰性和弱陽(yáng)性表達(dá)，黃染大部分較淺。β-tubulin Ⅲ

在正常肺組織中陽(yáng)性表達(dá)率為100%（10/10），β-tubulin Ⅲ在NSCLC的陽(yáng)性表達(dá)率小于正常肺組織，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。ERCC-1在NSCLC細(xì)胞核內(nèi)陽(yáng)性表達(dá)率為40.0%（48/120），其中8例為強(qiáng)陽(yáng)性；ERCC-1在正常肺組織中ERCC-1陽(yáng)性表達(dá)率為0，即全陰表達(dá)；ERCC-1在NSCLC的陽(yáng)性表達(dá)率明顯大于正常肺組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（字2=6.335，P<0.05）。見(jiàn)表1和圖1、2。

2.2 β-tubulin Ⅲ、ERCC-1在NSCLC中的表達(dá)情況與臨床病理參數(shù)的關(guān)系 β-tubulin Ⅲ、ERCC-1在NSCLC中的表達(dá)與性別、年齡、組織學(xué)類型、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均無(wú)顯著相關(guān)性（P>0.05），β-tubulin Ⅲ在NSCLC中的表達(dá)與分化程度顯著相關(guān)（P<0.05），ERCC-1在NSCLC中的表達(dá)與分化程度相關(guān)性（P>0.05），見(jiàn)表2。

2.3 β-tubulin Ⅲ、ERCC-1在NSCLC中的共同表達(dá)和生存期的關(guān)系 在120例NSCLC中，中位生存期

<5年的：β-tubulin Ⅲ（-）、ERCC-1（-）15例（12.5%），β-tubulin Ⅲ（+）、ERCC-1（-）41例（34.2%），β-tubulin Ⅲ（-）、ERCC-1（+）37例（30.8%），β-tubulin Ⅲ（+）、ERCC-1（+）27例（22.5%）。

3 討論

相關(guān)研究顯示，細(xì)胞骨架蛋白的異常表達(dá)及分布可能與腫瘤化生中細(xì)胞病理表型及病理生理過(guò)程相關(guān)[6-7]，其中β-tubulinⅢ表達(dá)在細(xì)胞漿內(nèi)，ERCC-1表達(dá)在細(xì)胞核內(nèi)。本研究結(jié)果顯示，β-tubulinⅢ在NSCLC中的表達(dá)低于正常肺組織，低分化癌中大部分以陰性和弱陽(yáng)性表達(dá)，β-tubulinⅢ在正常肺組織中全陽(yáng)性表達(dá)。這提示，β-tubulinⅢ的表達(dá)下調(diào)可能與肺癌的生長(zhǎng)、侵襲有關(guān)，可能是包含MDR基因在內(nèi)的癌細(xì)胞基因突變，改變了內(nèi)部核酸序列及酶，使β-tubulin在NSCLC中的表達(dá)情況與正常組織有異[8-12]；并且β-tubulinⅢ具有一定的生理保護(hù)作用，可防御化學(xué)致癌物及毒素[13-15]；β-tubulinⅢ的表達(dá)與組織學(xué)類型無(wú)關(guān)，提示β-tubulinⅢ與臨床分期無(wú)關(guān)，不是惡變的特征，腫瘤的浸潤(rùn)程度不能代表耐藥性的差異[16]。

目前，臨床認(rèn)為β-tubulin是多種化療藥物的作用靶點(diǎn)，其中包括紫杉類，而紫杉類耐藥主要是因?yàn)棣?tubulin過(guò)度表達(dá)。因此，臨床上晚期NSCLC仍以含鉑方案化療為主。順鉑主要通過(guò)與細(xì)胞DNA雙鏈耦合形成加合物或形成鏈間交叉連接，抑制DNA復(fù)制，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。順鉑耐藥機(jī)制包括減少細(xì)胞毒的鉑-DNA復(fù)合物形成，以及鉑-DNA復(fù)合物形成后防止細(xì)胞死亡[17]，為內(nèi)源性或獲得性耐藥。而ERCC-1是核苷酸切除修復(fù)系統(tǒng)（NER）中DNA損傷識(shí)別和鏈間切割的關(guān)鍵成分[18]。而NER存在于大腸桿菌中，是修復(fù)DNA損傷的重要途徑，包含XPC-HHRAD23、XPA、RPA、DNA連接酶等基因，其中ERCC-1為損傷堿基5′-3′的切割酶，尤其重要，可識(shí)別損傷DNA5′，缺失ERCC-1的細(xì)胞組織無(wú)法修復(fù)順鉑所致的DNA損傷[19-20]。

目前多數(shù)報(bào)道表明，ERCC-1與臨床療效多為負(fù)性相關(guān)。本研究結(jié)果顯示，β-tubulin、ERCC-1在NSCLC中的表達(dá)與性別、年齡無(wú)關(guān)，在中-高分化肺癌中表達(dá)大于低分化。這提示，肺癌耐藥的發(fā)生與性別、年齡無(wú)關(guān)，低分化的肺癌在對(duì)抗癌藥物的耐藥性，其耐藥性會(huì)下降，與臨床的化療敏感現(xiàn)象相符。

綜上所述，β-tubulinⅢ可能參與介導(dǎo)肺癌的生長(zhǎng)、侵襲，β-tubulinⅢ（-）、ERCC-1（-）的NSCLC患者可能從以順鉑或紫杉醇為主的輔助聯(lián)合化療中受益。

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（收稿日期：2018-04-08） （本文編輯：張爽）