TGFβ/BMPs信號通路相關(guān)基因在運動干預(yù)骨重塑中的研究

楊永杰 高麗 章嵐

摘 要：目的：研究水平跑臺訓(xùn)練后生長期大鼠PBMCs中TGFβ/BMPs信號途徑的Hes1、Gpnmb、Col1a1、 Mmp8、Mitf、Smad7和Klf4mRNA表達水平，探索上述基因表達變化與骨重塑狀態(tài)的關(guān)系。方法：24只2月齡SD雄性大鼠隨機分成對照組和運動組，每組各12只。運動組以25 m/min， 50 min/d，5 d/w水平運動12 w。訓(xùn)練結(jié)束后測量離體大鼠脛骨BMD及骨形態(tài)；用QRT-PCR檢測PBMCs中Hes1、Gpnmb、Col1a1、Mmp8、Mitf、Smad7和Klf4mRNA表達。結(jié)果：與對照組相比，運動后大鼠脛骨的長度和近端BMD、BMC及厚度變化均無統(tǒng)計學(xué)意義。而PBMCs中Hes1、Gpnmb和Col1a1 mRNA表達上調(diào)，Mmp8 mRNA表達下調(diào)，Mitf、Smad7和Klf4表達未發(fā)生顯著變化。結(jié)論：運動后PBMCs中Hes1、Gpnmb、Col1a1、Mmp8、Mitf、Smad7和Klf4 mRNA表達變化能比較敏感地反映骨重塑狀態(tài)，提示上述基因可作為反應(yīng)運動對骨重塑影響的候選分子標(biāo)記。

關(guān)鍵詞：生長期大鼠；跑臺運動；PBMCs；骨重塑；TGFβ/BMPs

中圖分類號：G804.7 文獻標(biāo)識碼：A 文章編號：1006-2076（2018）02-0070-05

Abstract：Objective： To explore the involvement of the TGFβ/BMPs pathway related genes Hes1， Gpnmb， Col1a1， Mmp8， Mitf， Smad7 and Klf4 of peripheral blood mononuclear cells （PBMCs） in growing rats with treadmill training， thus to uncover the relationship between the Genes and bone remodeling caused by exercise. Methods： Two-month-old male Sprague-Dawley （SD） rats were randomly divided into two groups： control group （n=12） and exercise group（n=12）. The rats in the exercise group received leveling treadmill running treatment 5 days per week for 12 weeks according to the exercise regimen consisted of running at 25 m/min for 50 min each day. The final training was finished. Then the bone mineral density （BMD） and the morphological change of tibia was measured. PBMCs was harvested， and the mRNA expression of Hes1， Gpnmb， Col1a1， Mmp8， Mitf， Smad7 and Klf4 in PBMCs were detected. Results： Compared with the control group， no effect was found on the BMD and the morphological change of the tibia in exercise group. While the treadmill training up-regulated the Hes1， Gpnmb and Col1a1 mRNA transcription， down-regulated the Mmp8 transcripts， but had no effect on Mitf， Smad7 and Klf4 transcription. Conclusion： The mRNA transcript alteration of genes Hes1， Gpnmb， Col1a1， Mmp8， Mitf， Smad7 and Klf4 in PBMCs was more sensitive to exercise， and these genes may serve as molecular marker candidates for bone remodeling.

Key words：growing rats； treadmill； PBMCs； bone remodeling； TGFβ/BMPs

青春期適當(dāng)?shù)剡\動可提高峰值骨量，預(yù)防骨質(zhì)疏松，但運動不當(dāng)則不利于健骨。運動對骨密度和骨量的影響在短期內(nèi)不易檢測到，故對骨密度和骨量的檢測不利于快速有效科學(xué)地指導(dǎo)健骨運動。顯示骨密度和股形態(tài)的測定指標(biāo)在運動干預(yù)骨重塑中靈敏度低，反映骨代謝的分子標(biāo)記可及時監(jiān)測運動干預(yù)骨代謝的變化，但在機械應(yīng)力下能反映骨代謝的分子標(biāo)記尚待研究。β轉(zhuǎn)化生長因子（transforminggrowth factor-beta，TGF-β）/骨形態(tài)發(fā)生蛋白（bone morphogenetic proteins，BMPs）信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑在骨代謝過程中發(fā)揮著極其重要的作用[1]。轉(zhuǎn)錄抑制因子（Hairyand enhancer of split homolog-1，Hes1）[2]、非轉(zhuǎn)移性黑色素瘤糖蛋白B （Glycoproteinnonmetastaticmelanomaprotein b，Gpnmb） 基因及其蛋白Osteoactivin（OA）[3]、Col1a1[4]、基質(zhì)金屬蛋白酶8（matrix metalloproteinase，Mmp8）[5]、小眼畸形相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子（Microphthalmia-associated transcription factor，Mitf）[6]、Smad7[7]和Krüppel樣因子4 （Kruppel-like factor 4，Klf4）[8-9]參與TGFβ/BMPs信號途徑，對骨重塑起作用。

外周血單個核細胞 （peripheral blood mononuclear cells，PBMCs）主要指淋巴細胞和單核細胞，均參與骨代謝過程調(diào)節(jié)[10-11]。先前我們已對PBMCs中wnt信號途徑相關(guān)骨重塑基因進行了報道[12]。有關(guān)運動對PBMCs中TGFβ/BMPs信號途徑骨代謝相關(guān)基因的影響尚未見報道。骨重塑是個復(fù)雜過程，TGF-β/ BMPs信號途徑與WNT信號途徑在骨重塑中有交互作用。研究PBMCs中TGF-β/ BMPs信號途徑中作用，為研究運動后不同信號對骨重塑的調(diào)節(jié)具有重要意義。

山東體育學(xué)院學(xué)報第34卷第2期2018年4月 楊永杰，等 TGFβ/BMPs信號通路相關(guān)基因在運動干預(yù)骨重塑中的研究No.2 2018本文對2月齡雄性SD大鼠進行12周跑臺訓(xùn)練，觀察其脛骨骨密度及形態(tài)學(xué)變化，并分離PBMCs以檢測TGFβ/BMPs信號途徑相關(guān)基因Hes1、Gpnmb、Col1a1、 Mmp8、Mitf、Smad7和Klf4的mRNA表達變化，為運動健骨提供理論依據(jù)。

1 研究對象與方法

1.1 研究對象

24只2月齡雄性SD大鼠，體重247.9±8.0克（中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實驗動物研究所）。單籠飼養(yǎng)，自由飲食，環(huán)境溫度24℃±2℃，相對濕度55%±5%，每天保持12 h光照。適應(yīng)性喂養(yǎng)后被隨機分為對照組（n=12）和運動組（n=12）。

1.2 研究方法

1.2.1 運動方案

對照組大鼠自然籠養(yǎng)，運動組大鼠在動物跑臺上進行水平跑訓(xùn)練12 w，5 d/w。運動從第1周10 m/min，10 min/d開始到第4周最后逐漸增加到25 m/min，50 min/d。5～12周維持25 m/min，50 min/d這一強度[12]。

1.2.2 脛骨的獲取、脛骨形態(tài)測量和骨密度檢測

最后一次運動訓(xùn)練結(jié)束24 h后，乙醚麻醉大鼠，剝離脛骨，測量脛骨長度、近端厚度與寬度（精確到0.02 mm）。用DEXA、XR-600骨密度儀檢測離體脛骨的近端骨密度，檢測如圖1所示。

1.2.3 外周血液PBMCs獲取、總RNA的提取和QRT-PCR檢測

腹主動脈取血。同組的隨機5只大鼠血液等量充分混合以平衡個體差異，每組分別取2 ml血液，按照大鼠外周血液單個核細胞分離液（GE healthcare）試劑盒說明分離PBMCs。利用總RNA提取試劑盒（OMEGA）提取總mRNA，純化后質(zhì)檢（A260/A280≥1.90；總量≥1 μg）。用Primer5.0軟件設(shè)計引物（見表1），以β-Actin作為參照，取純化后總RNA（500 ng）用SYBR-Green （Roche）在實時定量PCR儀（Bio-Rad）進行QRT-PCR。

1.2.4 統(tǒng)計學(xué)分析

形態(tài)學(xué)數(shù)據(jù)用spss11.1中獨立樣本t檢驗進行分析，所有數(shù)據(jù)采用mean±SD表示， 以P<0.05為差異顯著。QRT-PCR擴增的mRNA水平用2 - △△CT表示， 2 - △△CT值>2（或<0.5）為表達具有顯著性差異。

2 研究結(jié)果

2.1 跑臺訓(xùn)練結(jié)束后大鼠脛骨骨密度及其形態(tài)的比較

由表2可知：12周水平跑臺訓(xùn)練后，與對照組相比，運動訓(xùn)練后大鼠脛骨長度及脛骨近端厚度、寬度和BMD變化倍數(shù)分別為1.00、0.98、1.00和1.01，變化都不具有統(tǒng)計學(xué)意義。上述結(jié)果表明該強度的持續(xù)耐力運動對健康生長期雄性大鼠脛骨的BMD及脛骨形態(tài)影響不大。

2.2 QRT-PCR檢測Hes1、Gpnmb、Col1a1、 Mmp8、Mitf、Smad7和Klf4基因mRNA的表達變化

對照組和運動組PBMCs中Hes1、Gpnmb、Col1a1、Mmp8、Mitf、Smad7和Klf4的mRNA表達QRT-PCR檢測結(jié)果如表3所示。與對照組相比，運動訓(xùn)練后大鼠PBMCs中基因Hes1、Gpnmb和Col1a1的mRNA表達上調(diào)，表達變化倍數(shù)分別為2.12、4.01和5.26；基因Mmp8的mRNA表達則下調(diào)，表達變化倍數(shù)為0.22，Mitf、Smad7和Klf4的mRNA表達變化倍數(shù)分別為1.18、1.64和1.23，雖略有增加但不具有顯著性差異。其中Col1a1和Mmp8的表達倍數(shù)變化大于或等于5。

3 討論

3.1 跑臺運動對生長期大鼠脛骨的BMD及形態(tài)的影響

生長期合理的耐力運動均使骨形成增加。我們已報道在本實驗運動方案下水平跑臺訓(xùn)練后骨微結(jié)構(gòu)改善[12]，這與Ju等[13]的結(jié)論一致，即本實驗運動方案可使骨質(zhì)改善。但運動后脛骨近端骨密度和脛骨的形態(tài)沒有檢測到顯著性變化，這與我們已報到的該強度運動對整體骨密度及骨礦含量和股骨骨密度的影響結(jié)果相同[12]。這些結(jié)果揭示骨密度和骨形態(tài)等指標(biāo)的檢測靈敏度低，不利于及時反映運動對骨重塑的干預(yù)。

3.2 跑臺運動后Hes1、Gpnmb 、Col1a1、Mmp8、Mitf、Smad7和Klf4基因表達水平

經(jīng)典TGF-β/ BMPs 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑與骨重塑密切相關(guān)[14-15]；TGF-β/ BMPs通路還可與其他骨代謝相關(guān)通路如 WNT、MAPK、NOTCH、HEDGEHOG等交互作用[16]。Hes1[2]、Gpnmb[1，3] 、Col1a1[4] 和Mitf[6]是TGF-β/ BMPs 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的下游靶基因；Mmp8、Smad7和 Klf4[8-9]可調(diào)節(jié)TGF-β/ BMPs 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑[5]，它們都參與骨重塑調(diào)節(jié)。

3.2.1 跑臺運動后Hes1、Gpnmb、Col1a1和Mmp8基因表達水平的變化

Hes1是NOTCH經(jīng)典信號的重要下游靶基因[2]。Hes1調(diào)節(jié)成骨細胞分化的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子Runx2基因的轉(zhuǎn)錄活性[17]。骨髓NOTCH信號可通過抑制破骨細胞的發(fā)育抑制骨的重建 [18]。同時Hes1 也是TGF-β/BMPs信號途徑的靶基因。TGF-β/BMPs信號通路活化后上調(diào) Hes1 基因的表達 [1-2]。據(jù)公認，Gpnmb/OA在生理和病理條件下正調(diào)節(jié)成骨細胞的分化 [19-20]。OA蛋白在BMP-2的下游起作用，敲除Gpnmb可部分地減小BMP-2對成骨細胞分化和功能的效果[1，20]，OA和TGF-β1之間可能存在關(guān)聯(lián)[3]。OA也可調(diào)節(jié)破骨細胞分化和/或活性，是破骨細胞分化和存活的負調(diào)節(jié)物[21]，但抗體中和抑制OA的功能可降低破骨細胞的細胞大小、細胞核數(shù)量、融合和骨吸收活性 [22]。Gpnmb突變或OA被抗體阻斷會抑制破骨細胞的功能，降低骨轉(zhuǎn)換 [3]。Col1a1是成骨細胞的特異性基因[23]，編碼Ⅰ型膠原，促進骨形成 [24]。在間充質(zhì)細胞、前成骨細胞和成骨細胞中均可檢測到Col1a1表達。I型膠原在TGF-β與受體結(jié)合后合成增加，參與骨和軟骨的合成。Mmp8是 Mmps家族中的成員，其蛋白MMP8對I型膠原和 II 型膠原有很強的降解作用。MMP8通過調(diào)節(jié)纖調(diào)蛋白（整合素）的降解調(diào)節(jié)TGF-β/ BMPs 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑[5]。MMP8抑制造血干細胞和祖細胞遷移及粘附于成骨細胞[29]。

據(jù)研究I型膠原al鏈基因?qū)ψ兓膽?yīng)力刺激非常敏感，新生的成骨細胞敏感度高[25]，如沖擊波誘導(dǎo)新骨形成時成骨細胞中Col1a1表達增加 [26]。當(dāng)受到BMP-2和機械負荷刺激時成骨細胞提高Col1a1表達[27-28]，并釋放PGE2以響應(yīng)機械負載。適度的運動強度可以促進骨膠原形成，大強度運動則可使膠原纖維出現(xiàn)斷裂。跑臺運動后24 h我們檢測到PBMCs中Col1a1的mRNA表達增加，這與已有報到一致[27-28]。Mmp8的表達受應(yīng)力刺激的影響。體外實驗表明周期性張應(yīng)力可誘導(dǎo)牙周膜細胞中Mmp8表達增強 [30]。在我們的運動模型中，與對照組相比，運動后24 h大鼠PBMCs中Mmp8的mRNA表達下降，而同時Col1a1表達升高，提示運動訓(xùn)練24 h后，成骨作用增強，這也與已有的骨微結(jié)構(gòu)研究相符[12-13]。同時我們還檢測到Hes1和Gpnmb基因的mRNA表達增加，表明骨轉(zhuǎn)換增加，且機體內(nèi)環(huán)境有利于骨形成。這與已有對運動訓(xùn)練后骨微結(jié)構(gòu)的變化報道相符[12-13]。目前對應(yīng)力刺激下骨組織和PBMCS中Hes1和Gpnmb表達的變化尚未見報道。

3.2.2 跑臺運動后Mitf、Smad7和Klf4基因表達水平的變化

MITF可能是破骨細胞功能和骨吸收的主要調(diào)節(jié)劑[6]，調(diào)節(jié)破骨細胞晚期分化。TGF-β增強RANKL誘導(dǎo)的Mitf表達的水平。Mitf通過調(diào)節(jié)破骨細胞吸收功能至關(guān)重要的基因（如Trap，組織蛋白酶K和Ostm1等）的表達，促進破骨細胞的分化。SMAD7是TGF-β家族通用抑制劑。抑制SMAD7的表達可通過經(jīng)典和非經(jīng)典途徑促進骨形成[31]。但也有研究證明小鼠中SMAD7功能的部分喪失導(dǎo)致骨形成受損，骨吸收增強，故SMAD7被認為是成骨和破骨細胞發(fā)生之間的新型關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子[32]。KLF4抑制成骨細胞礦化，并在體內(nèi)和體外調(diào)節(jié)成骨基因的表達。成骨細胞轉(zhuǎn)導(dǎo)了KLF4的小鼠其破骨細胞成熟顯示嚴(yán)重的缺陷。野生型骨髓衍生巨噬細胞與表達KLF4的成骨細胞共培養(yǎng)表現(xiàn)出多核破骨細胞形成的減少。KLF4過度表達下調(diào)了成骨細胞合成和分泌的細胞外基質(zhì)分子，干擾了細胞-基質(zhì)相互作用進而影響到破骨細胞成熟[9]。有研究表明，新鮮骨折愈合過程中，KLF4蛋白與Smad7啟動子相互作用。在原發(fā)性肝癌中KLF4可通過誘導(dǎo)Smad7啟動子活性，激活Smad7轉(zhuǎn)錄來抑制致癌性TGF-β信號[8]。

在本實驗運動后24 h Mitf的mRNA表達沒有發(fā)生顯著性變化。Mitf不僅受到TGF-β信號的調(diào)節(jié)，它也是肌腱膜纖維肉瘤癌基因B型（v-maf musculoaponeurotic fibrosarcoma oncogene family protein B，Mafb）（表達變化2.11倍，未發(fā)表）調(diào)控的靶基因，受到Mafb的負調(diào)控。MAFB是破骨細胞分化的主要負調(diào)節(jié)物，獨立于TGF-β在骨發(fā)育中獨立起作用[33]。在由RANKL進行誘導(dǎo)的破骨細胞分列的過程中，Mafb表達水平下降。Mafb表達增加增強了對Mitf表達的負調(diào)控，骨重塑狀態(tài)趨向于以成骨為主，這也與已有的骨微結(jié)構(gòu)研究相符[12-13]。Mitf表達是否對機械應(yīng)力刺激敏感目前尚未見報道。

Smad7的表達對機械應(yīng)力刺激敏感。據(jù)研究Smad7在牽張成骨早期及骨組織破壞最嚴(yán)重的部位表達最高，并高于正常組織，到中晚期Smad7表達下降，其表達量與骨愈合部位骨密度成反比。但也有學(xué)者認為，Smad7在早期實際含量較基礎(chǔ)水平減少，隨后含量又不斷回升至正常水平[34]。創(chuàng)傷后瘢痕愈合中組織中Smad7較正常皮膚組織含量低，但壓應(yīng)力治療時Smad7表達上調(diào)。Klf4是不同機械剪應(yīng)力的機械生物信號感受器。在層流剪切應(yīng)力刺激人臍靜脈內(nèi)皮細胞中檢測到許多Klf的表達。 其中Klf4表達增加倍數(shù)最高，并顯示層流剪切應(yīng)力依賴性增加[35]。在血管平滑肌細胞中的研究表明機械拉伸改變Klf4蛋白表達[36]。在本實驗運動結(jié)束24 h后運動組Smad7和Klf4表達較對照組略有上升趨勢，但均未發(fā)生顯著性變化，故二者對成骨的抑制作用不明顯，也有利于骨形成，也與已有的骨微結(jié)構(gòu)研究相符[12-13]。關(guān)于水平跑臺應(yīng)力刺激后不同時間內(nèi)Smad7和Klf4表達變化趨勢有待進一步研究。

4 結(jié)論

4.1 跑臺訓(xùn)練后PBMCs中TGF-β/BMPs信號途徑相關(guān)的基因Hes1、Gpnmb、Col1a1、 Mmp8、Mitf、Smad7和Klf4 mRNA表達與本實驗強度運動利于骨質(zhì)改善相符，且與骨密度及骨形態(tài)等指標(biāo)比較，能夠更靈敏反映運動對骨重塑的影響。提示上述基因有望成為反映運動對骨重塑影響的候選分子標(biāo)記，但尚需進一步研究。

4.2 本研究對運動后PBMCs中TGF-β/BMPs信號途徑相關(guān)的基因Hes1、Gpnmb、Col1a1、 Mmp8、Mitf、Smad7和Klf4的mRNA表達與骨重塑的關(guān)系進行首次報道，也為PBMCs作為研究運動影響骨重塑的組織取材提供TGF-β/BMPs信號途徑的分子生物學(xué)依據(jù)，為研究運動后不同信號對骨重塑的調(diào)節(jié)提供參考資料。

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