褪黑素處理對(duì)采后獼猴桃果實(shí)后熟衰老的影響

胡 苗，李佳穎，饒景萍*

（西北農(nóng)林科技大學(xué)園藝學(xué)院，陜西 楊凌 712100）

獼猴桃果實(shí)是皮薄汁多的漿果，對(duì)乙烯敏感，常溫下易變軟腐爛[1]。低溫冷藏可降低獼猴桃采后的呼吸作用和內(nèi)源乙烯的生成，有利于保持生理代謝及營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的相對(duì)穩(wěn)定，從而延緩獼猴桃果實(shí)的后熟和衰老進(jìn)程，延長(zhǎng)貯藏保鮮期[2]。但是僅低溫貯藏對(duì)獼猴桃后熟軟化速度的控制效果有限，特別是中華系列品種，貯藏期和貨架期都比美味獼猴桃短，貯藏過(guò)程中更容易出現(xiàn)果實(shí)腐爛現(xiàn)象[3]。

褪黑素（melatonin，MT）是在動(dòng)植物體內(nèi)廣泛存在的一種小分子的神經(jīng)內(nèi)分泌激素，主要由松果體分泌，很長(zhǎng)一段時(shí)間內(nèi)人們都認(rèn)為MT是動(dòng)物專有的一種神經(jīng)激素[4]，1995年MT首次在植物中被發(fā)現(xiàn)[5-6]。近年來(lái)的研究表明MT具有清除植物自由基、抗氧化、抗低溫脅迫、延緩植物衰老等功能[7-9]。例如MT可以幫助黃瓜種子和幼苗清除自由基，增強(qiáng)抗氧化能力[10]。外源MT處理菘藍(lán)種子[11]和番茄幼苗[12]能降低膜脂過(guò)氧化水平，提高抗氧化酶的活力，減輕冷脅迫對(duì)幼苗生長(zhǎng)過(guò)程中的氧化損傷。Wang Ping等[13-14]發(fā)現(xiàn)外源MT能通過(guò)保護(hù)葉綠素、保護(hù)光系統(tǒng)Ⅱ、抑制衰老相關(guān)基因表達(dá)和提高抗氧化能力等，延緩黑暗誘導(dǎo)的離體葉片衰老和干旱誘導(dǎo)的蘋果葉片衰老。MT在植物根、種子、幼苗、葉片上的應(yīng)用較廣泛，但目前MT處理對(duì)采后果實(shí)的研究甚少，對(duì)采后低溫貯藏獼猴桃果實(shí)生理及品質(zhì)影響的研究還鮮見(jiàn)報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)以‘華優(yōu)’獼猴桃為試材，系統(tǒng)地研究不同濃度MT處理對(duì)低溫貯藏條件下采后獼猴桃果實(shí)成熟衰老進(jìn)程的影響，篩選出適宜濃度，以期為探索低溫貯藏條件下獼猴桃品質(zhì)變化控制的有效途徑提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

‘華優(yōu)’獼猴桃果實(shí)（可溶性固形物質(zhì)量分?jǐn)?shù)為6.5%～7.5%）于2016年10月8日采自陜西省周至縣一個(gè)管理良好的獼猴桃園。采收后運(yùn)回西北農(nóng)林科技大學(xué)園藝學(xué)院采后實(shí)驗(yàn)室，常溫下自然放置3 h散去田間熱。挑選大小、成熟度一致，且無(wú)病蟲(chóng)害、無(wú)機(jī)械損傷的果實(shí)作試材。

MT 西安熱默爾公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

3K15型高速冷凍離心機(jī) 美國(guó)Sigma公司；PAL-1手持式糖度計(jì) 日本Atago公司；7001型CO2分析儀美國(guó)Telaire公司；UV-1800型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)科大中佳公司；BCD-236DT型海爾冰箱 青島海爾股份有限公司；Trace GC Ultra型氣相色譜儀 美國(guó)Thermo Scientif i c公司；FT-327型硬度計(jì) 意大利TR公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品處理及測(cè)定指標(biāo)

將挑選后的果實(shí)隨機(jī)分成5 組，分別用0（對(duì)照）、0.05、0.10、0.20、0.50 mmol/L的MT浸泡10 min，每處理3 次重復(fù)，每重復(fù)用200 個(gè)果，然后在室溫下自然晾干，放入（0.0±0.5）℃、相對(duì)濕度（90±5）%冷庫(kù)中。在處理前隨機(jī)取45 個(gè)果進(jìn)行初值測(cè)定；之后在對(duì)照和處理組果實(shí)中每重復(fù)固定15 個(gè)果實(shí)用于測(cè)定呼吸速率和乙烯釋放速率；之后每10 d從冷庫(kù)每重復(fù)中取10 個(gè)果用于硬度和色澤的測(cè)定，同時(shí)取樣用液氮速凍后保存于-80 ℃的超低溫冰箱中；貯藏90 d后隨機(jī)取100 個(gè)果實(shí)用于統(tǒng)計(jì)質(zhì)量損失率和腐爛率，根據(jù)以上數(shù)據(jù)篩選出延緩果實(shí)衰老的適宜MT濃度，然后進(jìn)行淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)和淀粉酶、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、過(guò)氧化氫酶（catalase，CAT）、抗壞血酸過(guò)氧化物酶（ascorbate peroxidase，APX）、谷胱甘肽還原酶（glutathione reductase，GR）活力及抗壞血酸（ascorbic acid，AsA）、谷胱甘肽（glutathione，GSH）含量的測(cè)定；以上每項(xiàng)指標(biāo)重復(fù)測(cè)定3 次。

1.3.2 指標(biāo)的測(cè)定

1.3.2.1 硬度的測(cè)定

將果實(shí)赤道間隔90°的3 點(diǎn)去皮后，用FT-327型硬度計(jì)測(cè)定，探頭直徑為11 mm，單位為N。

1.3.2.2 色澤的測(cè)定

內(nèi)果皮色度用CR-400型色差計(jì)測(cè)定，將果實(shí)沿赤道橫切后測(cè)內(nèi)果皮色度，L*值代表果肉亮度，能反映果實(shí)褐變及成熟衰老程度[15]。

1.3.2.3 質(zhì)量損失率和腐爛率的測(cè)定

質(zhì)量損失率參照王瑋[16]的方法測(cè)定，具體計(jì)算見(jiàn)式（1）。

腐爛率參考王玉萍等[17]的方法測(cè)定，具體計(jì)算見(jiàn)式（2）。

1.3.2.4 呼吸速率和乙烯釋放率的測(cè)定

呼吸速率和乙烯釋放速率的測(cè)定參照董曉慶等[18]的方法，分別使用7001型CO2分析儀和Trace GC Ultra型氣相色譜儀測(cè)定，單位分別是mg/（kg·h）和μL/（kg·h）。

1.3.2.5 淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)和淀粉酶活力的測(cè)定

淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)和淀粉酶活力的測(cè)定方法均參考王強(qiáng)[19]的方法，淀粉酶活力以每15 min每克獼猴桃鮮樣中酶催化作用下產(chǎn)生的麥芽糖質(zhì)量表示，單位為mg/（g·15 min）。

1.3.2.6 SOD、CAT、APX、GR活力和AsA、GSH含量的測(cè)定

SOD活力和AsA、GSH含量測(cè)定參考曹建康等[20]的方法，以每克果肉1 min的OD560nm值變化反應(yīng)體系對(duì)氮藍(lán)四唑光化還原的50%為一個(gè)酶活力單位，單位為U/（g·min）；AsA和GSH含量的單位分別為mg/g、（U·mol）/g；CAT活力的測(cè)定參照Gao Hui等[21]的方法，以每克果肉1 min OD240nm值變化0.01 為一個(gè)酶活力單位，單位為U/（g·min）。

APX活力參照Nakano等[22]的方法并修改，以每分鐘反應(yīng)體系在290 nm波長(zhǎng)處吸光度減少0.01所需酶量為1 個(gè)酶活力單位，單位為U/（g·min）；GR活力的測(cè)定參照Halliwell等[23]的方法并修改，以每分鐘反應(yīng)體系在340 nm波長(zhǎng)處吸光度減少0.01所需酶量為1 個(gè)酶活力單位，單位為U/（g·min）。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2007軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，并用SigmaPlot 12.5軟件制圖，用SPSS 20.0軟件的單因素方差分析進(jìn)行顯著性比較，檢驗(yàn)的顯著性概率臨界值為0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 MT處理對(duì)冷藏獼猴桃果實(shí)硬度和色澤的影響

圖 1 MT處理對(duì)獼猴桃果實(shí)冷藏期間硬度（A）和L*值（B）的影響Fig. 1 Effect of melatonin treatment on firmness (A) and L* value (B)of kiwifruits during cold storage

由圖1A可知，隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，不同濃度MT處理組的獼猴桃果實(shí)硬度持續(xù)下降，果實(shí)硬度下降過(guò)程有兩個(gè)明顯階段，前50 d呈現(xiàn)快速下降，在50 d后，硬度下降速度變緩。在前60 d時(shí)，0.50 mmol/L MT處理組的獼猴桃硬度最小，后30 d時(shí)對(duì)照組的最小，而在整個(gè)貯藏過(guò)程中，0.10 mmol/L MT處理組的獼猴桃硬度下降最緩慢；貯藏90 d時(shí)，對(duì)照組的果實(shí)硬度顯著低于MT處理組（P＜0.05），且0.10 mmol/L MT處理組顯著高于其他濃度處理組。

L*值的下降可以直觀地反映果實(shí)在貯藏過(guò)程中由于色素聚集或是酶促褐變所引起的果肉變暗的程度，L*值越低，代表褐變?cè)絿?yán)重，果實(shí)衰老進(jìn)程越快。如圖1B所示，在不同處理?xiàng)l件下，L*值都隨貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)而持續(xù)下降，由此可見(jiàn)，獼猴桃果肉褐變情況隨貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)而加重。在貯藏后期，對(duì)照組L*值顯著低于0.10 mmol/L和0.20 mmol/L處理組（P＜0.05）；所以，0.10 mmol/L和0.20 mmol/L MT處理對(duì)果肉褐變的抑制作用最明顯。

2.2 MT處理對(duì)冷藏獼猴桃果實(shí)質(zhì)量損失率和腐爛率的影響

圖 2 MT處理對(duì)獼猴桃果實(shí)冷藏90 d后的質(zhì)量損失率（A）和腐爛率（B）的影響Fig. 2 Effect of melatonin treatment on mass loss percentage (A) and decay incidence (B) of kiwifruits after cold storage for 90 days

獼猴桃果實(shí)采收后，失水、物質(zhì)代謝會(huì)使其質(zhì)量減少，且貯藏過(guò)程中果實(shí)的失水情況直接關(guān)系到果實(shí)的新鮮度。由圖2A可見(jiàn)，在貯藏90 d時(shí)，對(duì)照組的質(zhì)量損失率最高，達(dá)到1.65%，而0.05、0.10、0.20、0.50 mmol/L MT處理組的質(zhì)量損失率分別比對(duì)照組果實(shí)降低了24.8%、34.5%、18.1%、12.7%。由圖2B可知，貯藏90 d后對(duì)照組果實(shí)的腐爛率為8.64%，而0.05、0.10、0.20、0.50 mmol/L MT處理組的腐爛率分別為4.58%、3.36%、5.69%和7.31%，與對(duì)照組差異顯著（P＜0.05）。所以，0.10 mmol/L MT處理更有效地抑制了果實(shí)水分的散失和腐爛，較好地保持了果實(shí)的品質(zhì)，延緩了果實(shí)衰老。

2.3 MT處理對(duì)冷藏獼猴桃果實(shí)呼吸速率和乙烯釋放率的影響

由圖3A可以看出，低溫貯藏能夠很好控制果實(shí)呼吸強(qiáng)度，從常溫移入冷庫(kù)后，在貯藏前10 d的過(guò)程中，獼猴桃呼吸強(qiáng)度迅速下降，對(duì)照組和0.05、0.10、0.20、0.50 mmol/L MT處理組的呼吸強(qiáng)度分別降低了8.9%、14.5%、19.9%、21.3%、22.7%。此后，不同處理組的呼吸強(qiáng)度變化趨勢(shì)相似，呈現(xiàn)貯藏10～20 d時(shí)快速上升，20 d后平緩下降，呼吸高峰出現(xiàn)在貯藏20 d左右，MT處理組果實(shí)呼吸速率峰值顯著低于對(duì)照組（P＜0.05）。除0.05 mmol/L MT處理之外，其他3 個(gè)濃度處理對(duì)呼吸速率抑制均比較明顯，但差異不顯著。

由圖3B可以看出，獼猴桃果實(shí)在低溫條件下，初期乙烯釋放很少，大約到貯藏30 d 時(shí)，對(duì)照組出現(xiàn)明顯乙烯高峰，之后迅速下降；MT處理組果實(shí)乙烯釋放速率與對(duì)照組呈現(xiàn)相同趨勢(shì)，但是乙烯高峰出現(xiàn)比對(duì)照組推遲了10 d左右，且乙烯峰值低于對(duì)照組20%～60%，這表明MT處理抑制了果實(shí)乙烯的生成。各處理中，0.10 mmol/L MT處理對(duì)乙烯釋放的抑制效果最顯著（P＜0.05），在整個(gè)貯藏過(guò)程中乙烯釋放率最低。

由以上所示結(jié)果可見(jiàn)，相比其他濃度M T，0.10 mmol/L對(duì)延緩獼猴桃果實(shí)衰老進(jìn)程的效果最好，因此，以下的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，均以0.10 mmol/L MT處理組與對(duì)照組進(jìn)行比較。

圖 3 MT處理對(duì)獼猴桃果實(shí)冷藏期間呼吸速率（A）和乙烯釋放速率（B）的影響Fig. 3 Effect of melatonin treatment on respiration rate (A) and ethylene production rate (B) of kiwifruits during cold storage

2.4 MT處理對(duì)冷藏獼猴桃果實(shí)淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)和淀粉酶活力的影響

果實(shí)的淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)在冷藏期間持續(xù)下降，在0～50 d下降速率較快，之后變化緩慢，后期穩(wěn)定在較低水平，而在整個(gè)貯藏過(guò)程中對(duì)照組果實(shí)淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著低于處理組果實(shí)（圖4A）。由圖4B可看出，對(duì)照組和MT處理組的淀粉酶活力在貯藏0～10 d時(shí)均下降，10 d后總體均呈先升高后降低的趨勢(shì)。對(duì)照組和MT處理組淀粉酶活力分別在貯藏30 d和40 d時(shí)達(dá)到高峰，但處理組的峰值比對(duì)照組降低了15.5%；且在整個(gè)貯藏期間MT處理組的酶活力顯著低于對(duì)照組（P＜0.05）。

圖 4 MT處理對(duì)獼猴桃果實(shí)冷藏期間淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)（A）和淀粉酶活力（B）的影響Fig. 4 Effect of melatonin treatment on starch content (A) and amylase activity (B) of kiwifruits during cold storage

2.5 MT處理對(duì)冷藏獼猴桃果實(shí)SOD和CAT活力的影響

圖 5 MT處理對(duì)獼猴桃果實(shí)冷藏期間SOD（A）和CAT（B）活力的影響Fig. 5 Effect of melatonin treatment on SOD (A) and CAT (B) activity of kiwifruits during cold storage

從圖5A中可以看出，MT處理組與對(duì)照組果實(shí)SOD活力的變化趨勢(shì)基本一致，剛?cè)肜鋷?kù)時(shí)活力處于較低水平，之后呈迅速上升的趨勢(shì)，處理組和對(duì)照組均在貯藏40 d時(shí)達(dá)到高峰，然后下降，但處理組果實(shí)的SOD活力高峰比對(duì)照組高13.05%，且貯藏10 d后，MT處理組果實(shí)SOD活力一直顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）。圖5B顯示，獼猴桃果實(shí)的CAT活力在開(kāi)始時(shí)較低，隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸上升，MT處理組和對(duì)照組果實(shí)在采后第40天CAT活力均達(dá)到高峰，之后又下降，但處理組的CAT活力峰值高于對(duì)照組17.6%，二者差異顯著（P＜0.05）。

2.6 MT處理對(duì)冷藏獼猴桃果實(shí)AsA和GSH含量的影響

如圖6A所示，對(duì)照組和MT處理組獼猴桃果實(shí)的AsA含量在貯藏期間呈先下降后上升再下降的趨勢(shì)，且在貯藏10 d后，處理組果實(shí)的AsA含量一直顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）。由圖6B可看出，對(duì)照組和MT處理組果實(shí)的GSH含量在貯藏期間變化趨勢(shì)基本一致，即在貯后不斷上升，于40 d時(shí)達(dá)到高峰，而后開(kāi)始下降，且在整個(gè)貯藏過(guò)程中，與對(duì)照組相比，MT處理顯著提高了獼猴桃果實(shí)的GSH含量（P＜0.05）。

圖 6 MT處理對(duì)獼猴桃果實(shí)冷藏期間AsA（A）和GSH（B）含量的影響Fig. 6 Effect of melatonin treatment on the contents of AsA (A) and GSH (B) content in kiwifruits during cold storage

2.7 MT處理對(duì)冷藏獼猴桃果實(shí)APX和GR活力的影響

圖 7 MT處理對(duì)獼猴桃果實(shí)冷藏期間APX（A）和GR（B）活力的影響Fig. 7 Effect of melatonin treatment on APX (A) and GR (B) activity of kiwifruits during cold storage

如圖7A所示，對(duì)照組和MT處理組獼猴桃果實(shí)的APX活力在貯藏后急劇升高并在第20天達(dá)到高峰，此時(shí)MT處理組果實(shí)APX活力比對(duì)照組高7.2%；且在此后MT處理組果實(shí)的APX活力也一直顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）。由圖7B可看出，對(duì)照組和MT處理組果實(shí)的GR活力在貯藏期間變化趨勢(shì)基本一致，即在貯后前期不斷上升，于40 d時(shí)達(dá)到高峰，而后開(kāi)始下降。自30 d后，整個(gè)貯藏期間MT處理顯著提高了獼猴桃果實(shí)的GR的活力（P＜0.05）。

3 討 論

蔡慧[24]、郭葉[25]、李盼盼[26]、康孟利[27]等研究表明，在低溫貯藏條件下，獼猴桃果實(shí)衰老伴隨著果實(shí)硬度和色度的下降，質(zhì)量損失率和腐爛率的上升，以及呼吸高峰和乙烯釋放高峰的出現(xiàn)。在本實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，在對(duì)照組與處理組的乙烯釋放增加時(shí)期，果實(shí)硬度迅速下降，因此乙烯的釋放加速了果實(shí)軟化；與對(duì)照相比，0.10 mmol/L MT處理延緩了乙烯釋放高峰的出現(xiàn)，并降低了其和呼吸高峰的峰值，更有效地延緩了硬度和色度的下降，降低了質(zhì)量損失率和腐爛率的發(fā)生。這些結(jié)果表明0.10 mmol/L MT處理延緩了獼猴桃果實(shí)的衰老，提高了果實(shí)的品質(zhì)。MT是松果體中產(chǎn)生的一種吲哚胺類分子，具有調(diào)節(jié)睡眠、延緩衰老、調(diào)節(jié)免疫、抑制腫瘤等多項(xiàng)生理功能，被認(rèn)為是一種具有廣泛應(yīng)用前景的生物激素，已被美國(guó)食品藥物管理局批準(zhǔn)，可作為膳食補(bǔ)充劑使用，我國(guó)衛(wèi)生部也批準(zhǔn)MT可應(yīng)用于保健品中[28]；因此，在獼猴桃上使用限定濃度的MT處理也是安全健康的。MT在植物體內(nèi)可能起到類似于生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的生理功能，低濃度促進(jìn)植物生長(zhǎng)，高濃度抑制生長(zhǎng)。Murch[29]、Sarropoulou[30]等研究表明改變植物體內(nèi)的MT濃度會(huì)對(duì)根的生長(zhǎng)發(fā)育產(chǎn)生影響，低濃度可以促進(jìn)側(cè)根以及不定根的生長(zhǎng)，高濃度則抑制。Posmyk等[31]研究發(fā)現(xiàn)低濃度的MT溶液可以明顯提高種子萌發(fā)率，高濃度則是抑制效果。包宇[32]以番茄幼苗為對(duì)象進(jìn)行實(shí)驗(yàn)時(shí)，發(fā)現(xiàn)以100～150 μmol/L MT處理的低溫保護(hù)效果較好；而在250 μmol/L時(shí)，各項(xiàng)生長(zhǎng)生理指標(biāo)都顯著低于對(duì)照組，說(shuō)明高濃度的處理反而加重低溫傷害。本實(shí)驗(yàn)中，0.10 mmol/L MT起到的促進(jìn)作用更好，0.05 mmol/L和0.20 mmol/L MT起到的促進(jìn)作用非常接近，次于0.10 mmol/L，而0.50 mmol/L MT的促進(jìn)作用不顯著。因此，在對(duì)采后獼猴桃進(jìn)行處理實(shí)驗(yàn)時(shí)，MT濃度的選擇很重要?，F(xiàn)階段MT在植物種子、幼苗上的研究較多，在果實(shí)上的研究卻鮮有報(bào)道，其中在植物油菜葉片[33]、水稻葉片[34]、擬南芥葉片[35]上，也證明了MT具有延緩衰老的作用；在果實(shí)中，Gao Hui等[21]研究表明0.1 mmo/L MT處理具有延緩桃果實(shí)衰老的作用。而在孫倩倩[36]的研究中發(fā)現(xiàn)外源MT處理綠熟期番茄果實(shí)后，能夠促進(jìn)番茄果實(shí)的成熟，并能提高其品質(zhì)，這可能與不同成熟期的不同物種所受MT影響不同有關(guān)。

淀粉酶催化淀粉水解，有學(xué)者研究獼猴桃果實(shí)軟化衰老時(shí)發(fā)現(xiàn)，淀粉的降解是獼猴桃果實(shí)軟化衰老的主要原因之一[37]。本實(shí)驗(yàn)0.1 mmol/L MT處理降低了淀粉酶活力，從而減少了淀粉的降解，延緩了果實(shí)的衰老。Wang Ping等[38]研究表明MT可以通過(guò)提高植物葉片的淀粉、蔗糖等光合產(chǎn)物的代謝變化延緩植物衰老。研究表明，衰老的獼猴桃伴隨著自由基水平的升高[39]；而果實(shí)體內(nèi)可以通過(guò)SOD、CAT和AsA-GSH循環(huán)系統(tǒng)的作用降低活性氧對(duì)自身的傷害作用[40]。AsA-GSH是果實(shí)體內(nèi)直接清除活性氧的酶促系統(tǒng)，APX和GR是此系統(tǒng)的關(guān)鍵酶，可以保持果實(shí)體內(nèi)抗氧化物質(zhì)AsA和GSH的平衡[41]；而MT是一個(gè)自由基清除劑和廣譜的抗氧化劑[42]。Wang Ping等[43]通過(guò)研究不僅發(fā)現(xiàn)MT顯著提高了SOD和CAT活力，其研究結(jié)果也表明了MT是參與調(diào)控AsA-GSH循環(huán)系統(tǒng)的關(guān)鍵酶，如提高APX活力和GR活力。

綜上所述，0.1 mmol/L MT處理可以降低乙烯釋放速率和呼吸強(qiáng)度，推遲乙烯釋放高峰，降低淀粉酶活力，提高抗氧化酶SOD、APX、GR等的活力，提高CAT活力峰值，提高AsA和GSH的含量，延緩淀粉的降解和果實(shí)硬度下降，從而延緩了獼猴桃果實(shí)的后熟衰老進(jìn)程。