3 種木耳多糖的抗氧化活性與抑菌能力比較分析

羅敬文，司風(fēng)玲,*，顧子玄，王林玲，孟秀秀

（1.重慶師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，重慶 401331；2.江南大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室，江蘇 無錫 214122；3.食藥用菌教育部工程研究中心，吉林 長春 130118）

木耳屬（Auricularia）真菌是世界第三大栽培食用菌，目前該屬中共計木耳種類15 種[1-3]。我國是對其進行開發(fā)利用最早的國家，早在唐代即有“蕈爾”之說[4]。時至今日，我國的木耳產(chǎn)量占世界總產(chǎn)量的96%[5]，且因木耳口感爽脆、營養(yǎng)豐富[6]，成為我國傳統(tǒng)的出口產(chǎn)品。我國栽培與食用的絕大多數(shù)為黑木耳（Auricularia auricula）與毛木耳（Auricularia polytricha）[7]。由此可見木耳這一食用菌的遺傳背景單一，長此以往會導(dǎo)致其產(chǎn)量與品質(zhì)的下降[8]。因此，我國的專家學(xué)者仍在進行著木耳變異菌株的栽培馴化、開發(fā)利用。吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)李玉院士團隊研究獲得的珍稀食用菌——玉木耳（Auricularia cornea var. Li），其正是從毛木耳菌株中分離純化、馴化栽培而形成的遺傳結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、天然純白色變異菌株[9]。

據(jù)報道，木耳之所有具有良好的藥用價值，與其富含的多糖類物質(zhì)密切相關(guān)[10-11]。木耳多糖具備降血糖、降血脂、抗炎癥、抗腫瘤以及保護機體細胞等方面的作用[12-16]，已經(jīng)成為食品、醫(yī)藥與保健等領(lǐng)域的研究熱點。但是現(xiàn)階段的研究中，木耳多糖的提取與抗氧化性研究報道仍集中于黑木耳和毛木耳[17-20]，對于玉木耳多糖的開發(fā)利用幾近空白。此外，對于木耳多糖的抑菌效果研究也鮮見報道。因此，充分利用現(xiàn)有木耳種類對其多糖提取應(yīng)用，將對提高玉木耳這一種質(zhì)資源的開發(fā)，深化我國木耳的產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)具有重要意義。本實驗參照前人對天然產(chǎn)物中多糖的提取工藝、抗氧化活性、抑菌作用等[21-26]研究方法，探究了玉木耳、黑木耳與毛木耳三者在相同的多糖提取條件下其提取率、含量、抗氧化活性與抑菌能力的差異，以期為木耳屬食用菌多糖的開發(fā)利用與比較研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)與實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與培養(yǎng)基

玉木耳來自吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)李玉院士團隊，毛木耳和黑木耳干品均來自于吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食藥用菌教育部工程研究中心?？莶菅挎邨U菌（Bacillus subtilis）、大腸桿菌（Escherichia coli）和金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）由重慶師范大學(xué)應(yīng)用微生物研究所提供。

2,2’-聯(lián)氨-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（2,2’-azinobis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)，ABTS）總抗氧化能力測定試劑盒 碧云天生物技術(shù)有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-d i p h e n y l-2-picrylhydrazyl，DPPH）、鄰苯三酚 美國Sigma公司；濃硫酸、苯酚、無水乙醇、氯仿、正丁醇、N-1-萘基乙二胺鹽酸鹽（均為分析純） 重慶川東化工（集團）有限公司。所用水均為蒸餾水。

LB培養(yǎng)基：牛肉膏3 g、蛋白胨10 g、NaCl 5 g、水1 000 mL，pH 7.0～7.2；固體培養(yǎng)基為LB培養(yǎng)基加入瓊脂15～20 g。

1.2 儀器與設(shè)備

3K15高速冷凍離心機 美國Sigma公司；TP-602精密電子天平 北京賽多利斯公司；SW11-KP2水浴鍋北京長風(fēng)儀器儀表有限公司；JY88-II超聲波細胞破碎儀寧波新芝生物科技股份有限公司；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上海亞榮實驗設(shè)備有限公司產(chǎn)品；ReadMax-1900型光吸收全波長酶標儀 上海閃譜生物科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 3 種木耳多糖的制備與含量測定

分別將玉木耳、毛木耳和黑木耳烘干，粉碎，過100 目篩，按料液比1∶130（m/V）加水浸泡2 h，超聲波450 W破碎30 min[27]，沸水浴中熱浸提6 h；4 ℃、6 000 r/min離心10 min得上清液，濾渣用同法水提3 次，合并上清液；加入濾渣4 倍體積的體積分數(shù)95%乙醇溶液醇沉，靜置10 h；反復(fù)醇沉3～5 次，減壓濃縮，用無水乙醇洗滌；采用Sevag法[28-29]除蛋白，氯仿、正丁醇體積比4∶1，利用分液漏斗萃取，劇烈振蕩，棄下層得上層液；6 000 r/min離心10 min取沉淀，重復(fù)操作直至沉淀物中間層無變性蛋白。再于流動的蒸餾水中透析4 d；反復(fù)冷凍干燥得到粗多糖，多糖質(zhì)量分數(shù)采用硫酸-苯酚法測定[30-31]，提取率按式（1）計算。

1.3.2 3 種木耳多糖的抗氧化活性測定

1.3.2.1 總抗氧化能力的測定

采用ABTS法測定總抗氧化能力。Trolox是一種VE的類似物，具有和VE相近的抗氧化能力，在本實驗中用測定總抗氧化能力的參照[32]。將10 mmol/L Trolox標準溶液配制成0.15、0.30、0.60、0.90、1.20、1.50 mmol/L的標準品，各取10 μL于96 孔板中，各加入等量ABTS工作液，在734 nm波長處測定吸光度。將木耳粗多糖配制成質(zhì)量濃度為0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL的樣品液，同法測定其吸光度，計算得出3 種木耳粗多糖溶液的總抗氧化能力。相同濃度情況下，以Trolox的總抗氧化能力為1，木耳多糖的抗氧化能力用其抗氧化能力和Trolox總抗氧化能力的比值表示。

1.3.2.2 羥自由基清除能力測定

羥自由基清除能力測定采用Fenton反應(yīng)體系[33]。在10 mL試管中加入2 mL 6 mmol/L FeSO4溶液、2 mL 6 mmol/L H2O2溶液、2 mL 6 mmol/L水楊酸和2 mL不同質(zhì)量濃度（0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 mg/mL）的多糖樣品，在37 ℃下反應(yīng)1 h，在517 nm波長處測定其吸光度，以VC作對照。樣品對羥自由基清除率計算如式（2）所示。

式中：A0為蒸餾水代替樣品的吸光度；A1為樣品吸光度；A2為蒸餾水替代H2O2時的吸光度。

1.3.2.3 超氧陰離子自由基清除能力測定

超氧陰離子自由基清除能力測定采用鄰苯三酚自氧化法[34]。4.5 mL pH 8.2 Tris-HCl緩沖液（0.05 mol/L）分別與0.5 mL不同質(zhì)量濃度（0.5～4.0 mg/mL）樣品混合，置于25 ℃水浴中預(yù)熱20 min，0.5 mL 25 mmol/L鄰苯三酚溶液。混勻后于25 ℃水浴中反應(yīng)5 min后，加1 mL 8 mol/L HCl溶液終止反應(yīng)10 min，之后于420 nm波長處測定吸光度，以VC作對照。樣品對超氧陰離子自由基清除率計算如式（3）所示。

式中：A1為樣品的吸光度；A0為蒸餾水代替樣品的吸光度。

1.3.2.4 DPPH自由基清除能力測定

DPPH自由基清除能力測定參照文獻[35]。精確配制濃度為5 mmol/L的DPPH-乙醇溶液，分別精確吸取3 mL不同質(zhì)量濃度（0.5～4.0 mg/mL）的3 種木耳多糖樣品溶液，加入5 mL（5 mmol/L）DPPH-乙醇溶液，混勻后在室溫下靜置30 min，以5 mL無水乙醇和3 mL蒸餾水的混合液為參比，測定517 nm波長處的吸光度，以VC作對照。樣品對DPPH自由基清除率計算如式（4）所示。

式中：A0為只加DPPH-乙醇溶液的吸光度；A1為樣品和DPPH-乙醇溶液的吸光度；A2為樣品溶液的吸光度。

1.3.2.5 NO2-清除活性測定

參照陳蕉等[36]的方法測定亞硝酸根離子（NO2-）清除能力。吸取不同質(zhì)量濃度（0.5～4.0 mg/mL）的多糖溶液和VC水溶液，加入5 μg/mL的亞硝酸鈉溶液2 mL，然后置于37 ℃水浴鍋中反應(yīng)30 min，各加入0.4 g/100 mL對氨基苯磺酸2 mL，搖勻靜置5min；再加入0.2 g/100 mL鹽酸萘乙二胺顯色劑1 mL，搖勻加水定容，靜置15 min后，在最大吸收波長540 nm處測吸光度，以VC作對照。樣品對NO2-的清除率計算如式（5）所示。

式中：A0為水代替樣品的吸光度；A1為不同質(zhì)量濃度樣品的吸光度。

1.3.3 玉木耳、黑木耳和毛木耳多糖抑菌實驗

供試菌種的活化及菌懸液的制備：預(yù)先將3 種供試菌種接入相應(yīng)的斜面培養(yǎng)基上進行活化，大腸桿菌與枯草芽孢桿菌置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12～16 h，金黃色葡萄球菌于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，然后分別挑取已活化的菌種接入液體培養(yǎng)基中，于37 ℃恒溫振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12～16 h，在600 nm波長處測定細菌菌液OD值，各種細菌培養(yǎng)至相應(yīng)OD值：大腸桿菌1.802、枯草芽孢桿菌2.06、金黃色葡萄球菌1.912。菌液于4 ℃下保存。無菌水稀釋各菌液至適應(yīng)該實驗的濃度。

最低抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）的測定：向平皿中分別移取不同質(zhì)量濃度的稀釋液各1 mL，再倒入各種菌種相應(yīng)的培養(yǎng)基（溫度在45 ℃左右）約14 mL，混勻，完全冷卻凝固后，分別移取各菌懸液30 μL至相應(yīng)培養(yǎng)基，涂布均勻，同時采用氨芐青霉素（50 mg/mL）做對照。在適宜溫度下培養(yǎng)，每個質(zhì)量濃度做3 個重復(fù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 3 種木耳多糖的提取率與含量

相同提取條件下，玉木耳、黑木耳與毛木耳的粗多糖提取率分別為13.87%、11.26%、7.91%。根據(jù)葡萄糖標準曲線得到線性回歸方程為y＝0.007 6x+0.011 6（R2＝0.990 6），說明此線性擬合較好。用此回歸方程，根據(jù)多糖置換因子?玉木耳：1.816、?黑木耳：1.724、?毛木耳：1.619，得出粗多糖中玉木耳、黑木耳和毛木耳的多糖質(zhì)量分數(shù)分別為：49.22%、41.50%和37.97%。結(jié)果表明，在3 種木耳在相同提取多糖工藝下玉木耳的多糖含量最高，黑木耳多糖次之，毛木耳多糖含量較少。王辰龍等[17]采用超聲波協(xié)同復(fù)合酶法提取黑木耳粗多糖，提取率為19.14%；許曉燕等[11]通過正交試驗優(yōu)化提取工藝最終得到毛木耳粗多糖提取率為5.9%。

2.2 3 種木耳多糖的總抗氧化能力

根據(jù)ABTS法的總抗氧化能力檢測標準曲線，得出線性回歸方程為y＝-0.034 5x+0.431 8（R2＝0.992 7），樣品的總抗氧化能力在414 nm波長處吸光度呈現(xiàn)一次線性關(guān)系。根據(jù)標準曲線計算得出玉木耳、黑木耳和毛木耳多糖的總抗氧化能力。玉木耳多糖總抗氧化能力為2.206 mmol/g，黑木耳多糖總抗氧化能力為2.023 mmol/g，毛木耳多糖總抗氧化能力為2.762 mmol/g，玉木耳多糖和黑木耳多糖的總抗氧化能力幾乎相當，毛木耳多糖中的總抗氧化能力較高，約為玉木耳和黑木耳多糖的1.3 倍。

2.3 3 種木耳多糖對羥自由基的清除作用

由圖1可知，隨著玉木耳、黑木耳和毛木耳3 種木耳多糖提取液質(zhì)量濃度增加，相應(yīng)的羥自由基清除率增加，3 種多糖對羥自由基清除能力由高到低依次為玉木耳多糖＞黑木耳多糖＞毛木耳多糖。由多糖溶液對羥自由基的清除曲線經(jīng)回歸處理可求出羥自由基的半清除率（half maximal inhibitory concentration，IC50），分別為玉木耳多糖2.36 mg/mL、黑木耳多糖3.14 mg/mL、毛木耳多糖3.33 mg/mL。玉木耳多糖的羥自由基清除效果最好，當質(zhì)量濃度達到2.5 mg/mL時，清除率超過50%。玉木耳多糖羥自由基最高可達到66.61%；黑木耳多糖次之，當質(zhì)量濃度達到4.0 mg/mL時，清除率可達到60.02%；毛木耳多糖質(zhì)量濃度達到4.0 mg/mL時，對羥自由基清除率達到58.50%。

2.4 3 種木耳多糖對超氧陰離子自由基的清除作用

圖 2 3 種木耳多糖對超氧陰離子自由基的清除作用Fig. 2 Superoxide anion radical scavenging capacity of the polysaccharides from three Auricularia species

由圖2可知，玉木耳、黑木耳、毛木耳多糖對超氧陰離子自由基具有較好的清除效果，隨著多糖的質(zhì)量濃度的增加，各多糖清除率也顯著提高。3 種木耳多糖的超氧陰離子自由基清除活性由高到低依次為玉木耳多糖＞黑木耳多糖＞毛木耳多糖，由多糖溶液對超氧陰離子自由基的清除曲線經(jīng)回歸處理可求出超氧陰離子自由基的IC50，分別為玉木耳多糖1.117 mg/mL、黑木耳多糖2.286 mg/mL、毛木耳多糖3.201 mg/mL。玉木耳多糖的超氧陰離子自由基清除效果最好，當質(zhì)量濃度2 mg/mL時，清除率超過50%，最高可達到74.66%；黑木耳多糖次之，當質(zhì)量濃度3 mg/mL時，清除率達到50%，最高可達到68.69%；毛木耳多糖的質(zhì)量濃度4 mg/mL時，清除率達到55.92%。

2.5 3 種木耳多糖對DPPH自由基的清除作用

圖 3 3 種木耳多糖對DPPH自由基的清除作用Fig. 3 DPPH radical scavenging activity of the polysaccharides from three Auricularia species

由圖3可知，隨著玉木耳、黑木耳和毛木耳3 種木耳多糖提取液質(zhì)量濃度增加，相應(yīng)的DPPH自由基清除率增加，3 種多糖對DPPH自由基清除能力由高到低依次為玉木耳多糖＞毛木耳多糖＞黑木耳多糖。多糖溶液對DPPH自由基清除率的IC50分別為：玉木耳多糖1.317 mg/mL、毛木耳1.715 mg/mL、黑木耳10.340 mg/mL。玉木耳多糖的DPPH自由基清除效果最好，當質(zhì)量濃度2 mg/mL時，清除率超過50%，最高可達到89.25%；黑木耳多糖效果較差，當質(zhì)量濃度4 mg/mL時，清除率未達到50%。

2.6 3 種木耳多糖對的清除作用

圖 4 3 種木耳多糖對的清除作用Fig. 4 scavenging activity of the Auricularia polysaccharides

2.7 抑菌效果

表 1 不同供試菌在3 種木耳多糖存在時的生長情況Table 1 Growth inhibitory effect of the Auricularia polysaccharides on different microorganisms

玉木耳、黑木耳、毛木耳多糖對大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄桿菌均有一定的抑制效果，但與陽性對照氨芐青霉素相比，抑菌效果均較弱。其中黑木耳與毛木耳多糖的抑菌效果相當，3 種木耳多糖抑菌效果均隨著多糖質(zhì)量濃度的增加而逐漸增強，MIC在0.500～2.000 mg/mL之間（表1）。黑木耳與毛木耳多糖對金黃色葡萄球菌和芽孢桿菌的抑制效果不明顯，僅玉木耳多糖對其具備較好的抑菌作用。由此可見，3 種木耳多糖對實驗中的微生物抑制具有一定的選擇性。

3 結(jié) 論

本研究通過水提醇沉法從玉木耳、黑木耳和毛木耳中提取粗多糖，并測定了其中的多糖含量。此外，采用不同方法測定玉木耳、黑木耳和毛木耳多糖的總抗氧化能力，羥自由基、超氧陰離子自由基、DPPH自由基、清除能力，以及其針對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌的抑菌能力。得出結(jié)論如下：1）玉木耳的多糖含量最高，黑木耳其次，毛木耳的多糖含量最低；2）3 種木耳多糖的總抗氧化能力及對自由基的清除率隨多糖溶液質(zhì)量濃度的增加而升高，具有質(zhì)量濃度依賴性；3）毛木耳多糖總抗氧化能力最高，黑木耳多糖和玉木耳多糖次之，但玉木耳多糖對羥自由基、超氧陰離子自由基和DPPH自由基的清除率均高于黑木耳和毛木耳多糖；4）玉木耳多糖對供試菌的抑菌活性較強（MIC≤1 mg/mL），可作為潛在的食品防腐劑。