藥桑葉中活性物質(zhì)的提取及對α-葡萄糖苷酶的抑制作用

郝蒙蒙，崔漢釗，韓愛芝，楊 玲*

（塔里木大學生命科學學院，塔里木盆地生物資源保護利用兵團重點實驗室，新疆 阿拉爾 843300）

藥桑在植物分類學上屬?？啤⑸?、黑桑種（Morus nigra L.）[1]，由于新疆南部生態(tài)環(huán)境獨特，日照時間長、晝夜溫差大、干旱[2]，使藥桑成為具有體細胞染色體倍性為自然22倍體（2n＝22x＝308）的稀貴桑樹資源[3]，目前主要分布于新疆阿克蘇、和田和喀什等地區(qū)，是新疆地區(qū)在全國獨一無二的桑種質(zhì)資源[4]?，F(xiàn)代藥理學及化學成分研究表明桑葉具有降血糖、抗氧化、抗病毒等多種藥理活性，其中生物堿以及黃酮類物質(zhì)是桑葉中主要的降血糖活性成分[5]。俞靈鶯等報道給糖尿病大鼠灌胃桑葉總黃酮后，大鼠血糖濃度由18.4 mmol/L降至10.2 mmol/L（P＜0.001），降糖作用顯著[6]。陳建國等指出：桑葉多糖具有調(diào)節(jié)糖代謝、降低血糖、改善糖尿病癥狀的作用[7]。1976年Yagi等初次從桑樹中分離得到生物堿成分[8]。買買提依明等曾對藥桑葉片中的生物堿成分進行檢測，發(fā)現(xiàn)其主要成分為1-脫氧野尻霉素（1-deoxynojirimycin，DNJ），含量為1.893 3 mg/g[9]。此外，有研究表明，桑葉總黃酮也能夠抑制雙糖酶活性，從而具有顯著的降血糖作用[10]。而且將類黃酮與DNJ結(jié)合能更有效地抑制血糖上升，表明類黃酮與桑葉DNJ有一定的協(xié)同作用[11]。而中南大學湘雅醫(yī)學院生理學系對一種以桑葉為主要原料的降血糖保健品進行研究，也發(fā)現(xiàn)桑葉多糖、生物堿及產(chǎn)品中其他成分有一定的協(xié)同配伍作用[12]，以上研究均是采用的隨機濃度組合方法來研究不同物質(zhì)之間的協(xié)同作用，但如何定量分析各成分之間的協(xié)同、相加或拮抗作用并未采用統(tǒng)計學方法。目前普遍用Chou-Talalay（又稱中位藥效法）數(shù)學模型來評價藥物協(xié)同作用效果[13]，目前針對Chou-Talalay的數(shù)學模型開發(fā)出的第3代藥物聯(lián)合作用劑量-效應(yīng)分析軟件“CompuSyn”是被廣泛認可的藥物協(xié)同作用定量分析方法[14]，該公式主要用聯(lián)合指數(shù)（combination index，CI）來定量描述藥物之間的相互關(guān)系[15]。

本研究以新疆特色藥桑桑葉為材料，在本實驗室已建立的集成提取工藝基礎(chǔ)上，通過適當優(yōu)化，獲得化學成分和含量基本穩(wěn)定、具有降血糖活性的生物堿、黃酮和多糖的粗提物[16]；并以此為實驗藥物來研究其抑制α-葡萄糖苷酶的抑制作用，進一步采用CompuSyn軟件對具有活性的穩(wěn)定粗提物做統(tǒng)計學分析，來判斷桑葉中多糖、黃酮、生物堿是否具有協(xié)同作用，旨在為更深入研究和開發(fā)新疆藥桑桑葉的藥用和經(jīng)濟價值提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

藥桑葉2016年7月采集于新疆庫車地區(qū)，經(jīng)塔里木大學邱愛軍副教授鑒定為藥桑（Morus nigra L.）葉，藥桑葉粉碎后避光置于干燥處保存。

蘆丁 美國Merck公司；葡萄糖 上海山浦化工有限公司；4-羥基哌啶 西格瑪奧德里奇上海貿(mào)易有限公司；4-硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷（p-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside，PNPG） 上海如吉生物科技發(fā)展有限公司；阿卡波糖片 德國拜耳醫(yī)藥有限公司；α-葡萄糖苷酶 江蘇瑞陽生物科技有限公司；所有分離純化用有機溶劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

RE-5205旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠；CP224C電子天平 美國奧豪斯儀器有限公司；HH-2恒溫水浴鍋 上海愛朗儀器有限公司；恒溫干燥箱 上海嘉穎科技有限公司；Infinite M200 Pro多功能酶標儀瑞士Tecan公司；S54紫外分光光度計 上海棱光技術(shù)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 桑葉中主要活性物質(zhì)的提取及純化

準確稱取干燥藥桑葉粉末300.0 g，按料液比1∶20加入6.0 L石油醚，70 ℃回流4 h，過濾，濾渣按料液比1∶20加入6.0 L體積分數(shù)65%乙醇溶液，浸泡24 h，過濾，濾液減壓濃縮得桑葉浸膏；桑葉浸膏經(jīng)過樹脂分離純化，分別得到生物堿、黃酮和多糖的3 種粗提物，集成提取工藝流程如圖1所示。本實驗重復(fù)3 次，分別測定粗提物中主要成分的含量。黃酮含量測定采用硝酸鋁-亞硝酸鈉比色法[17]，以蘆丁為標準品，制作標準曲線Y＝11.64X-0.001 2，R2＝0.999 7；生物堿含量測定采用雷氏鹽比色法[18]，以4-羥基哌啶為標準品，制作標準曲線Y＝0.169 5X+0.090 7，R2＝0.990 3；多糖含量的測定采用苯酚-硫酸法[19]，葡萄糖作標準品，制作標準曲線Y＝7.170 6X-0.005 2，R2＝0.991 7；分別以以上3 種方法測定桑葉浸膏、粗生物堿、粗黃酮、粗多糖中黃酮、多糖、生物堿的含量，實驗重復(fù)3 次，確定工藝穩(wěn)定性。

圖 1 集成提取工藝流程圖Fig. 1 Flow chart for the synchronous extraction of active substances from mulberry leaves

1.3.2 α-葡萄糖苷酶降血糖活性測定

α-葡萄糖苷酶與其底物PNPG發(fā)生反應(yīng)，生成對硝基苯（p-nitrophenyl，PNP），PNP在堿性環(huán)境下顯黃色，在400 nm左右波長處有最大吸收，在一定的質(zhì)量濃度（0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mg/mL）范圍內(nèi)，PNP的吸光度與α-葡萄糖苷酶活力成正比[20]。

本實驗在96微孔板中測定完成[21]，實驗共設(shè)置3組，每組3 個重復(fù)，依次為：空白組（酶液+底物）、樣品組（樣品+酶液+底物）、背景組（樣品+底物），實驗以阿卡波糖作陽性對照[22]，具體反應(yīng)體系為：磷酸鹽緩沖液：空白組96 μL、實驗組80 μL、背景組96 μL；樣品：空白組0 μL、實驗組16 μL、背景組16 μL；α-葡萄糖苷酶：空白組16 μL、實驗組16 μL、背景組0 μL；PNPG：空白組16 μL、實驗組16 μL、背景組16 μL；Na2CO3：空白組100 μL、實驗組100 μL、背景組100 μL。

抑制劑對α-葡萄糖苷酶的抑制率按式（1）計算。

式中：A0為空白組吸光度；A1為樣品背景組吸光度；A2為樣品組吸光度。

1.4 數(shù)據(jù)處理

根據(jù)CompuSyn軟件需求，以半數(shù)有效劑量Dm為中心設(shè)計5 個質(zhì)量濃度梯度（表1），并測定不同質(zhì)量濃度下相應(yīng)抑制率fa[23]，采用CompuSyn統(tǒng)計軟件，根據(jù)中效方程式（式（2））、CI一般式（式（3））、兩個藥物CI（式（4）），用設(shè)計的質(zhì)量濃度和測得的相對應(yīng)質(zhì)量濃度下的抑制率繪制劑量-效應(yīng)曲線（C-fa）及不同效應(yīng)下的CI曲線（fa-CI）[24]，從兩供試樣品聯(lián)合的效應(yīng)與CI的關(guān)系圖定量評價供試樣品間的相互作用的強度以及性質(zhì)[25]，CI＝1，為相加效應(yīng)；CI＞1，為拮抗效應(yīng)；CI＜1，為協(xié)同效應(yīng)[26]。

式中：fa為抑制率；fu為存活率，fu＝1-fa；D為單用劑量/（mg/mL）；Dm為半數(shù)有效劑量/（mg/mL）[27]；m為中效曲線的斜率；Dx為聯(lián)用劑量/（mg/mL）[28]；CI為聯(lián)合指數(shù)。

表 1 藥物質(zhì)量濃度Table 1 Drug concentration

2 結(jié)果與分析

2.1 3 種粗提物中活性成分含量分析

表 2 各項粗提物中活性成分含量重現(xiàn)性實驗結(jié)果Table 2 Reproducibility of bioactive ingredients in crude extracts

由表2可知，各項中黃酮、生物堿、多糖含量相對偏差均滿足要求，說明各項中主要活性成分含量穩(wěn)定，具有重現(xiàn)性，粗生物堿中黃酮含量及粗多糖中生物堿含量甚微，無法測出；且經(jīng)過純化，粗黃酮中黃酮含量最高，粗多糖中多糖含量最高，粗生物堿中生物堿含量最高，相比桑葉浸膏相含量明顯增加，在其他相中明顯降低，說明純化效果明顯。

以上重復(fù)性實驗結(jié)果表明：桑葉粗黃酮、粗多糖、粗生物堿中3 種主要成分黃酮、生物堿、多糖含量均是穩(wěn)定的，且具有重復(fù)性，說明該提取純化工藝穩(wěn)定，得到的提取物中主要成分含量穩(wěn)定。3 種提取物能夠作為降血糖活性實驗的藥物原料。

2.2 3 種提取物對α-葡萄糖苷酶的抑制作用

2.2.1 單一活性物質(zhì)對α-葡萄糖苷酶的抑制作用

實驗以阿卡波糖作陽性對照，在0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mg/mL 5 個質(zhì)量濃度下，分別測定了生物堿相和黃酮相對α-葡萄糖苷酶的抑制作用，以活性物質(zhì)質(zhì)量濃度為橫坐標，抑制率為縱坐標，繪制抑制率曲線，如圖2所示。

圖 2 單一活性物質(zhì)對α-葡萄糖苷酶的抑制Fig. 2 Inhibitory effect of single bioactive substances on α-glycosidase

由圖2可知，在0.4～1.2 mg/mL的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)阿卡波糖、黃酮及生物堿都與α-葡萄糖苷酶抑制作用呈良好的線性關(guān)系，隨著質(zhì)量濃度的增加，其對α-葡萄糖苷酶的抑制作用也逐漸增強，且在同等質(zhì)量濃度作用下，對α-葡萄糖苷酶的抑制作用：生物堿＞阿卡波糖＞黃酮。在質(zhì)量濃度為1.2 mg/mL時，生物堿對α-葡萄糖苷酶的抑制率達到73.87%，表明桑葉中生物堿具有更好的降血糖活性；多糖在高質(zhì)量濃度作用下具有一定的降血糖活性，其半數(shù)有效劑量約為生物堿半數(shù)有效劑量的15 倍，差異太大，因此在圖中未給出。

2.2.2 3 種主要活性物質(zhì)及其相互組合物的軟件分析結(jié)果

表 3 不同單藥及合用時半數(shù)有效劑量、斜率和相關(guān)系數(shù)值Table 3 Values of Dm, m and r for bioactive substances alone and in combination

由表3可知，3 種單藥及不同藥物相互組合時r均大于0.95，表明活性物質(zhì)的劑量與效應(yīng)之間擁有良好的線性關(guān)系；Dm表示各活性物質(zhì)的半數(shù)有效劑量，在本實驗中即各物質(zhì)的半抑制濃度（half maximal inhibitory concentration，IC50）；Dm、m由CompuSyn軟件根據(jù)中效方程（式（2））自動模擬計算。

2.2.3 不同活性物質(zhì)之間相互組合對α-葡萄糖苷酶的抑制作用

分別測定單藥在5 個不同質(zhì)量濃度下單用或與其他單藥平行聯(lián)合作用下的抑制效應(yīng)，結(jié)果如圖3所示。

圖 3 藥物單用及合用劑量-效應(yīng)圖及聯(lián)合作用指數(shù)曲線圖（fa-CI）Fig. 3 Dose-effect and fa-CI curves of bioactive substances individually and in combination

由圖3可知，不同質(zhì)量濃度單藥及平行質(zhì)量濃度下兩兩聯(lián)合的抑制效應(yīng)均呈現(xiàn)劑量依賴關(guān)系；根據(jù)Chou-Talalay CI法可分別得到不同組合物之間聯(lián)用的CI曲線。由圖3可知，多糖+生物堿的組合與黃酮+生物堿的組合，在0＜fa＜1時，CI均大于1，表明兩者之間相互拮抗；多糖+黃酮的組合在fa不小于0.90時，CI＜1，兩者之間具有協(xié)同作用；生物堿+多糖+黃酮三者之間相互作用在fa不小于0.95時，CI＜1，三者之間具有協(xié)同作用，綜上所述，生物堿+黃酮及生物堿+多糖兩個組合對α-葡萄糖苷酶的抑制具有拮抗作用，多糖+黃酮及黃酮+生物堿+多糖三者組合這兩組組合在高的質(zhì)量濃度作用下對α-葡萄糖苷酶的抑制具有一定的協(xié)同作用。

3 討 論

獲得穩(wěn)定的提取物是本實驗的關(guān)鍵，在本實驗室已建立的集成提取工藝基礎(chǔ)上，對提取流程進行了改進，先采用石油醚進行脫色脫脂，再用乙醇提取，用此流程提取的活性物質(zhì)的化學成分和含量穩(wěn)定，具有重復(fù)性，保證了α-葡萄糖降血糖活性實驗中藥物原料的可靠性。

目前主要的α-葡萄糖苷酶抑制劑包括阿卡波糖、伏格列波糖、米格列醇等，這些藥物都存在胃腸不適等副作用。而桑葉作為降血糖的常用中藥之一，是潛在的安全有效的α-葡萄糖苷酶抑制劑[30]。

本實驗以α-葡萄糖苷酶為研究對象，作用于反應(yīng)底物4-硝基酚-α-葡萄糖苷，釋放出一定量的葡萄糖；當有α-葡萄糖苷酶抑制劑存在，可以抑制這一反應(yīng)，使最大吸收峰值下降，其下降程度與抑制劑活性呈正比?；诖俗饔迷砗妥饔锰攸c，評價桑葉中具有α-葡萄糖苷酶抑制活性的多組分相互作用并探討其劑量-效應(yīng)關(guān)系。

CompuSyn軟件作為分析藥物相互作用的方法，是評價劑量-效應(yīng)變化的有力工具。本實驗采用3 種藥物相互作用的評價方法探討桑葉不同組分配伍組合對α-葡萄糖苷酶抑制活性的劑量-效應(yīng)變化與效應(yīng)關(guān)系，研究表明，桑葉中降低血糖的主要有效成分包括黃酮類、生物堿類、多糖類3 類功效成分，在本實驗室所用的質(zhì)量濃度范圍和劑量配比內(nèi)，其中粗生物堿的降血糖作用優(yōu)于粗黃酮，粗黃酮的降血糖作用優(yōu)于粗多糖，且生物堿對α-葡萄糖苷酶的抑制作用比陽性對照（阿卡波糖）更好，在本實驗室所用的質(zhì)量濃度范圍和劑量配比內(nèi)，黃酮+生物堿組合、多糖+生物堿組合作用時，CI＞1表現(xiàn)為拮抗作用，黃酮+多糖在0＜fa≤0.9時，CI＞1表現(xiàn)為拮抗作用，在0.90＜fa≤1時，CI＜1表現(xiàn)為協(xié)同作用；黃酮+多糖+生物堿三者相互作用時，在0＜fa≤0.95時CI＞1，表現(xiàn)為拮抗作用，在0.95＜fa≤1時，CI＜1，兩者之間表現(xiàn)為協(xié)同作用。上述結(jié)果顯示桑葉的活性物質(zhì)之間，在高質(zhì)量濃度作用下，表現(xiàn)為較好的協(xié)同作用，為揭示桑葉整體調(diào)節(jié)血糖作用提供了科學依據(jù)。

藥桑由于其產(chǎn)地獨特的地理位置，在生物活性及藥理作用方面有著獨特的特性，因此對藥桑降血糖作用的研究應(yīng)做更深的分析，不能僅僅做抑制α-葡萄糖苷酶的協(xié)同或拮抗作用，需要更多的實驗數(shù)據(jù)來支持桑葉的降血糖作用，本實驗的下一步將進行體內(nèi)降血糖活性實驗，來進一步探討藥桑的降血糖活性。