Th17及Treg在卵巢癌中的表達(dá)及其臨床意義研究

孫孟雄 楊 麗 王娟娟 胡亞麗 李芙琴

輔助性T細(xì)胞17(T help cell 17，Th17)屬于T淋巴細(xì)胞及亞群CD4+T。作為CD4+T細(xì)胞亞群，高水平地分泌白細(xì)胞介素17(interleukin-17，IL-17)，被命名為Th17細(xì)胞[1]。調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)是一組具有維持自身免疫耐受功能的CD4+T細(xì)胞亞群，該類細(xì)胞的數(shù)量和功能障礙可使其對(duì)效應(yīng)T細(xì)胞的抑制功能減弱，從而導(dǎo)致機(jī)體外周免疫的失衡[2]。Th17細(xì)胞被普遍認(rèn)為是一群介導(dǎo)炎性反應(yīng)的重要細(xì)胞[3-5]。而國(guó)內(nèi)外學(xué)者研究證實(shí)Treg細(xì)胞在卵巢癌患者體內(nèi)數(shù)量、功能異常，可能與卵巢癌的發(fā)生發(fā)展有關(guān)[6-8]。Th17與Treg均屬于CD4+T細(xì)胞亞群，具有一定的可塑性，通過細(xì)胞因子相互影響、制約維持動(dòng)態(tài)平衡。在分化及功能上Th17/Treg是一對(duì)相互制約的平衡體系，維持著機(jī)體的免疫穩(wěn)定，一旦平衡打破，機(jī)體會(huì)發(fā)生免疫功能失常，導(dǎo)致疾病的發(fā)生，如炎癥、腫瘤及免疫性疾病等[9-10]。

卵巢癌是一種常見的易發(fā)于女性生殖系統(tǒng)的惡性腫瘤，其發(fā)病率低于宮頸癌和宮體癌，但因?yàn)槁殉舶┌l(fā)病隱匿，絕大多數(shù)患者無明顯臨床癥狀，導(dǎo)致其普查和早期診斷缺乏，所以70%以上患者就診時(shí)已至晚期，治療和預(yù)后效果很差，致死率占各類婦科腫瘤的首位[11]。目前卵巢癌的發(fā)病機(jī)制依然未研究透徹，可能與女性外源性激素、月經(jīng)、妊娠及哺乳、病毒感染、飲食、遺傳因素、癌基因與抑癌基因、精神因素等多方面因素有關(guān)[12]。截止目前，歐美公認(rèn)的卵巢癌的腫瘤標(biāo)志物只有糖類抗原125(carbohydrate antigen 125，CA125)[13]。因此，亟需找到一種與CA125同樣符合卵巢癌腫瘤標(biāo)志性的指標(biāo)，本研究通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)各期卵巢癌患者外周血中的Th17細(xì)胞與Treg細(xì)胞，并結(jié)合患者CA125結(jié)果進(jìn)行相關(guān)性分析，期望得到在卵巢癌發(fā)病過程中Th17/Treg平衡狀態(tài)改變對(duì)卵巢癌發(fā)病可能發(fā)揮的作用，并研究Th17/Treg與CA125的相關(guān)性，以期能找到另一個(gè)卵巢癌腫瘤標(biāo)志性指標(biāo)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2016年1月至2017年6月在張家口市第一醫(yī)院婦科住院醫(yī)治的45例卵巢癌患者，將其納入卵巢癌組，年齡31～75歲，平均年齡(45.14±17.29)歲，所有病例均經(jīng)病理證實(shí)為上皮性卵巢癌。按照國(guó)際婦產(chǎn)科聯(lián)合會(huì)(Federation International of Gynecology and Obstetrics，F(xiàn)IGO)2000年手術(shù)-病理分期標(biāo)準(zhǔn)，Ⅰ期5例，Ⅱ期9例，Ⅲ期18例，Ⅳ期13例。所有病例排除自身免疫性疾病、感染及嚴(yán)重的心肝腎疾病，采集樣本前未進(jìn)行免疫治療、手術(shù)及化療。同期選取45名女性健康體檢者為正常對(duì)照，并將其納入健康對(duì)照組。該研究取得醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有患者均簽署知情同意書。

1.2 儀器與試劑

(1)儀器。采用FASCCanto型流式細(xì)胞儀(美國(guó)BD公司)；Advia Centaur型全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光儀(美國(guó)Bayer公司)。

(2)試劑。鞘液ISOTON Ⅲ血細(xì)胞稀釋液(美國(guó)Backman Coulter公司)；改良型RPMI-1640(Roswell Park Memorial Institute1640 洛斯維1604培養(yǎng)基)(北京賽默飛世爾生物化學(xué)制品有限公司)；氟波酯(phorbol ester，PMA)、離子霉素(Ionomycin)及布雷桿氏菌素A(brefeldinA，BFA)(美國(guó)Sigma公司)；破膜劑(美國(guó)Invitrogen公司)；IL-17A-FITC(美國(guó)eBioscience公司)；CD25-PerCP-Cy5.5、CD4-FITC單克隆抗體(美國(guó)Beckman coulter immunotech)；CAl25檢測(cè)使用Advia Centaur全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光儀。

1.3 標(biāo)本收集與細(xì)胞刺激和培養(yǎng)

(1)卵巢癌組患者均自入院第2 d清晨，空腹平臥位采集肘靜脈血5 ml兩管；健康對(duì)照組為體檢女性，亦空腹采集肘靜脈血5 ml兩管，1管肝素鈉采集，1管普通管采集。

(2)取采集到的血液樣本100 μL，加入100 μL RPMI1640培養(yǎng)液混勻，再加入5 μL PMA工作液，5 μL Ionomycin工作液，40 μL BFA工作液，體系中PMA、Ionomycin、BFA終濃度分別為25 μg/L、1.0 g/L和1.7 g/L。在37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱中刺激培養(yǎng)5 h，取出細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記。

1.4 檢測(cè)方法

(1)Th17、Treg細(xì)胞標(biāo)記及頻數(shù)檢測(cè)。取100 μl經(jīng)刺激培養(yǎng)的全血細(xì)胞，加入10 μl CD4-FITC單克隆抗體，室溫避光孵育15 min。100 μl固定液(A液)室溫避光固定反應(yīng)15 min，加入3 ml PBS，混勻離心棄上清。加入100 μl破膜劑(B液)進(jìn)行細(xì)胞打孔利于細(xì)胞因子染色，加入IL-17A-FITC 20 μl，室溫避光孵育20 min后，加入3 ml磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer solution，PBS)，靜置10 min，離心棄上清，再加入0.5 ml PBS懸浮細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測(cè)。根據(jù)CD4設(shè)門圈定T淋巴細(xì)胞群，分析CD4+-17A+T細(xì)胞。

(2)CD4+CD25+T細(xì)胞檢測(cè)。取100 μL經(jīng)刺激培養(yǎng)的全血細(xì)胞，加入CD25-PerCP-Cy5.5抗體、CD4-FITC抗體各5 μl，設(shè)同型對(duì)照管，室溫暗室孵育20 min后，加入紅細(xì)胞破膜劑100 μl進(jìn)行細(xì)胞打孔利于細(xì)胞因子染色，室溫暗室孵育10 min。洗滌后，用磷酸鹽緩沖液500 μl重懸細(xì)胞，于24 h內(nèi)流式細(xì)胞儀檢測(cè)，根據(jù)CD4設(shè)門圈定T淋巴細(xì)胞群，結(jié)果即為CD4+CD25+T細(xì)胞。

(3)CA125檢測(cè)。經(jīng)由同位素科進(jìn)行檢測(cè)，在美國(guó)Bayer公司Advia Centaur全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光儀上測(cè)定。

1.5 觀察與評(píng)價(jià)指標(biāo)

比較兩組外周血中Th17、Treg與Th17/Treg細(xì)胞頻數(shù)；比較卵巢癌組患者分期外周血中Th17、Treg與Th17/Treg細(xì)胞頻數(shù)；同時(shí)比較卵巢癌患者分期外周血中CA125、Th17與Treg細(xì)胞頻數(shù)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

對(duì)兩組數(shù)據(jù)資料使用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析、處理，所得數(shù)值均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，方差不齊時(shí)采用Wilcoxon秩和檢驗(yàn)，相關(guān)性分析采用Pearson分析，相關(guān)系數(shù)用r表示，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組外周血中Th17、Treg與Th17/Treg細(xì)胞頻數(shù)比較

(1)檢測(cè)結(jié)果顯示，卵巢癌組外周血中Th17細(xì)胞表達(dá)頻率為(2.98±0.67)%，健康對(duì)照組外周血表達(dá)頻率為(1.57±0.50)%，卵巢癌組Th17細(xì)胞表達(dá)頻率顯著高于健康對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=11.16，P＜0.01)，如圖1所示。

圖1 流式細(xì)胞儀檢測(cè)Th17細(xì)胞表達(dá)頻率示圖

(2)卵巢癌組外周血T r e g細(xì)胞表達(dá)頻率為(15.37±2.34)%，健康對(duì)照組外周血表達(dá)頻率為(5.49±1.26)%，卵巢癌組Treg細(xì)胞表達(dá)頻率顯著高于健康對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=24.95，P＜0.01)，如圖2所示。

圖2 流式細(xì)胞儀檢測(cè)Treg細(xì)胞表達(dá)頻率示圖

(3)在Th17/Treg中卵巢癌組與健康對(duì)照組比較差異亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=17.14，P＜0.01)，見表1。

表1兩組外周血Th17、Treg 和 Th17/Treg細(xì)胞表達(dá)率(%，±s)

表1兩組外周血Th17、Treg 和 Th17/Treg細(xì)胞表達(dá)率(%，±s)

組別 例數(shù) Th17細(xì)胞 Treg細(xì)胞 Th17/Treg卵巢癌組 45 2.98±0.67 15.37±2.34 19.10±1.50健康對(duì)照組 45 1.57±0.50 5.49±1.26 27.97±3.13 t值 11.16 24.95 17.14 P值 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01

2.2 卵巢癌組患者分期外周血中Th17、Treg與Th17/Treg細(xì)胞頻數(shù)比較

在卵巢癌分期中可見Th17與Treg細(xì)胞在Ⅰ～Ⅱ與Ⅲ～I(xiàn)V期間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=4.62，t=7.811；P＜0.01)，但Th17/Treg在分期中無顯著差異(t=0.654，P＞0.05)，見表2。

表2 卵巢癌患者外周血Th17、Treg與Th17/Treg細(xì)胞與卵巢癌TNM分期特征關(guān)系(±s)

表2 卵巢癌患者外周血Th17、Treg與Th17/Treg細(xì)胞與卵巢癌TNM分期特征關(guān)系(±s)

細(xì)胞(%) 例數(shù) TNM分期 t值 P值Ⅰ～Ⅱ(14例) Ⅲ～Ⅳ(31例)Th17 2.40±0.59 3.23±0.54 4.62 ＜0.01 Treg 12.73±1.06 16.56±1.68 7.811 ＜0.01 Th17/Treg 18.78±3.81 19.75±4.23 0.654 0.53

2.3 卵巢癌患者分期外周血中CA125、Th17與Treg細(xì)胞頻數(shù)比較

在45例卵巢癌患者中有6例檢測(cè)CA125結(jié)果未收集到，因此分析39例卵巢癌患者的CA125檢測(cè)數(shù)據(jù)，此間CA125、Th17與Treg細(xì)胞在卵巢癌分期中比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=4.873，t=7.947，t=9.114；P＜0.01)，見表3。

表3卵巢癌患者外周血CA125、Th17與Treg細(xì)胞與卵巢癌分期特征關(guān)系(±s)

表3卵巢癌患者外周血CA125、Th17與Treg細(xì)胞與卵巢癌分期特征關(guān)系(±s)

細(xì)胞(%) TNM分期 t值 P值Ⅰ～Ⅱ(13例) Ⅲ～Ⅳ(26例)Th17 2.43±0.60 3.28±0.55 4.873 ＜0.01 Treg 12.86±0.99 16.88±1.65 7.947 ＜0.01 CA125 74.76±30.15 380±170.38 9.114 ＜0.01

2.4 卵巢癌組患者外周血中CA125與Th17、Treg、Th17/Treg細(xì)胞相關(guān)性

卵巢癌組患者外周血中CA125與Th17、Treg、Th17/Treg細(xì)胞相關(guān)性分析。在卵巢癌患者外周血檢測(cè)中，CA125與Th17、Treg及Th17/Treg細(xì)胞呈正相關(guān)(r=0.656，r=0.749，r=0.358；P＜0.05)，見表4。

表4卵巢癌患者外周血CA125與Th17、Treg及Th17/Treg細(xì)胞相關(guān)性分析

3 討論

Th17細(xì)胞屬于CD4+T細(xì)胞群的一組細(xì)胞亞群，會(huì)在多種免疫性疾病中呈現(xiàn)多克隆和過度激活狀態(tài)，其主要分泌IL-17A、IL-17F和腫瘤壞死因子(TNF-α)等細(xì)胞因子，正是這些炎癥介質(zhì)參與介導(dǎo)免疫細(xì)胞在局部組織中的浸潤(rùn)。多項(xiàng)研究論證了Th17細(xì)胞及其分泌的主要細(xì)胞因子IL-17A參與了多種自身免疫性疾病的病理生理過程[14-18]。有國(guó)外研究者發(fā)現(xiàn)，卵巢癌患者的腫瘤組織中Th17細(xì)胞的數(shù)量與卵巢癌疾病分級(jí)有關(guān)[19]。王麗華等[20]在卵巢癌外周血液Th17細(xì)胞頻數(shù)研究中發(fā)現(xiàn)，CD3+CD4+-17A+細(xì)胞頻數(shù)百分率增多，與臨床分期相關(guān)，與細(xì)胞分化與組織類型無關(guān)。Treg細(xì)胞主要發(fā)揮免疫抑制作用，與許多腫瘤的發(fā)生呈正相關(guān)，包括乳腺癌、宮頸癌等，外周血中Treg細(xì)胞的百分率升高與腫瘤的分期、大小及淋巴轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)[21-22]。在本研究中發(fā)現(xiàn)Th17細(xì)胞與Treg細(xì)胞頻數(shù)的增加均與卵巢癌的發(fā)生有關(guān)，且Th17/Treg在病例組中明顯低于對(duì)照組，可從側(cè)面顯示在卵巢癌發(fā)生發(fā)展過程中Treg的增長(zhǎng)要多于Th17的增長(zhǎng)，但這個(gè)比值在卵巢癌分期中并無明顯的差異。

在卵巢癌患者外周血CA125與Th17、Treg、Th17/Treg細(xì)胞的分析中可以發(fā)現(xiàn)，CA125在卵巢癌分期中有顯著差異，而且在對(duì)這幾個(gè)指標(biāo)進(jìn)行相關(guān)性分析時(shí)發(fā)現(xiàn)，CA125與其他指標(biāo)都存在著正相關(guān)性。截止目前，歐美公認(rèn)的卵巢癌的腫瘤標(biāo)志物只有CA125，在國(guó)內(nèi)一般也是最多使用CA125或CA125與其他腫瘤標(biāo)志物共同評(píng)估與先期診斷[23-25]。本研究的相關(guān)性結(jié)果可以從一方面顯示Th17、Treg、Th17/Treg指標(biāo)與CA125有較強(qiáng)的相關(guān)性，有可能成為與CA125聯(lián)合診斷卵巢癌的一種指標(biāo)。

卵巢癌患者外周血中Th17與Treg細(xì)胞數(shù)量比正常人體內(nèi)顯著增多，其參與了卵巢癌的發(fā)生及發(fā)展過程。進(jìn)一步研究其在卵巢癌發(fā)病的不同時(shí)期的變化，將有助于全面了解卵巢癌患者機(jī)體的免疫狀態(tài)，為卵巢癌的免疫治療提供理論支持。本研究發(fā)現(xiàn)，CA125與Th17、Treg、Th17/Treg呈正相關(guān)，可以從一方面顯示Th17、Treg及Th17/Treg的增高與CA125的增高速度類似，有可能與其他指標(biāo)結(jié)合，評(píng)估或診斷卵巢癌，但因本研究案例較少，所以要得出準(zhǔn)確的結(jié)果還需待以后研究。