抑制LSD1對(duì)hiPSCs向定型內(nèi)胚層分化的調(diào)控作用*

周淑艷， 李富榮， 閆紅杰， 李 陽， 楊曉菲， 張根葆

(1皖南醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室， 安徽 蕪湖 241002； 2暨南大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院， 深圳市人民醫(yī)院， 干細(xì)胞與細(xì)胞治療重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 深圳 518020)

組蛋白賴氨酸特異性去甲基化酶1(lysine specific demethylase 1, LSD1)在胚胎干細(xì)胞(embryonic stem cells, ESCs)、人誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞(human induced pluripotent stem cells, hiPSCs)和神經(jīng)干細(xì)胞等多種干細(xì)胞中表達(dá)[1-4]。LSD1主要錨定在包含二價(jià)染色體結(jié)構(gòu)的靶基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)，通過特異性去除該區(qū)域組蛋白H3第4位賴氨酸的一甲基化、 二甲基化基團(tuán)(H3K4me1/me2)而實(shí)現(xiàn)對(duì)靶基因的轉(zhuǎn)錄抑制作用[5]。文獻(xiàn)報(bào)道，利用shRNA 敲低ESCs中的LSD1基因可上調(diào)間充質(zhì)基因,如脫中胚蛋白(eomesodermin)、Y染色體性別決定區(qū)域盒17(sex determining region Y-box 17,SOX17)及叉頭盒A2(forkhead box A2,FOXA2)等的表達(dá)，促進(jìn)ESCs向定型內(nèi)胚層(definitive endoderm，DE)分化[6]。DE是胚胎發(fā)育過程中形成消化道相關(guān)臟器組織(如肝臟和胰腺)必經(jīng)的一個(gè)環(huán)節(jié)[7]。hiPSCs具有類似ESCs的全能性且無倫理學(xué)爭議，深入研究iPSCs向DE分化的相關(guān)機(jī)制能夠?yàn)閔iPSCs向肝臟和胰腺等器官組織高效分化提供理論依據(jù)。然而，hiPSCs全基因組表達(dá)譜和蛋白組學(xué)修飾方面與ESCs具有不同的特質(zhì)[8]，抑制LSD1是否也能調(diào)控hiPSCs向DE分化尚不明確?；诖耍狙芯坷?種LSD1抑制劑反苯環(huán)丙胺(tranylcypromine, TCP)和硫酸苯乙肼(phenelzine sulfate,PHZ)抑制LSD1或用shRNA敲低LSD1的表達(dá)，觀察LSD1在hiPSCs向DE分化過程中的作用，并對(duì)相關(guān)機(jī)制進(jìn)行初步探討。

材 料 和 方 法

1 細(xì)胞和shRNA構(gòu)建

hiPSCs(來源于人皮膚成纖維細(xì)胞，國際通用代碼：hNF1④C11)由深圳市人民醫(yī)院干細(xì)胞與細(xì)胞治療重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室的李富榮課題組惠贈(zèng)。攜帶shRNA-LSD1的慢病毒載體pGLV2-U6-Puro及用于感染細(xì)胞的病毒原液由上海吉瑪生物制藥有限公司制備。

2 主要試劑和儀器

hiPSCs培養(yǎng)液mTeSRTM1和消化酶AccutaseTM購自Stem Cell Technologies;Matrigel、6 孔培養(yǎng)板、T25 培養(yǎng)瓶和離心管等培養(yǎng)耗材均購自BD；嘌呤霉素(puromycin,Puro)、胰酶、DMEM/F12和兔血清購自Gibco；LSD1抑制劑(TCP和PHZ)購自Sigma；CCK-8試劑盒購自蘇州碧云天公司；總RNA提取試劑TRIzol Plus和qPCR試劑盒購自TaKaRa。核蛋白抽提試劑盒、LSD1活性檢測試劑盒和ChIP試劑盒均購自EpiGentek；蛋白質(zhì)共沉淀試劑盒Co-IP kit 購自Pierce；小鼠抗人LSD1、 H3K4me1/2/3、組蛋白去乙?；?(histone deacetylase 1, HDAC1)、阻遏物元件1沉默轉(zhuǎn)錄因子輔阻遏物(co-repressor for repressor element-1-silencing transcription factor, CoREST)和H3K9ac抗體以及小鼠IgG購自Millipore；小鼠抗人 SOX17、FOXA2和lamin B抗體以及HRP標(biāo)記的兔抗小鼠IgG購自CST;兔抗人LSD1、 HDAC1和CoREST抗體購自Active Motif。倒置顯微鏡購自Nikon；熒光定量PCR儀購自Roche；多頭PCR儀、多功能酶標(biāo)儀、SDS-PAGE 垂直電泳儀及成像分析儀購自Bio-Rad。

3 主要方法

3.1hiPSCs的培養(yǎng) hiPSCs采用無飼養(yǎng)層細(xì)胞培養(yǎng)法，接種前需用 Matrigel包被培養(yǎng)瓶和培養(yǎng)皿，采用mTeSRTM1培養(yǎng)基進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)，每天需更換新鮮培養(yǎng)液，細(xì)胞鋪板率達(dá)到80%～90%可進(jìn)行傳代。

3.2沉默或抑制LSD1的表達(dá) 接種hiPSCs，鋪板率達(dá)30%～50%時(shí)進(jìn)行病毒轉(zhuǎn)染或添加抑制劑。用包裝有4條不同shRNA-LSD1序列(LSD1-863：5’-GCAGTTGTGGTTGGATAATCC-3’；LSD1-1086：5’-GCAGCTCGACAGTTACAAAGT-3’；LSD1-927：5’-GCACCTTATAACAGTGATACT-3’；LSD1-2495：5’-GGGCTCTTATTCCTATGTTGC-3’；錯(cuò)義鏈scrambled sequence：5’-GTCAAGTCTCACTTGCGTCAC-3’作為對(duì)照)的慢病毒液分別進(jìn)行轉(zhuǎn)染，24 h后更換含有1 mg/L Puro的新鮮mTeSRTM1進(jìn)行篩選。每天更換培養(yǎng)液，連續(xù)篩選72 h。

抑制劑1反苯環(huán)丙胺的濃度梯度為0、0.5、1.5、2.5、5、7.5、10、20、30、40、60、80、120、160、200和300 μmol/L；抑制劑2硫酸苯乙肼的濃度梯度為0、0.5、1.5、2.5、5、7.5、10、15、20、30、40、80、120、160和200 μmol/L。每天更換含抑制劑的mTeSRTM1，連續(xù)培養(yǎng)72 h。

3.3hiPSCs多能及分化相關(guān)基因的檢測 取經(jīng)shRNA和抑制劑處理的hiPSCs，TRIzol試劑處理后抽提總RNA,并用PrimeScriptTMRT Reagent 試劑盒反轉(zhuǎn)錄為 cDNA，隨后用SYBR Green Premix Ex TaqTM試劑盒進(jìn)行qPCR，檢測沉默或抑制LSD1后hiPCS的多能性基因OCT4、SOX2和NANOG及各胚層標(biāo)志性基因SOX17、FOXA2、BMP2和TUBB3的 mRNA表達(dá)水平，所用引物序列見表1。

表1 qPCR引物序列

3.4hiPSCs增殖活性檢測 用Accutase將hiPSCs消化成單細(xì)胞懸液并接種至96孔板，抑制劑組每孔1.5×104細(xì)胞，每一濃度設(shè)置3孔，48 h后加藥，連續(xù)培養(yǎng)72 h；shRNA組每孔3×104個(gè)細(xì)胞/孔，每一序列設(shè)置3孔，24 h后進(jìn)行病毒轉(zhuǎn)染(轉(zhuǎn)染24 h)，隨后更換含1 mg/L Puro的新鮮mTeSRTM1連續(xù)培養(yǎng)72 h。隨后使用CCK-8法進(jìn)行細(xì)胞活性檢測。

3.5LSD1酶活性檢測 取shRNA及LSD1抑制劑處理的hiPSCs(以常規(guī)培養(yǎng)的細(xì)胞為對(duì)照)，使用EpiQuikTMNuclear Extraction Kit II (EpiGentek)抽提核蛋白，再依據(jù)EpiQuikTMHistone Demethylase LSD1 Activity/Inhibition Assay Kit (EpiGentek)測定并計(jì)算LSD1酶活性。

3.6Western blot實(shí)驗(yàn) 抽提shRNA(shRNA-LSD1-927)及LSD1抑制劑(20 μmol/L PHZ和40 μmol/L TCP)處理的hiPSCs核蛋白(以常規(guī)培養(yǎng)的細(xì)胞為對(duì)照)，定量后進(jìn)行SDS-PAGE，考馬斯亮藍(lán)染色后轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用小鼠抗人LSD1、H3K4me1/2、 SOX17、 FOXA2和lamin B 抗體(1∶1 000)4 ℃孵育過夜，再用HRP標(biāo)記的兔抗小鼠IgG(1∶3 000)室溫孵育1 h，利用ECL發(fā)光試劑盒顯影。

3.7LSD1復(fù)合體模式檢測 取shRNA-LSD1-927處理及常規(guī)培養(yǎng)(作對(duì)照)的hiPSCs，參照蛋白質(zhì)免疫共沉淀Co-IP試劑盒要求，加入細(xì)胞裂解液及蛋白酶抑制劑，離心取上清加入抗LSD1、 CoREST和HDAC1抗體(0.5～1 μg 單克隆抗體)，對(duì)照組加入等量的正常兔血清，4 ℃孵育過夜，加入Protein A beads適度孵育后離心收集beads，處理后進(jìn)行Western blot實(shí)驗(yàn)(具體操作參照3.6，Ⅰ抗?jié)舛缺攘袨?∶1 000，HRP標(biāo)記的兔抗小鼠Ⅱ抗?jié)舛缺葹?∶3 000)。

3.8ChIP-qPCR 取shRNA-LSD1-927處理及常規(guī)培養(yǎng)(作對(duì)照)的hiPSCs，參照染色質(zhì)免疫共沉淀試劑盒EZ-ChIPTMChromatin Immunoprecipitation Kit(Millipore)要求，用1%甲醛進(jìn)行交聯(lián)，裂解液裂解后超聲破碎DNA至200～1 000 bp，加入小鼠抗人LSD1、 H3K4me2/3、 HDAC1、 CoREST和H3K9ac抗體(1～10 μg)進(jìn)行孵育，加入鮭魚精/蛋白A瓊脂糖處理，洗脫后解交聯(lián)，并用純化柱收集DNA片段。qPCR分析以上目的蛋白在定型內(nèi)胚層基因SOX17和FOXA2啟動(dòng)子區(qū)域(-4 000 bp、 -2 000 bp、 -100 bp、+1 500 bp、 +2 000 bp和+4 000 bp)的結(jié)合情況，方法參見3.3，引物序列見表2。

表2 ChIP-qPCR引物序列

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

利用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件完成統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，兩組間比較用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，以P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 抑制LSD1后hiPSCs的形態(tài)變化

正常hiPSCs克隆邊界整齊，結(jié)構(gòu)致密，核質(zhì)比較高；利用抑制劑或shRNA抑制LSD1的表達(dá)后， hiPSCs克隆逐漸松散，細(xì)胞體積變大，核質(zhì)比降低，呈現(xiàn)分化狀態(tài)；將shRNA-LSD1-927組細(xì)胞傳至第3代，分化狀態(tài)更為明顯，見圖1A。

2 抑制LSD1對(duì)hiPSCs多能性和三胚層標(biāo)志基因表達(dá)的影響

qPCR結(jié)果表明，添加PHZ或TCP后，LSD1及多能性基因OCT4和NANOG表達(dá)呈劑量依賴性下調(diào)，SOX2基因總體呈下調(diào)表達(dá)趨勢,但其在TCP 80～160 μmol/L和PHZ 40～80 μmol/L區(qū)間出現(xiàn)反彈性上調(diào)表達(dá)；TCP 2.5～40 μmol/L區(qū)間是內(nèi)、中胚層分化基因SOX17、FOXA2和BMP2的上調(diào)表達(dá)區(qū)間，其中定型內(nèi)胚層標(biāo)志基因SOX17基因在TCP 40 μmol/L時(shí)上調(diào)了近10倍(P<0.01)；TCP 80～160 μmol/L區(qū)間是外胚層分化基因TUBB3上調(diào)表達(dá)區(qū)域；而PHZ 5～80 μmol/L區(qū)間是以上三胚層分化基因的共同上調(diào)表達(dá)區(qū)間，但主要上調(diào)內(nèi)、中胚層基因FOXA2和BMP2的表達(dá)，且在20 μmol/L時(shí)對(duì)FOXA2上調(diào)幅度最大(P<0.01)，見圖1B、C。

另外，4條shRNA也不同程度地抑制LSD1和多能性基因OCT4、NANOG和SOX2的表達(dá)， shRNA-LSD1-1086對(duì)OCT4的抑制作用最為強(qiáng)烈；shRNA-LSD1-863和-927處理后的hiPSCs主要上調(diào)內(nèi)、中胚層基因SOX17、FOXA2和BMP2的表達(dá)水平，其中shRNA-LSD1-927可上調(diào)SOX17基因12.7倍(P<0.01)，見圖1D。

3 抑制LSD1對(duì)hiPSCs活性的影響

CCK-8法分析，與對(duì)照組相比，TCP和PHZ分別在5 μmol/L和2.5 μmol/L時(shí)對(duì)hiPSCs活性的抑制作用開始有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，兩者均在80 μmol/L時(shí)有顯著的抑制作用(P<0.01)，見圖2A、B。4條不同序列shRNA分別處理后的 hiPSCs活性均下降， 其中shRNA-LSD1-863與shRNA-LSD1-927對(duì)hiPSCs活性的抑制能力相近， shRNA-LSD1-1086組的細(xì)胞活力最低，與對(duì)照組比較有顯著差異(P<0.01)，見圖2C。細(xì)胞生長曲線分析可見，PHZ(20 μmol/L)、TCP(40 μmol/L)及shRNA-LSD1-927 3組細(xì)胞的活性較對(duì)照組均下降，其中shRNA-LSD1-927 組活性最弱，見圖2D。

4 抑制LSD1后其酶活性水平的變化

LSD1酶活性試劑盒檢測到在2種抑制劑(4個(gè)藥物濃度)作用下LSD1酶活性均下降，與對(duì)照組相比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；與對(duì)照組相比，scrambled shRNA組的LSD1酶活性變化無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異， shRNA-LSD1-2495/-927/-863組下調(diào)且有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，見圖2E。

5 抑制LSD1對(duì)定型內(nèi)胚層相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明， 抑制或沉默LSD1(20 μmol/L PHZ組、40 μmol/L TCP組和shRNA-LSD1-927組)可上調(diào)hiPSCs核內(nèi)H3K4me1/me2蛋白表達(dá)水平(P<0.05或P<0.01)；同時(shí)，定型內(nèi)胚層標(biāo)志蛋白SOX17和FOXA2的表達(dá)在各組中均有上調(diào)， shRNA-LSD1-927組的這2種蛋白上調(diào)幅度最大，見圖2F、G。

6 LSD1與HDAC1共同存在于CoREST復(fù)合體中

IP-WB實(shí)驗(yàn)證實(shí)， LSD1、HDAC1和CoREST三者均存在于彼此的蛋白復(fù)合物中，見圖3A。

7 抑制LSD1對(duì)SOX17和FOXA2轉(zhuǎn)錄活化的調(diào)控作用

ChIP-qPCR結(jié)果表明， LSD1、CoREST和HDAC1 3種蛋白主要結(jié)合在SOX17和FOXA2啟動(dòng)子區(qū)域上游2 000～100 bp區(qū)域，shRNA-LSD1-927干預(yù)后導(dǎo)致LSD1和HDAC1在該區(qū)域的結(jié)合水平顯著下降(分別P<0.01和P<0.05)，但CoREST結(jié)合水平與對(duì)照組相比沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，見圖3B。同時(shí)，當(dāng)LSD1和HDAC1在該區(qū)域結(jié)合水平下降時(shí)，SOX17和FOXA2這一區(qū)域的H3K4me2/me3和H3K9ac富集水平顯著上升(P<0.01)，見圖3C、D。

討 論

LSD1在未分化的ESCs中表達(dá)水平較高，主要參與維持細(xì)胞的自我更新，伴隨ESCs自主分化，其表達(dá)水平逐漸下降[5]。完全敲除果蠅胚胎中的LSD1會(huì)使其組蛋白H3K4 高度甲基化且基因表達(dá)異常，最終導(dǎo)致發(fā)育終止甚至胚胎死亡[9]。RNAi抑制人ESCs的LSD1基因后，多能性基因如OCT4和SOX2下降水平不會(huì)超過50%，ESCs開啟分化狀態(tài)但仍維持著較強(qiáng)的增殖能力[5]，可見LSD1在維持ESCs增殖與分化平衡過程中至關(guān)重要。

本研究證實(shí)人皮膚成纖維細(xì)胞來源的iPSCs也高表達(dá)LSD1，利用shRNA或LSD抑制劑處理細(xì)胞后，多能性基因OCT4、SOX2和NANOG表達(dá)下降，當(dāng)OCT4基因下調(diào)超過50%時(shí)hiPSCs的活性明顯受限，且抑制LSD1能夠上調(diào)hiPSCs 3個(gè)胚層特化的標(biāo)志基因表達(dá)。Zhang等[6]利用shRNA沉默ESCs中的LSD1基因可促進(jìn)ESCs向DE分化。Whythe等[10]使用LSD1抑制劑TCP抑制ESCs后外胚層基因TUBB3提前表達(dá)。本研究證實(shí)，LSD1受抑程度不同或酶活性水平不同時(shí)，各胚層分化發(fā)育標(biāo)志性基因的上調(diào)水平也不盡相同，如在TCP 2.5～40 μmol/L時(shí)，hiPSCs內(nèi)、中胚層分化占優(yōu)勢；而在TCP 40～160 μmol/L時(shí)， TUBB3的上調(diào)表達(dá)提示hiPSCs開啟外、中胚層分化。值得注意的是，抑制LSD1后，當(dāng)OCT4表達(dá)高于SOX2時(shí)，hiPSCs傾向于內(nèi)、中胚層的分化(如TCP 2.5～40 μmol/L時(shí)和PHZ 5～20 μmol/L時(shí))；當(dāng)SOX2表達(dá)高于OCT4時(shí)利于外中或外內(nèi)胚層分化(如TCP 80～160 μmol/L時(shí)和PHZ 40～80 μmol/L)。文獻(xiàn)證實(shí)，OCT4能抑制ESCs向神經(jīng)外胚層分化，促進(jìn)中胚層和內(nèi)胚層分化，而SOX2能抑制向中胚層和內(nèi)胚層分化，促進(jìn)神經(jīng)外胚層分化，分化信號(hào)連續(xù)不均勻地調(diào)節(jié)著OCT4和SOX2蛋白水平，最終導(dǎo)致細(xì)胞命運(yùn)的選擇和分化[11-12]。我們推測，hiPSCs的LSD1酶活性程度(或受抑制程度)也可能通過影響OCT4-SOX2基因表達(dá)平衡，繼而影響其向三胚層分化的傾向。

Figure 1.Morphological changes of hiPSCs (A; scale bar=100 μm) and the mRNA expression of marker genes related to pluripotency and germ layer specification in the hiPSCs treated with TCP (B), PHZ (C) or shRNA-LSD1 (D). Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01.

圖1LSD1抑制劑或shRNA處理后hiPSCs的形態(tài)及多能性和三胚層標(biāo)志基因的mRNA表達(dá)變化

Figure 2.Effect of LSD1 inhibitors or RNAi on viability, LSD1 activity and protein levels in hiPSCs. A, B and C: the viability of hiPSCs in PHZ groups, TCP groups and shRNA-LSD1 groups tested by CCK-8 assay; D: the growth curves of hiPSCs in different experimental groups; E: LSD1 activity in the experimental groups determined by LSD1 activity assay kit; F and G: Western blot for detecting the protein levels of LSD1, H3K4me1/me2, SOX17 and FOXA2 in hiPSCs after treatment with LSD1 inhibitors and shRNA-LSD1-927. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vs0 μmol/L group;#P<0.05,##P<0.01vscontrol group.

圖2LSD1抑制劑或shRNA對(duì)hiPSCs活性、LSD1酶活性及蛋白水平的影響

Figure 3.LSD1 knockdown with shRNA-LSD1-927 enhanced transcriptional activation of definitive endoderm marker genes. A: IP-WB assay showed that LSD1 and HDAC1 co-existed with the CoREST complexes (NRS is the abbreviation of normal rabbit serum, as control); B: ChIP-qPCR assay for examining the abundance of LSD1, CoREST and HDAC1 binding to the promoters ofSOX17 andFOXA2 after shRNA-LSD1-927 treatment in hiPSCs; C and D: ChIP-qPCR assay showed the accumulation of H3K4me2, H3K4me3 and H3K9ac at the promoters ofSOX17 andFOXA2 induced byLSD1 knockdown with shRNA-LSD1-927. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vsscrambled shRNA group.

圖3shRNA-LSD1-927沉默LSD1促進(jìn)定型內(nèi)胚層標(biāo)志基因的轉(zhuǎn)錄活化

LSD1 在基因表達(dá)調(diào)控中的作用取決于特異性底物，不同的復(fù)合體模式(或分子伴侶模式)介導(dǎo)其作用于不同的底物，最終產(chǎn)生的生物學(xué)效應(yīng)也不同[13-17]。在ESCs中，LSD1 通常與CoREST及HDACs等蛋白形成復(fù)合物[13]，從而調(diào)控胚胎分化發(fā)育相關(guān)基因。CoREST 與染色質(zhì)結(jié)合后招募LSD1并使其穩(wěn)定，LSD1 作為轉(zhuǎn)錄復(fù)合抑制因子，能特異性地去除組蛋白H3K4的甲基基團(tuán)，抑制靶基因的轉(zhuǎn)錄活化[14]。本研究通過IP-WB方法證實(shí)hiPSCs核內(nèi)LSD1與HDAC1及 CoREST以復(fù)合物形式存在。ChIP-qPCR 實(shí)驗(yàn)觀察到LSD1 、CoREST及HDAC1在DE標(biāo)志基因SOX17和FOXA2啟動(dòng)子區(qū)域(上游2 000～100 bp)發(fā)生富集且三者富集位點(diǎn)基本一致，這也從側(cè)面證明了在hiPSCs中LSD1-HDAC1-CoREST蛋白復(fù)合體的存在；同時(shí)這表明LSD1復(fù)合體可直接與SOX17和FOXA2的啟動(dòng)子相結(jié)合以調(diào)控該基因的表達(dá)。當(dāng)shRNA-LSD1-927抑制LSD1后，SOX17和FOXA2啟動(dòng)子區(qū)域HDAC1結(jié)合水平顯著下降但CoREST的結(jié)合水平并未受到影響，提示盡管三者以復(fù)合體形式存在，但LSD1的表達(dá)水平或酶活性水平只會(huì)影響HDAC1與靶基因的結(jié)合，CoREST的結(jié)合能力不具有LSD1依賴性，具體機(jī)制尚不清楚。

組蛋白H3K4的甲基化修飾與基因的轉(zhuǎn)錄活化密切相關(guān)[18]?；騿?dòng)子區(qū)域H3K4me2的富集標(biāo)志著該基因會(huì)發(fā)生轉(zhuǎn)錄活化，而H3K4me3的富集則表示該基因已成功進(jìn)行轉(zhuǎn)錄活化[19]。LSD1在體外能夠去除H3K4的me1/me2但不能去除me3，但H3K4me2水平的不斷上調(diào)會(huì)促進(jìn)H3K4me3的富集[20]。本研究檢測到沉默LSD1后SOX17和FOXA2的啟動(dòng)子區(qū)域(上游100～2 000 bp)的H3K4me2富集水平顯著上調(diào)，促進(jìn)這2個(gè)基因的轉(zhuǎn)錄活化，同時(shí)該區(qū)域H3K4me3的大量富集為這2個(gè)基因表達(dá)水平顯著提高的可靠性提供了佐證。Western blot結(jié)果表明兩者的蛋白表達(dá)水平確實(shí)有明顯提高。ESCs中的LSD1-CoREST共抑制物對(duì)靶基因啟動(dòng)子區(qū)域H3K4進(jìn)行去甲基化作用時(shí)，會(huì)抑制該基因啟動(dòng)子區(qū)域H3K9ac的發(fā)生，使得靶基因持續(xù)性地轉(zhuǎn)錄失活，而H3K9ac修飾可調(diào)控靶基因轉(zhuǎn)錄活化[5]。本研究證實(shí)，當(dāng)LSD1和HDAC1在SOX17和FOXA2啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合水平下降時(shí)，H3K9ac在相同位點(diǎn)顯著富集，進(jìn)一步促進(jìn)這2個(gè)基因的轉(zhuǎn)錄活化。

綜上所述，適度抑制LSD1使其酶活性為正常水平的53.4%時(shí)利于hiPSCs向DE分化，其機(jī)制與DE分化關(guān)鍵基因SOX17和FOXA2啟動(dòng)子區(qū)域H3K4me2/me3和H3K9ac修飾水平的上調(diào)密切相關(guān)。