SIRT1/eNOS/NO通路在人參皂苷Rb1抗內(nèi)皮細胞復(fù)制性衰老中的作用*

周 彬， 余舒杰， 劉定輝， 吳 琳， 王 敏， 柯世業(yè)， 劉 勇， 郝寶順， 朱潔明， 錢孝賢， 2△

(中山大學 1附屬第三醫(yī)院心血管內(nèi)科, 2中西醫(yī)結(jié)合研究所， 廣東 廣州 510630)

21世紀全球逐步進入老齡化社會,隨著年齡增長，很多心血管疾病的發(fā)生率急劇上升[1-2]，而與增齡相關(guān)的血管內(nèi)皮細胞衰老被認為是動脈粥樣硬化性心血管疾病(arteriosclerotic cardiovascular disease，ASCVD)發(fā)生的起始環(huán)節(jié)，成為了心血管疾病不良預(yù)后的重要因素[3]。因此，探討衰老機制，尋找延緩衰老的干預(yù)方法對于年齡相關(guān)的心血管疾病的防治具有十分重要的意義。

沉默信息調(diào)節(jié)因子2同源蛋白1(silent mating type information regulation 2 homolog 1，SIRT1)是一種高度保守的依賴于煙酰胺腺嘌呤二核苷酸的去乙?；?，與調(diào)控生物體衰老和壽命密切相關(guān)，被稱為“抗衰老酶”。近年來，SIRT1/內(nèi)皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase，eNOS)/一氧化氮(nitric oxide，NO)通路活性下調(diào)被認為是參與內(nèi)皮細胞衰老的重要因素[4]。

人參皂苷Rb1(ginsenoside Rb1，Rb1)是人參中含量最多的成分，有很強的抗氧化活性，在清除自由基、調(diào)節(jié)機體免疫力、改善認知及延緩衰老等方面發(fā)揮重要作用[5]。本研究擬建立符合機體自然衰老生理情況的人臍靜脈內(nèi)皮細胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)復(fù)制性衰老模型，觀察人參皂苷Rb1延緩內(nèi)皮細胞衰老的作用，并從SIRT1/eNOS/NO通路探討人參皂苷Rb1延緩內(nèi)皮細胞衰老的機制。

材 料 和 方 法

1 材料

1.1細胞 采用原代培養(yǎng)的HUVECs。

1.2藥物和試劑 人參皂苷Rb1購自成都普菲德生物技術(shù)有限公司，分子式為C54H92O23，分子量為1 109.31，為白色粉末狀結(jié)晶，高效液相色譜鑒定純度≥98%；M199購自HyClone；胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)和I型膠原酶購自GIBCO；TRIzol試劑和轉(zhuǎn)染試劑購自Invitrogen；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和熒光定量試劑盒購自TaKaRa；引物由Life Technologies設(shè)計并合成；預(yù)染蛋白Marker購自Thermo Fisher Scientific；兔抗SIRT1、纖溶酶原激活物抑制劑1(plasminogen activator inhibitor-1, PAI-1)和GAPDH多克隆抗體購自Proteintech Group；鼠抗eNOS單克隆抗體購自Abcam；辣根酶標記羊抗兔IgG和羊抗小鼠IgG購自武漢博士德生物工程有限公司；SIRT1 siRNA (siSIRT1)、熒光標記的siRNA及相應(yīng)的陰性序列由百奧邁科生物技術(shù)有限公司設(shè)計并合成。

2 方法

2.1細胞分離培養(yǎng)及細胞“年齡”的計算 取健康無菌新生兒臍帶，在無菌條件下用PBS 沖洗3 遍，然后用0.1%Ⅰ型膠原酶消化15 min，收集膠原酶細胞混合液，1 200 r/min離心5 min，棄上清，加完全培養(yǎng)基混勻種于培養(yǎng)瓶里培養(yǎng)。當細胞生長密度達90%以上時用0.05%胰酶消化細胞，按1∶3傳代培養(yǎng)。細胞“年齡”用累積細胞群體倍增水平(cumulative population-doubling level，CPDL)表示，計算公式為：PD(population doublings)=(log10F-log10I)/0.301 (F表示細胞達到傳代水平時的細胞數(shù)；I表示上一次種入的細胞數(shù))，每次傳代計算得到的PD與之前PD總和相加即為CPDL。CPDL能比較客觀地反映細胞的“年齡”，在實驗中，比代數(shù)的重復(fù)性更好。

2.2細胞鑒定 取CPDL為2和30的細胞，由中山大學附屬第一醫(yī)院檢驗科采用流式細胞術(shù)進行細胞鑒定。

2.3細胞衰老模型建立及分組

2.3.1建立HUVECs復(fù)制性衰老模型 對不同CPDL時期的HUVECs進行細胞形態(tài)、衰老相關(guān)β-半乳糖苷酶(senescence-associated β-galactosidase, SA-β-Gal)染色以及PAI-1的蛋白表達的觀察，當上述衰老相關(guān)指標出現(xiàn)并且比較穩(wěn)定時，該CPDL時期的細胞即作為本實驗的衰老模型。

2.3.2探討Rb1抗內(nèi)皮細胞復(fù)制性衰老的最佳濃度 將CPDL為16的細胞分為對照組、20 μmol/L Rb1組、40 μmol/L Rb1組、80 μmol/L Rb1組和100 μmol/L Rb1組，將不同濃度的藥物加入細胞培養(yǎng)液中培養(yǎng)48 h,通過觀察SA-β-Gal染色陽性率選擇Rb1的最佳濃度。

2.3.3探討人參皂苷Rb1是否通過SIRT1/eNOS/NO通路抗內(nèi)皮衰老 將細胞分為對照(control)組、陰性對照(negative control, NC)組、siSIRT1組、Rb1組和siSIRT1+Rb1組，其中，siSIRT1組在內(nèi)皮細胞生長至30%～50%時進行siSIRT1轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染6 h換液繼續(xù)培養(yǎng)48 h； siSIRT1+Rb1組在轉(zhuǎn)染6 h后加入80 μmol/L人參皂苷Rb1再繼續(xù)培養(yǎng)48 h。提取細胞總RNA,檢測SIRT1、eNOS和PAI-1的mRNA表達。

2.4RNA干擾實驗 按說明書操作，制備轉(zhuǎn)染siSIRT1的HUVECs。RNA干擾序列是由百奧邁科生物技術(shù)有限公司設(shè)計合成。siSIRT1的正義鏈序列為5’-GGUCAAGGGAUGGUAUUUATT-3’， 反義鏈序列為5’-UAAAUACCAUCCCUUGACCTT-3’； siRNA陰性對照正義鏈序列為5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3’， 反義鏈序列為5’-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3’。

2.5Real-time PCR檢測SIRT1、PAI-1及eNOS的mRNA表達 取已干預(yù)并培養(yǎng)好的細胞用TRIzol提取RNA，測定并計算RNA的純度和濃度；在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下合成cDNA。Real-time PCR按照TaKaRa SYBR?PremixExTaqTMII (Tli RNaseH Plus)說明書操作。引物序列見表1。

表1 Real-time PCR引物序列

2.6Western blot實驗 取已干預(yù)和培養(yǎng)好的細胞，采用總蛋白提取試劑盒提取細胞總蛋白，用BCA法對提取的蛋白進行濃度測定。取30 μg總蛋白進行SDS-PAGE分離，然后轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。用5%脫脂奶粉室溫封閉1 h后，加入相應(yīng)I抗(SIRT1 1∶2 000， PAI-1 1∶10 000，eNOS 1∶1 000， GAPDH 1∶1 000)，4 ℃搖床過夜孵育洗膜；然后用Ⅱ抗室溫孵育1 h，在暗室中用增強化學發(fā)光檢測試劑顯色，拍片晾干，計算機掃描，采用Quantity One 軟件分析蛋白條帶。

2.7細胞培養(yǎng)上清液NO含量檢測 采用硝酸還原酶法，嚴格按試劑盒說明書操作。

3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 20.0軟件進行分析，計量資料以均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，組間均數(shù)比較采用單因素方差分析及SNK-q檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1 HUVECs的鑒定

流式細胞術(shù)檢測CPDL為2和30的內(nèi)皮細胞CD31抗原陽性率均在99%以上，符合內(nèi)皮細胞特性，見圖1。

Figure 1.Detection of CD31 expression on the surface of HUVECs by flow cytometry.

圖1流式細胞術(shù)檢測內(nèi)皮細胞表面CD31的表達

2 HUVECs復(fù)制性衰老模型的建立

隨著CPDL的增加，細胞呈現(xiàn)生長緩慢、邊界模糊、胞體增大、細胞形態(tài)由短梭形變?yōu)殚L梭形為長出長“觸角”及貼壁細胞減少等改變。CPDL為16時顯微鏡下可見部分細胞形態(tài)發(fā)生改變，CPDL為30時可見整個視野下細胞形態(tài)均發(fā)生變化，見圖2。

Figure 2.The morphological changes of HUVECs at different CPDL (×200).

圖2顯微鏡下不同CPDL的HUVECs形態(tài)

我們以每次傳代細胞的時間為橫坐標，以相應(yīng)傳代細胞時點計算所得CPDL為縱坐標繪制HUVECs的增長曲線，從中可以看出，當CPDL>25時，細胞增殖速度明顯減慢，見圖3。

Figure 3.The growth curve (CPDL) of HUVECs.

圖3HUVECs的CPDL增長曲線

隨著CPDL的增加，SA-β-Gal陽性細胞及PAI-1蛋白表達均增多，CPDL為2時幾乎沒有SA-β-Gal陽性細胞，PAI-1蛋白表達較弱; CPDL為16時SA-β-Gal陽性細胞增多，PAI蛋白表達增強;而到了CPDL為30時，幾乎所有的細胞均被藍染，PAI蛋白表達也明顯增強(P<0.05),見圖4、5。本實驗中觀察到CPDL≥16以后細胞衰老的相關(guān)指標更加穩(wěn)定，當CPDL>25時細胞增殖幾乎進入停滯平臺期，CPDL在16～25之間的HUVECs可作為復(fù)制性衰老模型進行研究，為節(jié)約時間及經(jīng)濟成本，本實驗選用CPDL為16的HUVECs進行后續(xù)的實驗研究。

3 人參皂苷Rb1對復(fù)制性衰老HUVECs的影響

不同濃度(20、40、80和100 μmol/L)的人參皂苷Rb1分別加入CPDL為16的HUVECs中，培養(yǎng)48 h后，觀察SA-β-Gal染色情況。結(jié)果顯示，人參皂苷Rb1 作用于復(fù)制性衰老HUVECs，與對照組(0 μmol/L)相比，SA-β-Gal 染色陽性細胞數(shù)明顯降低(P<0.05)，以80 μmol/L Rb1 組效果最佳，見圖6。因此，我們選擇了此濃度用于后續(xù)的研究。

4 RNA干擾SIRT1對人參皂苷Rb1抗HUVECs復(fù)制性衰老的影響

Figure 4.The numbers of SA-β-gal positive staining cells in the HUVECs at different CPDL (×200). Mean±SD.n=3.#P<0.05,##P<0.01vsCPDL 2 group;**P<0.01vsCPDL 16 group.

圖4不同CPDL內(nèi)皮細胞SA-β-gal染色陽性細胞

Figure 5.The protein expression of PAI-1 in the HUVECs at different CPDL. Mean±SD.n=3.#P<0.05,##P<0.01vsCPDL 2 group.

圖5不同CPDL的內(nèi)皮細胞PAI蛋白的表達

4.1人參皂苷Rb1和下調(diào)SIRT1表達對SIRT1、eNOS和PAI-1 mRNA表達的影響 與對照組相比，沉默SIRT1后SIRT1和eNOS的mRNA水平顯著下降，衰老相關(guān)蛋白PAI-1的mRNA水平顯著上升(P<0.05)；與對照組相比，經(jīng)人參皂苷Rb1干預(yù)后，SIRT1及eNOS的mRNA水平均明顯升高，而PAI-1的mRNA水平明顯下降(P<0.05)； siSIRT1+Rb1組的SIRT1、eNOS及PAI-1的mRNA水平與siSIRT1組相比差異無統(tǒng)計學顯著性，見圖7。

4.2人參皂苷Rb1和沉默SIRT1對SIRT1、eNOS和PAI-1 蛋白表達的影響 在檢測mRNA的基礎(chǔ)上，我們對沉默SIRT1后SIRT1、eNOS和PAI-1等蛋白表達情況也進行了檢測。與對照組相比，沉默SIRT1后SIRT1和eNOS的蛋白表達水平明顯下降，PAI-1的蛋白表達明顯增加(P<0.05)；與對照組相比，經(jīng)人參皂苷Rb1干預(yù)后，SIRT1和eNOS的蛋白表達水平均明顯升高，而PAI-1 的蛋白表達水平明顯下降(P<0.05)； siSIRT1+Rb1組的SIRT1、eNOS 及PAI-1蛋白表達水平與siSIRT1組相比，差異無統(tǒng)計學顯著性，見圖8。

Figure 6.The effect of Rb1 at different concentrations on cellular SA-β-Gal staining (×200). Senescent cells were identified as blue-stained cells by SA-β-Gal staining. Mean±SD.n=3.*P<0.05vs0 μmol/L group.

圖6不同濃度人參皂苷Rb1對細胞SA-β-gal染色的影響

Figure 7.The effect of Rb1 and down-regulation ofSIRT1 expression on the mRNA expression of SIRT1, eNOS and PAI-1. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group.

圖7人參皂苷Rb1和下調(diào)SIRT1的表達對衰老細胞SIRT1、eNOS及PAI-1mRNA表達的影響

4.3人參皂苷Rb1和沉默SIRT1對NO含量的影響 eNOS蛋白和活性的變化直接證據(jù)是影響NO的產(chǎn)生，因此我們收集細胞上清液對NO的濃度也同時進行了檢測。與對照組相比，siSIRT1組 NO的濃度明顯降低(P<0.05)，Rb1組NO的濃度明顯升高(P<0.05)；而siSIRT1+Rb1組NO的濃度與SIRT1 siRNA組相對無明顯變化，見圖9。

Figure 8.The effect of Rb1 and down-regulation ofSIRT1 expression on the protein expression of SIRT1, eNOS and PAI-1. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group.

圖8人參皂苷Rb1和下調(diào)SIRT1的表達對衰老細胞SIRT1、eNOS及PAI-1蛋白表達的影響

Figure 9.The effects of Rb1 and down-regulation ofSIRT1 expression on NO concentration in the cell culture supernatant. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group.

圖9人參皂苷Rb1和下調(diào)SIRT1的表達對衰老細胞上清液NO含量的影響

討 論

本課題研究發(fā)現(xiàn)，80 μmol/L人參皂苷Rb1能明顯上調(diào)SIRT1表達，促進eNOS的合成，增加NO的含量，延緩內(nèi)皮細胞復(fù)制性衰老。

衰老的內(nèi)皮細胞與年齡相關(guān)性血管疾病如動脈粥樣硬化等密切相關(guān)[6-10]。細胞衰老模型分為復(fù)制性衰老模型和早熟性衰老模型，復(fù)制性衰老模型由于更符合人體自然衰老的生理過程，目前得到越來越多的研究和應(yīng)用。本實驗中觀察到，CPDL≥16以后細胞衰老出現(xiàn)的相關(guān)指標更加穩(wěn)定。鏡下觀察內(nèi)皮細胞體積變大，邊界模糊，形態(tài)扁平，其衰老染色陽性率超過50%，同時PAI-1的表達也明顯增多，衰老表型和分子變化符合細胞衰老模型的特點。

衰老是一個極為復(fù)雜的過程，受多種因素調(diào)控。目前關(guān)于衰老的理論主要有自由基學說、DNA損傷、端粒學說和炎癥學說等。Sirtuins家族的發(fā)現(xiàn)為衰老機制的深入研究提供了新的方向。SIRT1作為與酵母Sir2同源性最高的組蛋白去乙?；福瑓⑴c了細胞內(nèi)多種生理功能的調(diào)節(jié)，包括代謝調(diào)節(jié)、自噬作用和炎性反應(yīng)等[11]，在細胞衰老和神經(jīng)退行性疾病中表現(xiàn)出很強的保護作用，成為目前研究的熱點。

近年來，研究發(fā)現(xiàn)，SIRT1在血管內(nèi)皮功能及神經(jīng)系統(tǒng)中的作用主要是通過調(diào)節(jié)eNOS/NO系統(tǒng)而實現(xiàn)的。SIRT1/eNOS被認為是治療增齡相關(guān)性疾病及抗衰老的潛在靶點[4]。有研究表明，在衰老的小鼠主動脈內(nèi)皮細胞中，SIRT1表達以及磷酸化的eNOS明顯減少，而乙酰化的eNOS明顯增多，NO生成減少[12]。Xia等[13]在采用SIRT1激動劑白藜蘆醇觀察衰老的研究中發(fā)現(xiàn)，SIRT1還可以促進eNOS啟動子激活而調(diào)控eNOS的合成。

人參是我國傳統(tǒng)的中醫(yī)藥材，具有廣泛的藥理活性，在我國已有上千年的應(yīng)用歷史，素有“百草藥王”之美稱?，F(xiàn)代醫(yī)學認為，人參能補五臟，有很強的抗疲勞、延緩衰老、提高機體代謝與免疫的功能，久服可延年益壽。已有研究發(fā)現(xiàn)，人參皂苷Rb1 對血管內(nèi)皮及神經(jīng)細胞具有保護作用[14-16]。我們課題組既往研究也發(fā)現(xiàn)人參皂苷Rb1 可能通過改善氧化應(yīng)激發(fā)揮延緩H2O2誘導的人臍靜脈內(nèi)皮細胞早熟性衰老的作用[17]。本實驗在我們既往研究基礎(chǔ)上，建立內(nèi)皮細胞復(fù)制性衰老模型，進一步探討人參皂苷Rb1抗內(nèi)皮細胞復(fù)制性衰老的機制。結(jié)果顯示，人參皂苷Rb1干預(yù)后，SIRT1和eNOS表達及NO的生成均明顯增加，而SA-β-Gal染色陽性細胞數(shù)目和PAI-1表達明顯減少；我們進一步沉默SIRT1后發(fā)現(xiàn)，衰老細胞eNOS的mRNA和蛋白表達明顯減少，NO生成減少，PAI-1表達明顯增加；然而，在沉默SIRT1基礎(chǔ)上加用人參皂苷Rb1干預(yù)，上述指標并未見明顯變化。這說明，人參皂苷Rb1可以上調(diào)SIRT1表達，促進eNOS的合成，增加NO的含量，從而延緩內(nèi)皮細胞復(fù)制性衰老。若對SIRT1進行RNA干擾，則eNOS 表達下降，NO的合成減少，同時人參皂苷Rb1不能發(fā)揮抗內(nèi)皮細胞衰老的作用，這些數(shù)據(jù)顯示了SIRT1/eNOS/NO在人參皂苷Rb1抗內(nèi)皮細胞復(fù)制性衰老中具有重要地位。

本研究結(jié)果表明人參皂苷Rb1可通過調(diào)控SIRT1/eNOS/NO信號通路延緩復(fù)制性內(nèi)皮細胞衰老。本課題探討了人參皂苷Rb1延緩復(fù)制性內(nèi)皮細胞衰老的可能機制，但仍需在體內(nèi)及臨床研究中進一步論證，最終用于ASCVD的防治。