井岡霉素A對枯草芽胞桿菌R31生長和生物被膜形成的影響

樊勝南，陳川雁，喻國輝，黎永堅，陳燕紅，溫書恒

（1.珠海市現(xiàn)代農(nóng)業(yè)發(fā)展中心，廣東 珠海 519075；2.廣東植物龍生物技術(shù)股份有限公司，廣東 珠海 519075）

井岡霉素是我國用量最大、最為成功的微生物殺菌劑之一［1］，是上海市農(nóng)藥研究所20世紀(jì)70年代開發(fā)的一種氨基葡萄糖苷類農(nóng)用抗生素，與日本的有效霉素結(jié)構(gòu)相同，由吸水鏈霉菌的不同變種產(chǎn)生。其有效成分為井岡霉素A，在我國被大量用于水稻紋枯病、稻曲病、小麥紋枯病等真菌病害的防治［1-2］，其作用機理主要涉及對真菌海藻糖酶活性、纖維素降解酶、多聚半乳糖醛酸酶和肌醇生物合成活性的抑制，并能夠誘導(dǎo)植物產(chǎn)生系統(tǒng)抗性［3-4］。

井岡霉素和芽胞桿菌類殺菌劑混用可以協(xié)同增效，提高對水稻紋枯病等［5-9］病害的防治效果，這可能與井岡霉素能夠促進(jìn)這些芽胞桿菌在防治對象定殖并形成優(yōu)勢種群有關(guān)［10］。研究表明，生物被膜形成能力直接影響芽胞桿菌在寄主根際或葉際定殖，并最終影響芽胞桿菌對病害的防治效果［11-15］。芽胞桿菌生物被膜的形成受多種外部因素的影響，如植物根系分泌的蘋果酸［12］或多糖［16］，一些土壤微生物的次生代謝產(chǎn)物如表面活性素、制霉菌素等［17-18］。微生物產(chǎn)生的抗生素在亞致死濃度時具有誘導(dǎo)微生物產(chǎn)生生物被膜的作用［19］，而井岡霉素是土壤鏈霉菌產(chǎn)生的抗生素，兩者都是土壤中最常見的微生物［20］，是否通過產(chǎn)生的抗生素發(fā)生互作尚不清楚。

為探索井岡霉素A對芽胞桿菌游離生長和生物被膜形成的影響，本研究選擇枯草芽胞桿菌R31為研究對象?？莶菅堪麠U菌R31是一株廣譜抗真菌植物內(nèi)生芽胞桿菌［21］，具有持續(xù)控制香蕉枯萎病的能力［22］。R31能夠在香蕉、粉蕉和西芹根際和根圍長期定殖［23-24］，其對香蕉枯萎病的防治效果與其能在根系表面形成生物被膜，作為生物屏障阻礙香蕉枯萎病病菌的侵染有關(guān)［25-26］。本文通過測定井岡霉素A對枯草芽胞桿菌R31游離生長和生物被膜形成的影響，了解井岡霉素A對枯草芽胞桿菌R31的影響方式，為進(jìn)一步開發(fā)和提高R31對大田作物的防效提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試菌株：枯草芽胞桿菌R31，由珠海市現(xiàn)代農(nóng)業(yè)發(fā)展中心農(nóng)業(yè)微生物學(xué)實驗室分離保藏。供試培養(yǎng)基：LB培養(yǎng)基、BGM（Biofilm growth medium）培養(yǎng)基［27］。供試試劑：純度99.0%井岡霉素A標(biāo)準(zhǔn)品（北京勤誠亦信科技開發(fā)有限公司）、井岡霉素A60%原藥（武漢科諾生物農(nóng)藥有限公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 枯草芽胞桿菌R31的活化和培養(yǎng)將-20℃保存的甘油種在LB上劃線，37℃靜置培養(yǎng)24 h，挑單菌落接種到5 mL LB液體培養(yǎng)基中，37℃、200 r/min振蕩過夜培養(yǎng)，發(fā)酵液作為種子液，以1%的量接入5 mL新鮮LB培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至對數(shù)生長中期，用于生物被膜形成測定。

1.2.2 井岡霉素A標(biāo)準(zhǔn)品對R31生物被膜形成的影響測定 用新鮮的BGM培養(yǎng)基稀釋上一步培養(yǎng)獲得的發(fā)酵液，使其OD600為0.02，在稀釋好的培養(yǎng)液中添加不同濃度（36、60、100、150、200、300 μg/mL）井岡霉素A標(biāo)準(zhǔn)品，以不添加井岡霉素A標(biāo)準(zhǔn)品為對照，混勻后分裝到2 mL離心管中，每管1 mL，于37℃靜止培養(yǎng)3 d，觀察生物被膜形成情況。

1.2.3 生物膜的定量測定 參照文獻(xiàn)［27］方法，將BGM培養(yǎng)基和未附著的菌體從離心管中移走，然后用無菌水清洗以去除游離的菌體，并用濾紙條吸收離心管壁上附著的水珠。加入1%結(jié)晶紫1.5 mL，室溫下染色20 min，染色結(jié)束后，移走多余的結(jié)晶紫，用無菌水洗滌到無色，然后加入33%冰乙酸1.5 mL 洗脫結(jié)晶紫，測定洗脫液OD570值，用于判斷生物被膜的厚度。

1.2.4 60%井岡霉素A對R31生物被膜形成的影響測定 考慮井岡霉素A標(biāo)準(zhǔn)品的成本問題，后續(xù)研究選用60%井岡霉素A原粉開展。為校正標(biāo)準(zhǔn)品和60%井岡霉素A原粉的差異，采用同一方法檢測同濃度下60%井岡霉素A對R31生物被膜形成的影響。R31的培養(yǎng)和稀釋步驟同上，將稀釋好的培養(yǎng)液中添加不同濃度的60%井岡霉素A原粉，使井岡霉素A的濃度分別為 36、60、100、150、200、300 μg/mL，以不添加60%井岡霉素A為對照。其他步驟同上。

1.2.5 60%井岡霉素A對R31震蕩培養(yǎng)條件下游離生長的影響測定 根據(jù)1.2.2和1.2.4的測定結(jié)果，井岡霉素A在60 μg/mL時顯著抑制R31生物被膜形成，在100 μg/mL時對R31的生物被膜形成無影響，在200 μg/mL時顯著促進(jìn)R31的生物被膜形成，因此選擇上述3個井岡霉素A濃度測定其對震蕩培養(yǎng)R31的生長影響。R31的活化如前所述，培養(yǎng)至對數(shù)中期的R31發(fā)酵液按照1%的接種量接種到LB培養(yǎng)基中，分別為100 mL瓶裝10 mL和50 mLLB培養(yǎng)基，以區(qū)別溶氧量，然后加入相應(yīng)濃度的60%井岡霉素A，以不加60%井岡霉素A為對照，37℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)，并在培養(yǎng)1、2、4、6、8、10、12 h測定發(fā)酵液OD600，繪制生長曲線。

1.2.6 60%井岡霉素A對R31震蕩培養(yǎng)發(fā)酵液中胞外多糖的影響測定 按照1.2.5的方法培養(yǎng)R31，培養(yǎng)體系選擇100 mL瓶裝10 mL LB培養(yǎng)基，在培養(yǎng)1、2、4、6、8、10、12 h分別取2 mL發(fā)酵液入10 mL離心管中，加入兩倍體積的95%的乙醇，充分混勻4℃下靜止30 min，4 000 r/min離心15 min，去上清，加5 mL乙醇靜止10 min，同等條件下離心去上清。將沉淀轉(zhuǎn)移到已經(jīng)稱量好的錫箔紙（W1）中，于105℃下烘干至恒重。冷卻至室溫后稱重（W2），W2與W1的差值為多糖的重量［28］。

1.2.7 1%海藻糖添加對R31震蕩培養(yǎng)條件下游離生長的影響測定 按照1.2.4的方法培養(yǎng)R31，培養(yǎng)體系選擇100 mL瓶裝10 mL LB培養(yǎng)基。試驗設(shè)1%海藻糖，1%海藻糖加60%井岡霉素A 60 、100、200 μg/mL，以及不加海藻糖和井岡霉素的對照5個處理，培養(yǎng)1、2、4、6、8、10、12 h后測定發(fā)酵液的OD600，繪制生長曲線。

試驗數(shù)據(jù)采用DPS7.05軟件進(jìn)行方差分析和鄧肯新復(fù)極差法檢驗，并用Excel 2007軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 井岡霉素A標(biāo)準(zhǔn)品對R31生物被膜形成的影響

從圖1可以看出，井岡霉素A對枯草芽胞桿菌生物被膜形成的影響存在非線性關(guān)系的濃度效應(yīng)，井岡霉素A 36、60 μg/mL處理對R31的生物被膜無顯著影響，但井岡霉素A 100 μg/mL處理顯著抑制R31生物被膜的形成。隨著井岡霉素A濃度繼續(xù)升高，其對R31生物被膜形成的抑制轉(zhuǎn)成促進(jìn)，井岡霉素A 200 μg/mL處理R31生物被膜厚度顯著高于對照。

圖1 井岡霉素A標(biāo)準(zhǔn)品對枯草芽胞桿菌R31生物被膜形成的影響

2.2 60%井岡霉素A原粉對R31生物被膜形成的影響

從圖2可以看出，60%井岡霉素A原粉按照標(biāo)準(zhǔn)品相應(yīng)濃度處理后對枯草芽胞桿菌R31生物被膜形成的影響規(guī)律同標(biāo)準(zhǔn)品一致，唯一不同的是添加60%井岡霉素A原粉333 μg/mL配置成井岡霉素A終濃度為200 μg/mL的處理未顯著促進(jìn)R31生物被膜形成，與標(biāo)準(zhǔn)品的結(jié)果有差異，可能與60%井岡霉素A粉劑中活性成分的濃度存在一定偏差有關(guān)。

圖2 60%井岡霉素A對枯草芽胞桿菌R31生物被膜形成的影響

2.3 60%井岡霉素A原粉對R31震蕩培養(yǎng)條件下游離生長的影響

溶解氧對R31的生長存在一定影響，溶解氧越充足，R31的游離生長狀態(tài)越好，表現(xiàn)為OD600值高，溶解氧不充足時R31的游離生長受到影響，表現(xiàn)為OD600值低（圖3）。溶解氧充足的狀態(tài)下，不同濃度的井岡霉素A對R31的生長表現(xiàn)出先抑制后促進(jìn)的特點。培養(yǎng)6 h，井岡霉素A各處理間的OD600無顯著差異，但顯著低于對照；培養(yǎng)8 h，對照和低濃度（60 μg/mL）60%井岡霉素A處理的OD600顯著高于另外2個高濃度處理；培養(yǎng)10 h后，井岡霉素A不同濃度處理的OD600均顯著高于對照。

當(dāng)培養(yǎng)體系中溶氧狀況較差時，各濃度的井岡霉素A對R31生長影響的總體趨勢沒有變化（圖3），但不同培養(yǎng)時間的情況存在差異。培養(yǎng)6 h，對照生長最好，不同濃度的井岡霉素A對R31的生長抑制表現(xiàn)為濃度越高、抑制越明顯；培養(yǎng)8 h，加入井岡霉素A的處理仍然抑制R31的生長，但以井岡霉素A 100 μg/mL的處理抑制最強；培養(yǎng)10 h，井岡霉素A 100 μg/mL處理對R31的顯著v抑制轉(zhuǎn)為顯著促進(jìn)，另外兩個處理仍表現(xiàn)為顯著抑制；培養(yǎng)12 h，所有井岡霉素A處理均表現(xiàn)為對R31生長顯著促進(jìn)，但存在濃度效應(yīng)：濃度越高，促進(jìn)的效果越差。說明在溶氧不足的情況下，游離生長的R31更容易受井岡霉素A的抑制。但當(dāng)R31的菌體達(dá)到一定濃度時，抑制則轉(zhuǎn)化為促進(jìn)作用。

圖3 井岡霉素A對枯草芽胞桿菌R31生長的影響

2.4 60%井岡霉素A對振蕩培養(yǎng)R31胞外多糖產(chǎn)生的影響

從表1可以看出，除培養(yǎng)2 h檢測到60 μg/mL井岡霉素A處理R31胞外多糖含量顯著高于其他處理外，其他培養(yǎng)時間各處理間差異不顯著，顯示井岡霉素A對R31游離生長時胞外多糖的分泌無影響。

表1 不同濃度60%井岡霉素A處理枯草芽胞桿菌R31胞外多糖分泌量（g/L）

2.5 1%海藻糖促進(jìn)R31生長和消除井岡霉素A對R31生長抑制作用

從圖4可以看出，海藻糖的加入可以促進(jìn)R31生長，并消除不同濃度井岡霉素A對R31生長的抑制。培養(yǎng)6 h，除60%井岡霉素A 100μg/mL處理表現(xiàn)為抑制R31生長外，其他所有處理都表現(xiàn)為促進(jìn)R31生長，而不加海藻糖的井岡霉素A各濃度處理此時均顯著抑制R31的生長（圖3A）。培養(yǎng)8 h，所有加入海藻糖后的井岡霉素A處理均促進(jìn)R31的生長。在不同濃度井岡霉素A處理中加入1%的海藻糖，能不同程度消除井岡霉素A在R31生長前期的抑制效應(yīng)，但是在井岡霉素A 60 μg/mL和200 μg/mL處理中能較早消除抑制，而在井岡霉素A 100 μg/mL處理中，則需要延遲2 h才能消除抑制，具體原因還需進(jìn)一步研究。

圖4 1%海藻糖促進(jìn)枯草芽胞桿菌R31生長并消除井岡霉素A對R31生長的抑制

3 結(jié)論與討論

生物被膜形成是芽胞桿菌類生防菌在自然界定殖并發(fā)揮防效的先導(dǎo)機制［11］，當(dāng)其在植物葉際或根系表面形成生物薄膜后，就可以與病原菌競爭生態(tài)位，并通過釋放各種抑菌物質(zhì)來影響病原菌的生長與定殖，或影響植物的抗性，以達(dá)到防治病害的效果［12-15］?？莶菅堪麠U菌R31在大田中對香蕉枯萎病表現(xiàn)出良好的防治效果，與其具有較強生物被膜的形成能力有關(guān)［26］。研究表明，井岡霉素A可以促進(jìn)枯草芽胞桿菌在寄主根際和葉際定殖［5］，顯示井岡霉素A可能對枯草芽胞桿菌的生物被膜形成產(chǎn)生影響。通過測定井岡霉素A對枯草芽胞桿菌R31生物被膜形成的影響發(fā)現(xiàn)，井岡霉素A在低濃度（36、60 μg/mL）可以促進(jìn)R31的生物被膜形成，在較高濃度（200 μg/mL）才可以顯著促進(jìn)R31的生物被膜形成，這與陳志誼等［5］報道的結(jié)果非常吻合：使用5%井岡霉素與Bs916對半混合使用時，混合后體系的井岡霉素A濃度為250 mg/mL，稀釋后最終噴施時的井岡霉素A濃度會更低，但仍然在生產(chǎn)上表現(xiàn)出對Bs916定殖的增效作用。利用5%井岡霉素和200億孢子/g枯草芽胞桿菌可濕性粉劑開展的研究也表現(xiàn)出類似結(jié)果，當(dāng)兩者1：1混配，混配系統(tǒng)中井岡霉素A的濃度達(dá)到125 mg/L時，對小麥紋枯病的預(yù)防效果達(dá)到75.1%，超過50%多菌靈和5%井岡霉素可濕性粉劑［8］，室內(nèi)測定的防效隨井岡霉素濃度增加而增加。這些文獻(xiàn)報道與本研究結(jié)果一致，說明井岡霉素A和芽胞桿菌協(xié)同增效的機制通過井岡霉素A促進(jìn)芽胞桿菌生物被膜形成來實現(xiàn)，但井岡霉素A通過哪種機制來促進(jìn)枯草芽胞桿菌生物被膜的形成，值得深入研究。

井岡霉素A在100 mg/mL時表現(xiàn)出對枯草芽胞桿菌生物被膜形成的抑制，與嚴(yán)清平等［10］報道結(jié)果一致，利用60%井岡霉素A開展的平板抑菌實驗也顯示，100 mg/mL的井岡霉素A對12株參加測試芽胞桿菌中的9株表現(xiàn)出抑制作用，但繼續(xù)增加井岡霉素A的濃度，抑制反而轉(zhuǎn)成促進(jìn)，顯示高濃度的井岡霉素A和枯草芽胞桿菌制備成復(fù)合制劑還是可能的。

井岡霉素A對游離生長的枯草芽胞桿菌表現(xiàn)出抑制，溶氧充足，芽胞桿菌生長速度快的，能夠較早消除抑制，此時，井岡霉素A對芽胞桿菌的抑制轉(zhuǎn)化成促進(jìn)作用，而溶氧不足，菌株生長緩慢的，抑制時間延長，但最終都轉(zhuǎn)換成促進(jìn)作用。顯示井岡霉素A對芽胞桿菌的抑制存在菌體濃度效應(yīng)，這可能與芽胞桿菌自身的群體感應(yīng)有關(guān)。在液體培養(yǎng)基中，枯草芽胞桿菌生物被膜形成被啟動的基礎(chǔ)菌體濃度是3×107CFU/mL［29］，當(dāng)枯草芽胞桿菌菌體濃度未達(dá)到啟動生物被膜形成的濃度時，生長受到井岡霉素A的抑制，一旦菌體濃度達(dá)到足夠啟動生物被膜形成后，由于某種未知機制，井岡霉素A轉(zhuǎn)而促進(jìn)枯草芽胞桿的生長。

井岡霉素A的生物活性之一是抑制真菌或昆蟲的海藻糖酶活性，影響真菌和昆蟲對海藻糖的利用并最終發(fā)揮防效，在培養(yǎng)基中添加1%的海藻糖可以恢復(fù)井岡霉素A對枯草芽胞桿菌游離生長的抑制，顯示其對R31游離生長的抑制與對R31海藻糖的利用影響有關(guān)，但具體通過哪些途徑影響R31的海藻糖代謝尚需進(jìn)一步研究。胞外多糖是枯草芽胞桿菌生物被膜中的主要成分之一，但對井岡霉素A不同處理的不同培養(yǎng)時間點R31培養(yǎng)液中胞外多糖的定量測定，差異不顯著，顯示井岡霉素A可能不是通過影響R31胞外多糖的產(chǎn)生而影響其生物被膜的形成。

井岡霉素和枯草芽胞桿菌都是我國重要的生物農(nóng)藥，本研究發(fā)現(xiàn)井岡霉素A可以促進(jìn)枯草芽胞桿菌的生物被膜形成，對生產(chǎn)上進(jìn)一步開發(fā)兩種生物農(nóng)藥以擴(kuò)大防治對象和提高防效具有重要的意義，同時也為進(jìn)一步開展基礎(chǔ)研究以揭示兩者作用機理奠定了理論基礎(chǔ)。