分光光度法檢測(cè)酶促反應(yīng)中底物的量

吳蕾 查春旺

摘 要：在化學(xué)實(shí)驗(yàn)中酶促反應(yīng)是十分常用的反應(yīng)方式，我們時(shí)常利用這種反應(yīng)方式來(lái)對(duì)底物的量進(jìn)行檢測(cè)。由于酶自身所具有的特性，應(yīng)用這種反應(yīng)方式我們可以知道，當(dāng)酶與底物進(jìn)行結(jié)合之后，反應(yīng)液中會(huì)出現(xiàn)游離的氨基酸逐漸的增多這一現(xiàn)象，并且反應(yīng)液中所存在的游離氨基酸其自身的含量與底物的含量相同，因此利用這一方式我們可以有效的確定出底物的量，利用這一特性我們可以建立分光光度法，利用這一方法更加快捷的對(duì)底物的含量進(jìn)行檢測(cè)。

關(guān)鍵詞：分光光度法 酶促反應(yīng) 底物 分析與討論

中圖分類(lèi)號(hào)：R927.2 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1672-3791（2018）06（a）-0151-02

酶檢測(cè)法由于其自身的特異性較強(qiáng)，所以在進(jìn)行化學(xué)實(shí)驗(yàn)的過(guò)程中常常會(huì)被應(yīng)用在結(jié)構(gòu)的分析或是進(jìn)行化學(xué)性質(zhì)的鑒定，利用這種方式來(lái)進(jìn)行底物的量的檢測(cè)過(guò)程中無(wú)須進(jìn)行相對(duì)于復(fù)雜的預(yù)處理，其自身的檢測(cè)速度比起其他的方式更加的快速，根據(jù)實(shí)際檢驗(yàn)可以知道現(xiàn)階段的蔗糖酶α-淀粉酶、己糖激酶或是糖化酶這三種酶自身都可以用作這一實(shí)驗(yàn)反應(yīng)的過(guò)程中，并且利用這一方面來(lái)進(jìn)行底物的量的檢測(cè)專(zhuān)一性更強(qiáng)，靈敏度也更高，在進(jìn)行底物的量檢測(cè)過(guò)程中我們可以利用分光光度法進(jìn)行檢測(cè)，這樣可以提高檢測(cè)的效率，更加方便我們進(jìn)行檢測(cè)，本文的主要目的就是對(duì)分光光度法檢測(cè)酶促反應(yīng)中底物的量進(jìn)行簡(jiǎn)單的分析和討論。

1 實(shí)驗(yàn)材料與實(shí)驗(yàn)的方法

1.1 實(shí)驗(yàn)所用的主要材料

在進(jìn)行實(shí)驗(yàn)的過(guò)程中其主要的材料有以下幾種：α-淀粉酶、可溶性的淀粉、DL-蘋(píng)果酸、蔗糖酶、NACL、NA2HPO4、NAH2PO4。在進(jìn)行實(shí)驗(yàn)的過(guò)程中，要求實(shí)驗(yàn)用水必須為雙蒸水。

1.2 實(shí)驗(yàn)的方法

在進(jìn)行實(shí)驗(yàn)的過(guò)程中我們首先需要對(duì)溶液進(jìn)行配制，然后需要根據(jù)不同的環(huán)境和反應(yīng)下對(duì)實(shí)驗(yàn)反應(yīng)進(jìn)行測(cè)定和記錄。

1.2.1 實(shí)驗(yàn)所用的溶液的配制

有關(guān)蔗糖酶溶液在進(jìn)行實(shí)驗(yàn)的過(guò)程中的配制方式：首先在進(jìn)行實(shí)驗(yàn)之前抽取一定量的蔗糖酶將其溶于PBS的緩沖液中，要求PBS的緩沖液其自身為pH6.9，濃度為0.02mol/L對(duì)其進(jìn)行配置，將其分別的配成溶液中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)約為0.02%～0.028%的蔗糖酶溶液。

有關(guān)蔗糖溶液在進(jìn)行實(shí)驗(yàn)的過(guò)程中的配制方式：首先在進(jìn)行實(shí)驗(yàn)之前抽取一定量的蔗糖，將其分別的溶于PBS的緩沖液中，要求兩個(gè)PBS的緩沖液其自身的pH不同，而濃度均為0.02mol/L，并且將其制成PH質(zhì)量分?jǐn)?shù)為8.1%的蔗糖溶液以及pH為7.9的0.021%～0.076%的蔗糖溶液。

有關(guān)茚三酮溶液在進(jìn)行實(shí)驗(yàn)的過(guò)程中的配制方式：首先在進(jìn)行實(shí)驗(yàn)之前稱取0.52g的茚三酮，并將其溶于體積為100mL的雙蒸水中，得到5.2g/L的茚三酮水溶液，并將其保存在棕色瓶中。

1.2.2 在酶促反應(yīng)中生成游離的氨基酸的測(cè)定

在對(duì)酶促反應(yīng)中所生成的游離的氨基酸進(jìn)行測(cè)定的過(guò)程中，我們需要做到的是在比色管中分別加入體積為1mL的蔗糖酶溶液以及體積為1.5mL的蔗糖溶液，在反應(yīng)完全之后分別在兩個(gè)比色管中加入1mL，5g/L的茚三酮溶液，然后將兩個(gè)比色管放入溫度為95℃的水中進(jìn)行時(shí)間為30min的水浴，水浴結(jié)束后需要將兩個(gè)比色管進(jìn)行避光處理，時(shí)間為1h，最后在波長(zhǎng)為570nm的分光光度計(jì)中測(cè)定其自身的吸光度，在實(shí)驗(yàn)中我們也可以利用PBS的緩沖溶液來(lái)代替蔗糖溶液作為實(shí)驗(yàn)中的空白對(duì)照。

1.2.3 溫度對(duì)于游離氨基酸含量的影響

在進(jìn)行實(shí)驗(yàn)的過(guò)程中為了測(cè)量溫度對(duì)于游離氨基酸含量的影響，我們需要將體積為1.0mL，含量為0.02%的蔗糖酶溶液以及體積為1.5mL的pH值為6.9的8.00%的蔗糖溶液進(jìn)行實(shí)驗(yàn)測(cè)量，將兩種溶液分別在40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃中進(jìn)行時(shí)長(zhǎng)為1min的預(yù)熱，然后每組3個(gè)平行，反應(yīng)的時(shí)間均為2min，以此來(lái)測(cè)量溫度對(duì)于游離氨基酸含量的影響。

1.2.4 pH值對(duì)于游離的氨基酸含量的影響

將含量為8.00%的蔗糖溶液與含量為0.02%的蔗糖溶液分別進(jìn)行配置，將其配置成pH為5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0的溶液，然后比色管放在溫度為50℃的環(huán)境下進(jìn)行時(shí)長(zhǎng)為2min的反應(yīng)，然后在波長(zhǎng)為570nm的分光光度計(jì)中測(cè)定其自身的吸光度。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1 游離的氨基酸含量的測(cè)定結(jié)果

在反應(yīng)結(jié)束后分別取含量為0.10%的蔗糖酶以及含量為0.08%的蔗糖、含量為0.20的α-淀粉酶、含量為0.60%的淀粉溶液，對(duì)其進(jìn)行分組反應(yīng)以此來(lái)測(cè)定反應(yīng)液中游離氨基酸的含量，如圖1所示。

從圖1中我們可以清楚的看出，蔗糖、蔗糖酶、α-淀粉酶、淀粉這4種溶液中其自身的游離氨基酸含量十分的少，而在酶與底物進(jìn)行反應(yīng)之后其反應(yīng)液中所含有的游離氨基酸的量明顯增多。

2.2 反應(yīng)的溫度對(duì)于游離氨基酸含量的影響

在實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行過(guò)程中隨著溫度在不斷的升高，隨著溫度的升高，蔗糖酶反應(yīng)液中其自身的吸光度首先會(huì)隨著溫度的不斷增加進(jìn)行緩慢的增加，在增加到一定的值之后開(kāi)始逐漸的降低，為此在進(jìn)行溫度的選擇過(guò)程中不能夠過(guò)高也不能夠過(guò)低，為此選擇50℃來(lái)作為蔗糖酶的酶促反應(yīng)是最佳的反應(yīng)溫度，如圖2所示。會(huì)出現(xiàn)這種現(xiàn)象的原因有兩點(diǎn)。

2.2.1 溫度的升高導(dǎo)致分子運(yùn)動(dòng)速率加快

分子運(yùn)動(dòng)的速度會(huì)隨著溫度的增高而增快，這樣就直接加快了分子的碰撞概率使得反應(yīng)的速率加快，同時(shí)也就直接的提高了反應(yīng)液中游離氨基酸的含量。

2.2.2 溫度的升高會(huì)導(dǎo)致酶蛋白變形失活

一旦在進(jìn)行反應(yīng)的過(guò)程中酶蛋白變形失活就會(huì)導(dǎo)致酶促反應(yīng)速率的降低，這就是溫度的升高會(huì)導(dǎo)致吸光度逐漸的降低的原因。

2.3 pH值對(duì)于游離的氨基酸含量的影響

在進(jìn)行實(shí)驗(yàn)的過(guò)程中隨著蔗糖溶液自身的PH增大，其反應(yīng)液的吸光度會(huì)出現(xiàn)先逐漸增大而后逐漸的減小，如圖3所示可以知道其自身吸光度最大時(shí)反應(yīng)液的pH值為8。在進(jìn)行底物的pH選擇過(guò)程中需要我們從多方面來(lái)進(jìn)行考慮，由于pH不同會(huì)影響酶促反應(yīng)、影響茚三酮的顯色反應(yīng)同時(shí)也會(huì)對(duì)游離的氨基酸含量有影響，所以在進(jìn)行pH的選擇過(guò)程中需要我們綜合的考慮到每一個(gè)方面。

3 結(jié)語(yǔ)

根據(jù)本文綜上所述可以知道，在進(jìn)行酶促反應(yīng)的過(guò)程中利用分光光度法來(lái)進(jìn)行底物含量的檢測(cè)可以有效的幫助我們更為準(zhǔn)確的確定好數(shù)據(jù)，同時(shí)簡(jiǎn)化操作的困難性，以蔗糖酶來(lái)作為實(shí)例可以知道，根據(jù)該方法自身的線性回歸方程：y=324.57x+0.0124（R2=0，9876），利用這種方法我們可以檢測(cè)出其方法檢出限為：36，17μg/mL，其自身的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差約為2.3%～5.7%，而回收率約為96.54%～101.28%。利用淀粉酶自身的線性回歸方程來(lái)進(jìn)行計(jì)算可以達(dá)到相同的結(jié)果，其自身的方法檢出限約為127μg/ml；其自身的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差約為2.56%～5.47%，其自身的加標(biāo)回收率約為95.76%～100.98%，由此可見(jiàn)利用分光光度法來(lái)進(jìn)行底物的監(jiān)測(cè)其這一方法的系統(tǒng)誤差相對(duì)于小，并且在進(jìn)行數(shù)據(jù)的測(cè)定中更為準(zhǔn)確。

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