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    Mg2+功能核酸生物傳感器檢測(cè)技術(shù)的研究進(jìn)展

    2018-10-26 02:12:18王聯(lián)臻張倩李凱賀萬(wàn)崇羅云波黃昆侖許文濤
    生物技術(shù)通報(bào) 2018年9期
    關(guān)鍵詞:靶標(biāo)底物核酸

    王聯(lián)臻 張倩 李凱 賀萬(wàn)崇 羅云波, 黃昆侖, 許文濤,

    (1. 中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院,北京 100083;2. 農(nóng)業(yè)部農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全評(píng)價(jià)(食用)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 100083)

    鎂元素是人體內(nèi)必不可少的礦物質(zhì)元素之一[1]。它是神經(jīng)肌肉興奮性和細(xì)胞通透性的重要激活劑。相較與其他二價(jià)金屬離子,Mg2+在細(xì)胞內(nèi)含量最高,在細(xì)胞增殖和凋亡過(guò)程中也有很重要作用,Mg2+在臨床醫(yī)學(xué),營(yíng)養(yǎng)學(xué)和生理學(xué)中的應(yīng)用已經(jīng)引起人們的廣泛關(guān)注[2-3]。目前發(fā)展成熟的儀器檢測(cè)方法用于檢測(cè)Mg2+,具有靈敏度高、快速、取樣量少等特點(diǎn)。雖然這種方法已經(jīng)形成了一系列的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn),但是仍然存在著儀器設(shè)備復(fù)雜、價(jià)格昂貴等缺點(diǎn)?;诠δ芎怂岬纳飩鞲衅鳎鳛橐环N開(kāi)發(fā)的新型檢測(cè)技術(shù),具有序列易修飾、特異性高、穩(wěn)定性高、成本較低和操作簡(jiǎn)單等優(yōu)勢(shì)。

    功能核酸是具有特異性識(shí)別靶標(biāo)物質(zhì)和催化功能的核酸序列。功能核酸按照其組成核酸可分為功能型DNA和功能型RNA,按照其功能可分成能與特定目標(biāo)相結(jié)合的核酸適體、具有催化活性的核酶(RNAzyme)和脫氧核酸(DNAzyme)。由于功能核酸的獨(dú)特功能,越來(lái)越多的研究者將這一特性運(yùn)用于檢測(cè)分析的領(lǐng)域?,F(xiàn)階段,DNAzyme是作為Mg2+最主要的功能核酸生物傳感器。RNAzyme由于在特異性方面還有待提高,目前還未篩選出適用于檢測(cè)的Mg2+依賴性RNAzyme。同時(shí)比較RNAzyme和DNAzyme,DNAzyme具有容易制備,對(duì)于化學(xué)降解和酶降解不敏感等優(yōu)點(diǎn)。DNAzyme的篩選方法是體外篩選,現(xiàn)在還沒(méi)有體內(nèi)篩選的Mg2+依賴性 DNAzyme[4]。8-17 DNAzyme 和 10-23 DNAzyme以及它們的變體是研究最多以及應(yīng)用最廣泛的兩種DNAzyme。DNAzyme有類似于酶的催化活性[5],在Mg2+的作用下可以對(duì)底物DNA鏈的rA位點(diǎn)切割,DNA鏈斷裂,通過(guò)標(biāo)記熒光基團(tuán)產(chǎn)生的熒光信號(hào)或者是電化學(xué)信號(hào)的改變對(duì)Mg2+或者靶標(biāo)物質(zhì)的量進(jìn)行檢測(cè)?;诠δ芎怂岬腗g2+生物傳感器檢測(cè)技術(shù)已經(jīng)成功運(yùn)用于食品和生物醫(yī)學(xué)方面。本文將介紹Mg2+功能核酸介導(dǎo)的生物傳感器的研究進(jìn)展。

    1 Mg2+與核酸作用規(guī)律及作用方式

    Mg2+與核酸的結(jié)合主要是通過(guò)Mg2+與磷酸根和碳基位結(jié)合形成金屬離子-核酸復(fù)合結(jié)構(gòu)[6]。Mg2+與核酸堿基作用有單配位和雙配位這兩種類型(圖1)。與尿嘧啶和胸腺嘧啶結(jié)合是單配位,二者配合方式的Mg2+-O4鍵長(zhǎng)度接近,U1-Mg2+和T1-Mg2+中Mg2+-O4-C的親和力值分別為140.9和108.9 kcal/mol。與胞嘧啶通過(guò)N4和O2的雙配位結(jié)合最為穩(wěn)定,親和力值為187.1 kcal/mol。在腺嘌呤中,Mg2+主要是與N3和N9的雙配位,親和力值為188.5 kcal/mol。而在鳥(niǎo)嘌呤中,結(jié)合方式均為雙配位[7]。鎂離子核酶切割機(jī)制主要是RNA底物鏈通過(guò)沃森-克里克(Watson-Crick)方式與酶鏈結(jié)合,并在位于不成對(duì)的嘌呤和配對(duì)的嘧啶殘基之間進(jìn)行特異性切割[4]。

    2 Mg2+的DNAzyme篩選方法

    DNAzyme性質(zhì)比較穩(wěn)定,制備方法較為簡(jiǎn)單,可以通過(guò)SELEX體外篩選方法來(lái)獲得對(duì)RNA特異性切割的DNAzyme。SELEX技術(shù)的基本原理是體外化學(xué)合成一個(gè)單鏈寡核苷酸庫(kù),用它與靶物質(zhì)混合,混合液中存在靶物質(zhì)與核酸的復(fù)合物,洗掉未與靶物質(zhì)結(jié)合的核酸,分離與靶物質(zhì)結(jié)合的核酸分子,以此核酸分子為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增,進(jìn)行下一輪的篩選過(guò)程。通過(guò)重復(fù)的篩選與擴(kuò)增,一些與靶物質(zhì)不結(jié)合或與靶物質(zhì)有低親和力、中親和力的DNA或RNA分子被洗,具有高親和力的DNA從隨機(jī)文庫(kù)中被分離出來(lái)。進(jìn)行DNA序列的廣泛搜索,在尋找最符合標(biāo)準(zhǔn)的分子需要滿足以下幾個(gè)條件:(1)在模擬生理?xiàng)l件下測(cè)試多次切割RNA的能力;(2)通過(guò)堿基配對(duì)識(shí)別RNA的能力;(3)改變底物識(shí)別區(qū)的序列對(duì)其他RNA底物泛素化;(4)催化效率達(dá)到或者超過(guò)RNAzyme不超過(guò)50個(gè)脫氧核苷酸組成為優(yōu)[4]。最早通過(guò)SELEX體外篩選法篩出的Mg2+DNAzyme是8-17 DNAzyme和10-23 DNAzyme(圖2)。兩者都是有特定堿基構(gòu)成的催化結(jié)構(gòu)域與兩側(cè)底物特異性脫氧核苷酸識(shí)別結(jié)構(gòu)域組成,由于分別是第8和第10個(gè)循環(huán)中第17與第23個(gè)克隆產(chǎn)物因此得名8-17與10-23。針對(duì)不同靶標(biāo)序列,通過(guò)設(shè)計(jì)特異性的結(jié)合區(qū)域,在Mg2+存在情況下實(shí)現(xiàn)對(duì)靶標(biāo)的定點(diǎn)切割。

    圖1 Mg2+與堿基配位[7]

    圖2 8-17 DNAzyme和 10-23 DNAzyme[4]

    再之后的研究中又篩選出7S11 DNAzyme、Mg5 DNAzyme、9DB1 DNAzyme、10DM24 DNAzyme 等Mg2+依賴性的脫氧核酶(表1)[8]。

    表1 Mg2+依賴性DNAzyme的莖環(huán)序列

    3 Mg2+核酸變溫?cái)U(kuò)增生物傳感器檢測(cè)技術(shù)

    Mg2+脫氧核酶介導(dǎo)的生物傳感器可以與傳統(tǒng)PCR擴(kuò)增技術(shù)相結(jié)合,通過(guò)擴(kuò)增技術(shù)實(shí)現(xiàn)信號(hào)的放大作用,可以有效的提高檢測(cè)限以及準(zhǔn)確度。Breaker等[9]通過(guò)PCR選擇性擴(kuò)增出DNAzyme,它具有催化切割RNA的功能。Mg2+作為輔因子,探究了不同鹽濃度、溫度以及識(shí)別域堿基種類對(duì)于Mg2+依賴性DNAzyme活性影響。Zhou等[10]從含有50個(gè)隨機(jī)核苷酸的DNA文庫(kù)中,分離并通過(guò)兩步PCR擴(kuò)增在血清中的切割序列。經(jīng)深度測(cè)序分析,文庫(kù)中80%是8-17 DNAzyme的變體17EV1,17EV1是Mg2+依賴性脫氧核酶,能在血清中發(fā)生切割反應(yīng)(圖 3)。

    圖3 Mg2+ DNAzyme介導(dǎo)的血清體外篩選的循環(huán)方案[10]

    4 Mg2+核酸恒溫?cái)U(kuò)增生物傳感器檢測(cè)技術(shù)

    等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)是一類新型的核酸分析技術(shù),與傳統(tǒng)PCR相比,等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)擺脫了對(duì)熱循環(huán)儀器的需求,并且針對(duì)靶標(biāo)序列的擴(kuò)增具有耗時(shí)短、反應(yīng)靈敏、特異性高等優(yōu)點(diǎn)[11]。Mg2+DNAzyme與恒溫?cái)U(kuò)增結(jié)合縮短了檢測(cè)時(shí)長(zhǎng),為實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場(chǎng)快檢奠定了基礎(chǔ)。

    4.1 滾環(huán)擴(kuò)增技術(shù)(Rolling circle amplification,RCA)

    滾環(huán)擴(kuò)增技術(shù)是繼變溫?cái)U(kuò)增技術(shù)后發(fā)展的一種恒溫?cái)U(kuò)增核酸的技術(shù)。以環(huán)狀DNA為模板,通過(guò)一個(gè)短的DNA引物(與部分環(huán)狀模板互補(bǔ)),在酶催化下將dNTPs轉(zhuǎn)變成單鏈DNA,此單鏈DNA包含成百上千個(gè)重復(fù)的模板互補(bǔ)片段。Kong等[12]基于RCA的原理,用Mg2+特異性DNAzyme檢測(cè)人類8-oxoguanine DNA glycosylase(hOGG1)的活性。探針P1被8-oxoG修飾并插入了Mg2+特異性DNAzyme的反義序列,和探針P2部分互補(bǔ)。加入hOGG1后,蛋白質(zhì)沿dsDNA移動(dòng)以尋找8-oxoG。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)遇到氧化損傷的鳥(niǎo)嘌呤時(shí),它與8-oxoG特異性結(jié)合,將oxoG從DNA中剪出,并將其消化。通過(guò)hOGG1的AP裂解酶將雜交的dsDNA分成兩部分,產(chǎn)生較短的互補(bǔ)dsDNA和新的5′磷酸化掛鎖探針,加入探針P3后掛鎖探針的兩個(gè)末段的位置接近。在Phi29聚合酶和dNTPs存在下,RCA反應(yīng)生成大量Mg2+特異性DNAzyme。DNAzyme循環(huán)切割底物,F(xiàn)和Q分離,熒光信號(hào)顯著增強(qiáng)(圖4),此方法檢測(cè)限為0.001 U/mL。

    圖4 基于靶誘導(dǎo)的自催化DNAzyme產(chǎn)生的滾環(huán)擴(kuò)增的hOGG1 活性測(cè)定[12]

    Song等[13]建立了基于分枝滾環(huán)擴(kuò)增(RCA)技術(shù)對(duì)DNA甲基化進(jìn)行檢測(cè)的方法。分枝滾環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)的原理涉及3個(gè)主要過(guò)程:(1)Dam MTase和DpnI酶聯(lián)合反應(yīng);(2)分枝RCA;(3)熒光檢測(cè)。在第一步中,DNA鏈1和2(S和P)的雜交引入50-GATC-30的回文序列,其作為反應(yīng)底物并被催化為甲基化的雙鏈DNA(50-G-mA-TC-30),由Dam MTase在S-adenosylmethionine的存在下進(jìn)行。甲基化的雙鏈DNA通過(guò)識(shí)別位點(diǎn)被Dpn I切割。在甲基化/裂解反應(yīng)之后,新產(chǎn)生的ssDNA作為信號(hào)引物與環(huán)狀模板結(jié)合并在DNA聚合酶Klenow片段存在下啟動(dòng)RCA反應(yīng),產(chǎn)生長(zhǎng)重復(fù)圓形探針序列。此外,引入了發(fā)夾DNA,其作為分枝RCA的關(guān)鍵元件。環(huán)狀DNA包含3個(gè)功能序列(紅色,即識(shí)別序列為ssDNA;紫色,RCA的樹(shù)枝狀分支元素的互補(bǔ)序列;和綠色,Mg2+特異性DNAzyme的識(shí)別序列)。發(fā)夾DNA由莖區(qū)組成,包括ssDNA(S’)序列(與環(huán)狀DNA互補(bǔ))和環(huán)狀區(qū)域,該環(huán)狀區(qū)域與環(huán)狀DNA的紫色相同。在這些條件下,發(fā)夾的紅色序列被阻塞在不活躍的結(jié)構(gòu)中。在ssDNA(S’)和聚合酶/ dNTP存在的情況下,RCA由環(huán)狀DNA模板觸發(fā),導(dǎo)致這個(gè)過(guò)程重復(fù)發(fā)生。重復(fù)的紫色序列與具有發(fā)夾結(jié)構(gòu)的單鏈環(huán)互補(bǔ)。這種雜交導(dǎo)致發(fā)夾的打開(kāi),釋放與環(huán)形DNA模板結(jié)合的ssDNA的游離序列,觸發(fā)分枝RCA的發(fā)生。環(huán)狀模板DNA的主要識(shí)別區(qū)是由Mg2+特異性DNAzyme序列組成的分枝RCA鏈。最終DNAzyme的大量形成觸發(fā)底物的切割,通過(guò)產(chǎn)生顯著放大的熒光信號(hào)對(duì)Dam MTase進(jìn)行分析(圖5)。其檢測(cè)限達(dá)到0.36 U/mL,反應(yīng)時(shí)間為2 h。

    圖5 分枝滾環(huán)擴(kuò)增誘導(dǎo)的熒光反應(yīng)[13]

    4.2 鏈置換擴(kuò)增反應(yīng)

    Yin等[14]運(yùn)用鏈置換擴(kuò)增反應(yīng)檢測(cè)microRNA。當(dāng)microRNA-21存在時(shí),用DNA聚合酶誘導(dǎo)的鏈置換擴(kuò)增反應(yīng)可以產(chǎn)生一定量的觸發(fā)DNA,觸發(fā)DNA可以與用生物素和AMCA染料標(biāo)記的信號(hào)DNA進(jìn)一步雜交。引入Mg2+后,觸發(fā)DNA可形成DNAzyme切割信號(hào)DNA。磁珠分離后,含有AMCA染料的DNA片段可以產(chǎn)生熒光信號(hào),其檢測(cè)限為0.27 fmol/L(圖 6)。

    4.3 環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)

    環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增(LAMP)是由Notomi等[15]發(fā)明的恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)。LAMP的原理主要分為擴(kuò)增啟動(dòng)、循環(huán)擴(kuò)增和延伸循環(huán)3個(gè)步驟。這項(xiàng)技術(shù)的優(yōu)勢(shì)是可在等溫條件下實(shí)現(xiàn)擴(kuò)增、擴(kuò)增效率高、對(duì)目的序列具有高選擇性和擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)方法多樣。Su等[16]設(shè)計(jì)了特異性引物來(lái)靶向S. scitamineum的Pep1基因,采用單因素實(shí)驗(yàn)方法和設(shè)計(jì)正交實(shí)驗(yàn),篩選了循環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(LAMP)反應(yīng)體系的3個(gè)重要組分Mg2+,引物和Bst DNA聚合酶的最適濃度。建立了適用于S. scitamineum檢測(cè)的LAMP系統(tǒng)。靈敏度高于常規(guī)PCR檢測(cè)的100倍。這種新型LAMP系統(tǒng)不僅為甘蔗黑穗病監(jiān)測(cè)提供了技術(shù)支持,也為其他植物病原體的相似檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展提供了良好的條件。

    圖6 生物傳感器制造和microRNA的電化學(xué)檢測(cè)的示意圖[14]

    5 G4介導(dǎo)的Mg2+功能核酸生物傳感器檢測(cè)技術(shù)

    DNA G-四聯(lián)體是由單個(gè)富含鳥(niǎo)嘌呤的序列或由兩個(gè)(二聚體)或四個(gè)(四聚體)分開(kāi)的鏈結(jié)合形成的四鏈DNA結(jié)構(gòu),為二級(jí)結(jié)構(gòu)DNA(圖7)。與其他DNA二級(jí)結(jié)構(gòu)相比較,G-四聯(lián)體的結(jié)構(gòu)特征是它具有更大的方形芳香表面,由4個(gè)鳥(niǎo)嘌呤通過(guò)氫鍵形成的[17]。

    圖7 G-四聯(lián)體的不同結(jié)構(gòu)

    Lin等[17]將 Mg2+DNAzyme與 G-四聯(lián)體結(jié)合形成復(fù)雜空間結(jié)構(gòu),Mg2+作用下引導(dǎo)G-四聯(lián)體形成產(chǎn)生輸出信號(hào)。G-quadruplex DNA的積累是通過(guò)G-quartet的π-π堆積形成的,Mg2+的作用是通過(guò)Mg-O配位鍵的形成結(jié)合配位化合物來(lái)中和DNA磷酸骨架的負(fù)電荷。因此,DNA可以充分接近,從而更容易發(fā)生π-π堆積(圖8)。

    圖8 G-四聯(lián)體與Mg2+模型[17]

    Elbaz等[18]通過(guò)核酸結(jié)構(gòu)的協(xié)同自組裝來(lái)活化DNAzyme級(jí)聯(lián),作為構(gòu)建自組裝核酸來(lái)分析靶標(biāo)DNA和DNA擴(kuò)增感應(yīng)的方法。構(gòu)建自組裝核酸來(lái)分析靶標(biāo)DNA。核酸2、3與靶標(biāo)物質(zhì)兩段互補(bǔ)。核酸4被序列5阻塞成一個(gè)準(zhǔn)圓形結(jié)構(gòu)。在靶標(biāo)DNA存在時(shí),它們自組裝形成超分子結(jié)構(gòu)。序列2、3與靶標(biāo)DNA雜交可以協(xié)同使序列2、3與4的雙鏈體結(jié)構(gòu)穩(wěn)定。當(dāng)Mg2+存在時(shí),發(fā)生切割反應(yīng)。序列4、5連接處遇熱不穩(wěn)定,所以產(chǎn)生兩條單鏈核酸(圖9)。加入氯化血紅素使之解離成兩個(gè)辣根過(guò)氧化物酶模擬的DNAzyme,催化H2O2氧化ABTS2-形成有色的ABTS-。

    圖9 核酸結(jié)構(gòu)自組裝,通過(guò)DNAzyme級(jí)聯(lián)分析DNA[18]

    6 納米材料介導(dǎo)的Mg2+功能核酸生物傳感器檢測(cè)技術(shù)

    近年來(lái),納米技術(shù)以及納米材料發(fā)展迅速,尤其是納米材料與其他材料的聯(lián)用。納米材料與生物傳感器聯(lián)用,可以增加生物活性的固定量、表面活性位點(diǎn),提供良好的反應(yīng)環(huán)境,加快電子傳遞過(guò)程,縮短信號(hào)的響應(yīng)時(shí)間,從而使生物傳感器的靈敏度、檢測(cè)范圍、重復(fù)性得到明顯的增強(qiáng)。同時(shí)納米技術(shù)多領(lǐng)域的交叉融合,還能拓寬生物傳感器的應(yīng)用范圍[19-20]。

    6.1 金納米粒子

    Chen等[21]構(gòu)建DNA馬達(dá)用于檢測(cè)蛋白質(zhì)(圖10)。DNA馬達(dá)由Mg2+依賴性DNAzyme,AuNP和底物3部分組成。AuNP作為支架構(gòu)成底物分子的三維軌道,底物的高密度增強(qiáng)了DNAzyme在三維軌道的移動(dòng)。當(dāng)加入靶蛋白質(zhì)并和配體結(jié)合后,激活了馬達(dá)系統(tǒng)。再加入Mg2+,發(fā)生了切割反應(yīng)。熒光基團(tuán)釋放,根據(jù)熒光的變化來(lái)檢測(cè)蛋白質(zhì)的量。同時(shí)DNAzyme分離并與另一個(gè)底物雜交。此方法實(shí)現(xiàn)了DNAzyme沿AuNP的自主移動(dòng),對(duì)凝血酶的檢測(cè)限達(dá)到5 pmol/L,檢測(cè)時(shí)間為120 min。

    6.2 碳基納米材料

    Yun等[22]設(shè)計(jì)了一個(gè)基于DNAzyme的分枝連接結(jié)構(gòu),用來(lái)同時(shí)檢測(cè)Mg2+、Cu2+和Pb2+(圖11)。所有的DNA序列都由不同DNAzyme的E-DNA鏈和S-DNA鏈組成,將3個(gè)不同的熒光基團(tuán)分別標(biāo)記在E-DNA的末段。3個(gè)DNA序列之間部分存在互補(bǔ)關(guān)系,使之相互雜交形成分枝連接結(jié)構(gòu)。沒(méi)有靶標(biāo)金屬離子時(shí),主要通過(guò)dsDNA與氧化石墨烯連接,分枝連接結(jié)構(gòu)的DNAzyme熒光信號(hào)較強(qiáng)。在靶標(biāo)金屬離子存在時(shí),S-DNA的rA位點(diǎn)被切割,被切割的S-DNA片段被釋放,與氧化石墨烯通過(guò)π-π堆積的形式結(jié)合,熒光信號(hào)顯著淬滅。這種方法能同時(shí)檢測(cè)3種金屬離子,檢測(cè)時(shí)間25 min,且Mg2+檢測(cè)限達(dá)到200 nmol/L。DNAzyme和氧化石墨烯結(jié)合具有很好的水溶性,生物相容性以及優(yōu)異的熒光淬滅能力。

    6.3 硅基納米材料

    Balogh等[23]研究了使用DNAzyme封裝的介孔二氧化硅納米粒子合成點(diǎn)擊化學(xué)產(chǎn)物。Cy3-DBCO(DBCO =二苯并環(huán)辛基)和Cy5-N3作為反應(yīng)物,分別封裝在含Mg2+依賴性DNAzyme和Zn2+依賴性DNAzyme的MP SiO2納米粒子。在Mg2+和Zn2+作為觸發(fā)劑的情況下,納米粒子被解鎖,Cy3-DBCO和Cy5-N3從容器中釋放出來(lái),形成點(diǎn)擊產(chǎn)物Cy3-Cy5。根據(jù)熒光變化進(jìn)行測(cè)定(圖12)。

    6.4 生物納米材料

    Jin等[24]提出了一種基于DNA納米花(DNFs)的新型可生物降解的癌癥治療系統(tǒng),用于靶向雙基因沉默的方法。通過(guò)復(fù)制滾環(huán)擴(kuò)增模板構(gòu)建治療系統(tǒng),以產(chǎn)生具有細(xì)胞靶向和雙重基因沉默能力的長(zhǎng)單鏈DNA。DNFs的結(jié)構(gòu)在酸性pH下崩解,由共組裝的焦磷酸鎂分解產(chǎn)生的Mg2+作為DNAzyme的輔因子,并增加其識(shí)別和切割靶mRNA的能力。體外和體內(nèi)研究表明,多功能DNFs有望用于靶向癌細(xì)胞識(shí)別,基因沉默,誘導(dǎo)凋亡和抑制腫瘤生長(zhǎng)。考慮到該治療平臺(tái)的治療效果和生物相容性的增強(qiáng),可能對(duì)癌癥的臨床治療具有重要意義。

    圖10 基于AuNP的DNAzyme馬達(dá)檢測(cè)蛋白質(zhì)[21]

    圖11 基于氧化石墨烯同時(shí)檢測(cè)Mg2+,Cu2+和Pb2+[22]

    7 Mg2+功能核酸電化學(xué)生物傳感器檢測(cè)技術(shù)

    基于電化學(xué)檢測(cè)的DNA電化學(xué)生物傳感器是從20世紀(jì)90年代發(fā)展起來(lái)的一種新的傳感器技術(shù)。它的基本結(jié)構(gòu)包括一個(gè)能固定DNA探針的電極和一個(gè)換能器。這種傳感器具有簡(jiǎn)單、快速、無(wú)毒、成本低、靈敏度高和可用于活體檢測(cè)等優(yōu)勢(shì)[25]。

    Gao等[26]已經(jīng)開(kāi)發(fā)了基于Mg2+的DNAzyme的電化學(xué)生物傳感器,可用于檢測(cè)血液中的Mg2+含量(圖13)。將5’端有硫醇的Mg2+特異性DNAzyme通過(guò)thiol-Au相互作用固定在金電極上,5’端由結(jié)合二茂鐵(Fc)的DNA底物鏈通過(guò)與DNAzyme雜交連接到金電極。在沒(méi)有Mg2+的情況下,表現(xiàn)出二茂鐵的電流;當(dāng)Mg2+存在時(shí),結(jié)合二茂鐵的DNA底物鏈被DNAzyme切割成兩段并遠(yuǎn)離電極,電流減少,電流隨Mg2+濃度增加而減少。這種傳感器有很高的特異性,能免受其他二價(jià)金屬離子的干擾,其檢測(cè)限達(dá)到0.05 mmol/L。

    8 Mg2+功能核酸在食品中三聚氰胺的應(yīng)用

    Wang等[27]基于三聚氰胺(Melamine)結(jié)合觸發(fā)的三鏈體形成和Mg2+依賴性DNAzyme,提出了一種新的DNAzyme調(diào)控機(jī)制,用于三聚氰胺的識(shí)別(圖14)。在底物鏈的兩端修飾熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán),在發(fā)夾環(huán)加入兩個(gè)poly(dT)片段,用于特異性結(jié)合Mg2+。發(fā)夾環(huán)的結(jié)構(gòu)域擴(kuò)大,但DNAzyme的活性結(jié)構(gòu)未形成。然后通過(guò)堿基配對(duì),再將有AP位點(diǎn)的poly(dA)引入。加入的poly(dA)因?yàn)橛H和力不足,所以不能形成穩(wěn)定的三鏈體。當(dāng)Melamine加入位于poly(dA)的AP位點(diǎn),通過(guò)T-melamine-T連接到核堿基上。DNAzyme的活性結(jié)構(gòu)恢復(fù),在Mg2+的催化作用下發(fā)生切割反應(yīng),產(chǎn)生熒光信號(hào)。

    圖12 載有不同分子的DNAzyme封裝的MP SiO2納米粒子[23]

    圖13 檢測(cè)Mg2+的生物傳感器[26]

    除此之外,Liu等[28]也開(kāi)發(fā)了一種新型熒光生物傳感檢測(cè)方法(圖15)。TAP由4個(gè)結(jié)構(gòu)域組成,其中結(jié)構(gòu)域I的堿基序列與DNAzyme互補(bǔ)。TAP與DNAzyme雜交抑制以抑制催化活性,在三聚氰胺存在下,3個(gè)結(jié)構(gòu)域可通過(guò)胸腺嘧啶和三聚氰胺之間的氫鍵作用將三聚氰胺結(jié)合到AP位點(diǎn)形成三鏈DNA結(jié)構(gòu)。同時(shí),三鏈結(jié)構(gòu)的形成使得Fuel鏈接近TAP-DNAzyme復(fù)合物,啟動(dòng)鏈置換反應(yīng)輸出復(fù)合物和游離DNAzyme。游離的DNAzyme與Mg2+特異性結(jié)合催化切割反應(yīng),熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)分離,產(chǎn)生顯著的熒光信號(hào)。在最佳條件下,三聚氰胺的檢測(cè)限在0.9 nmol/L。

    圖14 由Melamine形成的三聚體激活Mg2+特異性的DNAzyme[27]

    圖15 熒光測(cè)定敏感三聚氰胺的原理[28]

    9 Mg2+功能核酸在生物醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用

    9.1 檢測(cè)血清中的Mg2+

    血清中的Mg2+濃度為1.1 mmol/L,在細(xì)胞中是1.6 mmol/L。Zhou等[10]對(duì)8-17E進(jìn)行體外篩選,分離并擴(kuò)增可以在血清中發(fā)生切割反應(yīng)的DNA序列,篩選出8-17EV1和8-17EV2。它在未稀釋的人體血清中的檢測(cè)限為1.1 mmol/L,檢測(cè)時(shí)間為20 min。

    9.2 生物成像

    Yang等[29]開(kāi)發(fā)了基于AuNP的發(fā)夾鎖定的DNA探針,來(lái)感知活細(xì)胞的miRNA的技術(shù)。它是由AuNP和發(fā)夾鎖定的DNAzyme組成。在靶標(biāo)miRNA不存在時(shí),發(fā)夾鎖定的DNAzyme鏈通過(guò)分子內(nèi)雜交形成發(fā)夾結(jié)構(gòu),限制DNAzyme的催化活性,熒光被AuNP淬滅。當(dāng)靶標(biāo)miRNA存在時(shí),靶標(biāo)和探針雜交能打開(kāi)發(fā)夾,形成活性二級(jí)結(jié)構(gòu),在Mg2+的輔助下進(jìn)行切割反應(yīng)。切割的片段分離,熒光基團(tuán)被釋放熒光顯著增強(qiáng)。同時(shí),靶標(biāo)也會(huì)被釋放連接到下一個(gè)DNAzyme開(kāi)始另一個(gè)循環(huán)。這種方法的檢測(cè)限達(dá)到25 pmol/L。

    9.3 生物醫(yī)學(xué)中的其他研究

    Romanova等[30]分析Mg2+在粘質(zhì)沙雷氏菌核酸酶對(duì)RNA的消化活性的作用機(jī)制,發(fā)現(xiàn)這種機(jī)制與DNA酶上的金屬作用機(jī)制相似,并且Mg2+的加入既影響酶與底物復(fù)合物的產(chǎn)物解離速率,也影響酶與底物的結(jié)合。Binase具有選擇性的抗腫瘤作用,可誘導(dǎo)肺癌A549細(xì)胞凋亡。它是一種核酸內(nèi)切酶,可以裂解相鄰核苷酸的苷酸的3′-脒基殘基和5′-OH殘基之間的磷酸二酯鍵,在催化反應(yīng)的第一階段形成相應(yīng)的中間體2′,3′-cGMP。加入Mg2+可以提高形成2′,3′-cGMP的水平。在細(xì)胞內(nèi),有助于肺癌A549細(xì)胞的凋亡[32]。

    Wei等[32]通過(guò)充分利用PLA,MNAzyme和基于GNPs的比色法,成功設(shè)計(jì)了蛋白質(zhì)測(cè)定方法(圖16)。該方法由PDGF-BB,聚T間隔物,短莖序列和部分MNAzyme的適體組成。同時(shí)linker序列被設(shè)計(jì)為包含MNAzyme的底物序列,可以被切割成兩個(gè)片段然后釋放。在靶標(biāo)缺失的情況下,由于熔解溫度低(Tm <25℃),兩個(gè)短莖序列在室溫下不能雜交。在靶蛋白存在的情況下,通過(guò)兩種探針同步識(shí)別一種PDGF-BB然后依次催化切割,生成的碎片不能將GNP-1與GNP-2交聯(lián)。因此仍為紅色,檢測(cè)限為1 pg/mL。該方法具有更高的成本效益和熱穩(wěn)定性,且可以擴(kuò)展用于檢測(cè)具有兩個(gè)或更多配體的其他分析物的通用方法。

    Zhang等[33]將熒光染料亞甲基藍(lán)(MB)通過(guò)Mg2+依賴性DNAzyme封裝在介孔二氧化硅(MSN)的孔中。在Mg2+存在下,發(fā)生特異性切割,MB從孔內(nèi)釋放出來(lái)。這種方法對(duì)于未來(lái)納米材料釋放藥物具有重要的借鑒意義。

    圖16 PDGF-BB的檢測(cè)原理圖[33]

    10 結(jié)語(yǔ)

    綜上所述,Mg2+功能核酸的生物傳感檢測(cè)技術(shù)具有高效、穩(wěn)定等特點(diǎn),可以把金屬檢測(cè)的問(wèn)題轉(zhuǎn)化為核酸的問(wèn)題,利用核酸來(lái)解決問(wèn)題。同時(shí)功能核酸的生物傳感技術(shù)為檢測(cè)Mg2+提供了新的思路。Mg2+依賴性DNAzyme涉及到多個(gè)方面,還需要開(kāi)展更多的研究。目前主要存在的問(wèn)題在于3個(gè)方面,首先Mg2+相比于其他二價(jià)金屬離子,DNAzyme不具有突出的特異性;其次是這項(xiàng)技術(shù)的檢測(cè)限低于傳統(tǒng)方法的檢測(cè)限;最后是成功的實(shí)際應(yīng)用較少。所以在未來(lái)的研究中,需要對(duì)已知的DNAzyme序列近一步優(yōu)化或者是另外篩選出特異性更好的DNAzyme,有望在食品方面對(duì)更多的物質(zhì)進(jìn)行檢測(cè),在生物醫(yī)學(xué)方面發(fā)現(xiàn)更多的作用來(lái)促進(jìn)疾病的治療?,F(xiàn)階段,納米材料因?yàn)槲宕笮?yīng)受到越來(lái)越廣泛的關(guān)注。在未來(lái),將納米材料和Mg2+功能核酸的生物傳感檢測(cè)技術(shù)相結(jié)合,可以使其靈敏度、檢測(cè)限和響應(yīng)范圍等性能指標(biāo)得到更大的提升。

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