• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    基于適體的石英晶體微天平傳感器的研究進(jìn)展

    2018-10-26 02:12:18吳莉婷蘇雪林俊生
    生物技術(shù)通報(bào) 2018年9期
    關(guān)鍵詞:凝血酶天平靶標(biāo)

    吳莉婷 蘇雪 林俊生

    (華僑大學(xué)醫(yī)學(xué)院,泉州362021)

    核酸適配體,又稱適體(Aptamer),是一類短鏈的功能性寡核苷酸片段,可以是RNA、單鏈DNA,偶見報(bào)道為雙鏈DNA。適體在鹽溶液中形成凸環(huán)、發(fā)卡、假結(jié)、G-四堿基體等特殊的三維空間結(jié)構(gòu),在氫鍵、疏水作用力、范德華力等作用力下與靶標(biāo)分子特異性結(jié)合[1]。適體與靶標(biāo)分子結(jié)合特異性高且親和力強(qiáng),解離常數(shù)范圍在10-12-10-9mol/L之間[2],已被廣泛地應(yīng)用于分析、檢測(cè)、治療、傳感器等多個(gè)領(lǐng)域[3]。作為功能性分子,適體在經(jīng)過體外篩選后,需要對(duì)其特異性、穩(wěn)定性、親和力及與靶標(biāo)間的相互作用等功能進(jìn)行表征。現(xiàn)階段常用的表征方法有點(diǎn)雜交、熒光免疫、流式細(xì)胞術(shù)和高效液相等。近年來,將適體作為識(shí)別分子應(yīng)用于生物傳感器也顯示出了良好的應(yīng)用前景[4]。石英晶體微天平(Quartz crystal microbalance,QCM)是利用石英晶體的壓電效應(yīng),將電極表面的質(zhì)量變化轉(zhuǎn)化為振蕩電路輸出的電信號(hào)頻率變化的一種生物傳感器,由于具有靈敏度高,檢測(cè)方便、迅速,裝置簡(jiǎn)單,且在檢測(cè)過程中無需標(biāo)記等優(yōu)點(diǎn)而得到重視[5]?,F(xiàn)今基于適體的QCM傳感器已經(jīng)被用于小分子[6]、蛋白質(zhì)[7]、細(xì)胞[8]、細(xì)菌[9]和病毒[10]等多種靶標(biāo)的檢測(cè),并表現(xiàn)出一定的普適性。此外,QCM還具有實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè),精確度高,穩(wěn)定性強(qiáng)及可再生等優(yōu)點(diǎn)[11]。因此,該技術(shù)被廣泛地應(yīng)用于高靈敏度生物傳感器領(lǐng)域?;诖?,本文將對(duì)基于適體的石英晶體傳感器的相關(guān)研究及應(yīng)用進(jìn)行綜述,旨在為適體的篩選以及適體在基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)、臨床診斷和疾病治療中的進(jìn)一步應(yīng)用提供參考。

    1 基于適體傳感器的分類

    從結(jié)構(gòu)上來看,基于適體的生物傳感器主要由兩個(gè)部分組成:一是利用適體分子作為感受器,具有識(shí)別能力;二是信號(hào)轉(zhuǎn)換器,主要包括電化學(xué)信號(hào)轉(zhuǎn)換器、光學(xué)信號(hào)轉(zhuǎn)換器、壓電石英晶體轉(zhuǎn)換器等。當(dāng)待測(cè)靶標(biāo)分子與適體分子特異性結(jié)合后產(chǎn)生一個(gè)生物信號(hào),適體傳感器通過信號(hào)轉(zhuǎn)換器將此信號(hào)轉(zhuǎn)變并放大為可以輸出的信號(hào)。

    以電極作為換能器的電化學(xué)傳感器起步較早,是將檢測(cè)到的生物信號(hào)轉(zhuǎn)換為電信號(hào)的一種傳感系統(tǒng),依據(jù)待測(cè)靶標(biāo)與適體結(jié)合前后構(gòu)象的變化,可以設(shè)計(jì) Signal-off[12-13]和 Signal-on[14]兩種模式的適體電化學(xué)傳感器,前者出現(xiàn)結(jié)合后信號(hào)降低,而后者結(jié)合后信號(hào)增強(qiáng),前者的靈敏度一般低于后者。目前來說,電化學(xué)生物傳感器技術(shù)相對(duì)成熟,應(yīng)用廣泛。后期研究將其結(jié)合適體的特異性和親和力研制出一種新型的電流型電化學(xué)傳感器,用于針對(duì)凝血酶不同表位的兩種適體的檢測(cè),最低可檢測(cè)出10 nmol/L的凝血酶[15-17]。另外,我國(guó)西南大學(xué)實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的基于殼聚糖/碳納米管/石墨烯/鐵氰化鎳(CS-CNTs-Gra-FP)納米復(fù)合材料的電化學(xué)適體傳感器用于檢測(cè)凝血酶適體也取得良好的結(jié)果。他們利用(CS-CNTs-Gra-FP)作為FP的固相載體,并結(jié)合金納米技術(shù),此方法不僅增大了電極的比表面積、電子的傳輸速率,同時(shí)也增加了FP的固載量,從而極大的提高了該類適體傳感器的靈敏度,用來檢測(cè)凝血酶適體檢測(cè)限能達(dá)到3 pmol/L[18]。

    光學(xué)生物傳感器是利用待測(cè)靶標(biāo)與光發(fā)生相互作用時(shí),光的一些參數(shù)會(huì)發(fā)生變化,通過檢測(cè)這些參數(shù)的變化,分析待測(cè)靶標(biāo)的濃度和結(jié)構(gòu)等特征來實(shí)現(xiàn)檢測(cè)的。光學(xué)適體傳感器可將適體識(shí)別得到的生物信號(hào)轉(zhuǎn)化為光學(xué)信號(hào)輸出,該技術(shù)可利用熒光、干涉、折射、表面等離子共振技術(shù)(Surface plasmon resonance technology,SPR)、橢偏、化學(xué)發(fā)光等多種方式進(jìn)行檢測(cè),同時(shí)根據(jù)所選的檢測(cè)材料的不同主要可分為光纖維適體傳感器、表面等離子共振適體傳感器、化學(xué)發(fā)光適體傳感器和熒光適體傳感器等。化學(xué)發(fā)光傳感器作為學(xué)科交叉與滲透的產(chǎn)物,成為近年來非?;钴S的研究領(lǐng)域,如酶基化學(xué)發(fā)光傳感器[19]、免疫化學(xué)發(fā)光傳感器[20]、化學(xué)發(fā)光反應(yīng)同時(shí)作為分子識(shí)別反應(yīng)的傳感器[21]等。嚴(yán)喜鸞等[22]利用基于適體生物傳感器的堿性磷酸酯酶化學(xué)發(fā)光檢測(cè)腺苷,該方法以羧基磁珠為固相載體,將腺苷適體與地高辛修飾過的腺苷適體互補(bǔ)序列固定到羧基磁珠的表面,檢測(cè)時(shí)先加入一定的待測(cè)靶標(biāo)腺苷,再加入抗地高辛的堿性磷酸酯酶,用化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)發(fā)光值,根據(jù)靶標(biāo)加入前后化學(xué)發(fā)光的變化強(qiáng)度來定量腺苷濃度,結(jié)果顯示,在1.0×10-7-1.0×10-3mol/L范圍內(nèi),腺苷濃度的對(duì)數(shù)與發(fā)光強(qiáng)度呈線性關(guān)系(R2=0.976 9),檢測(cè)限能達(dá)到1.0×10-7mol/L。而Lee等[23]利用適體光纖生物傳感器定量檢測(cè)凝血酶與凝血酶適體的結(jié)合能力,檢測(cè)限低至10 nmol/L。

    壓電晶體生物傳感器是利用晶體的壓電效應(yīng)發(fā)展起來的,相對(duì)于之前的各種基于適體的生物傳感器具有實(shí)時(shí)在線監(jiān)測(cè),靈敏度高,且不需要任何的標(biāo)記,方便快捷的優(yōu)勢(shì)。此類傳感器的研究相對(duì)更多,如壓電免疫傳感器[24]、氰根離子壓電傳感器[25]、石英晶體微天平[26]等。其中壓電免疫傳感器是在壓電晶體的表面固定一層能與待測(cè)靶標(biāo)特異性結(jié)合的適體,引起壓電晶體的頻率變化,根據(jù)頻率的變化數(shù)值來定量測(cè)定待測(cè)靶標(biāo)的含量。氰根離子壓電傳感器是在鍍銀的石英晶體表面修飾一層硫化銀膜,該膜可選擇性的與氰根小分子適體結(jié)合,引起壓電晶體振蕩頻率的改變,此傳感器用以檢測(cè)水中的游離氰離子的線性范圍可達(dá)到2×10-5-0.02 μmol/L。石英晶體微天平則是利用石英晶體芯片一面的電極進(jìn)行化學(xué)反應(yīng),此芯片表面同時(shí)為質(zhì)量傳感器的傳感面,可用來在線跟蹤電極表面的質(zhì)量變化。Abadian等[27]在芯片表面修飾了一層有代表性輸尿管支架表面的聚合物,隨后用尿素酶涂覆,以促進(jìn)磷酸鈣和磷酸鎂的結(jié)晶,使用QCM定量檢測(cè)聚合物表面上晶體沉積的變化。

    2 基于適體的石英晶體微天平傳感器基本原理

    該技術(shù)以適體為感應(yīng)元件,石英晶體芯片作為換能器,將芯片表面吸附物質(zhì)的質(zhì)量信號(hào)轉(zhuǎn)換為頻率信號(hào),用于檢測(cè)適體與靶標(biāo)間相互作用的一種質(zhì)量敏感型壓電傳感器[28]。信號(hào)采集是在檢測(cè)過程中石英晶體受到交變電壓的影響產(chǎn)生振蕩電路,當(dāng)振蕩頻率與石英晶體的固有頻率不一致時(shí)無法被記錄,只有當(dāng)兩者的共振頻率一致時(shí),晶體芯片的振動(dòng)信號(hào)最大,從而被記錄。在一定條件下,當(dāng)石英晶體表面吸附物質(zhì)質(zhì)量改變時(shí),晶體固有頻率隨吸附質(zhì)量的大小而改變,從而使得到的信號(hào)發(fā)生改變。1959年,Sauerbrey[29]研究表明,石英晶體表面質(zhì)量負(fù)載與石英晶體頻率變化之間存在以下關(guān)系:

    式中f0為石英晶體的基頻,A為石英晶體電極的有效面積,ρq為石英晶體密度,μq為石英晶體剪切模量,Δm為石英晶體表面的質(zhì)量變化,負(fù)號(hào)表明表面質(zhì)量增加引起石英諧振器頻率降低。由Sauerbrey方程可知,晶體表面質(zhì)量變化與頻率變化存在線性關(guān)系?;谶m體的石英晶體微天平傳感器在晶體芯片表面固定適體作為特異性的感應(yīng)元件,與靶標(biāo)結(jié)合過程中引起芯片表面吸附質(zhì)量增大,從而引起頻率下降,用于定性或者定量分析適體與靶標(biāo)間的相互作用。

    3 石英晶體微天平傳感器在適體功能性表征方面的應(yīng)用

    自1990年至今,已有大量適體被篩選出來,其靶標(biāo)可分為小分子化合物、蛋白質(zhì)、細(xì)胞、細(xì)菌、病毒及寄生蟲,甚至是特異性的組織[30]等,石英晶體微天平所具有的特性,使其逐步成為近年來適體與靶標(biāo)相互作用的表征和用于構(gòu)建高靈敏的適體石英晶體傳感器的方法之一。根據(jù)靶標(biāo)的不同,現(xiàn)已應(yīng)用于功能性表征的靶標(biāo)主要為小分子或離子、蛋白質(zhì)(圖1)、細(xì)胞或者細(xì)菌和病毒等,如表1所示。

    4 石英晶體微天平傳感器在適體性能表征方面的優(yōu)缺點(diǎn)

    石英晶體微天平技術(shù)作為微質(zhì)量傳感器,它獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)使得其被廣泛應(yīng)用于化學(xué)、物理、生物、醫(yī)學(xué)和表面科學(xué)等領(lǐng)域中,用于進(jìn)行待測(cè)物質(zhì)的成分分析或者質(zhì)量測(cè)定和黏彈性結(jié)構(gòu)檢測(cè)等,它表現(xiàn)出來的在線跟蹤檢測(cè)過程的變化是其他方法無法比擬的,將其應(yīng)用于適體與靶標(biāo)的親和力表征中也同樣不可替代。

    圖1 QCM用來表征蛋白質(zhì)類靶標(biāo)適體的示意圖

    表1 基于適體的石英晶體微天平傳感器的部分應(yīng)用

    4.1 表征小分子靶標(biāo)的優(yōu)勢(shì)

    石英晶體微天平為質(zhì)量依賴型傳感器,相對(duì)分子質(zhì)量較小,需要構(gòu)建高靈敏度的生物傳感器信號(hào)放大的過程必不可少。由于金納米顆粒的密度大,適體修飾的金納米顆粒易于修飾合成,故而金納米顆粒的放大作用在檢測(cè)中的使用最為廣泛[43]。Dong等[44]根據(jù) Hg2+與短鏈 HS-5′-(CH2)6-TTTT-3′能夠形成T-Hg(II)-T“三明治”結(jié)構(gòu)的原理,并結(jié)合納米金顆粒等材料,構(gòu)建了基于適體的QCM傳感器用于高敏檢測(cè)Hg2+。該技術(shù)檢測(cè)限可低至0.24 nmol/L,在特異性、可重復(fù)利用性不變的情況下,比Chen和Sheng等[45-46]構(gòu)建的同類型的傳感器檢測(cè)限低一個(gè)數(shù)量級(jí),比常規(guī)使用的比色法和熒光測(cè)定法高10-100倍。此外,Zheng等[47]結(jié)合金納米顆粒的放大作用,利用特異性核酸適體不僅與靶標(biāo)分子可進(jìn)行特異性結(jié)合,同時(shí)可與互補(bǔ)鏈形成雙鏈的特點(diǎn),設(shè)計(jì)了末端帶有-SH修飾的核酸適體互補(bǔ)序列,構(gòu)建了基于適體與腺苷和互補(bǔ)序列間競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合腺苷特異性檢測(cè)QCM傳感器,在腺苷濃度為0-2 μmol/L時(shí),存在較好的線性關(guān)系(R2=0.991 48)。與之相似,Dong等[33]利用了兩種兩端可形成雙鏈,中間部分均含茶堿特異性結(jié)合單元的RNA適體,利用QCM通過金納米顆粒的放大作用,構(gòu)建了高靈敏度的茶堿的檢測(cè)方法,檢測(cè)限可降低至8.2 nmol/L。Song等[48]構(gòu)建了一種酶循環(huán)放大信號(hào)的ATP基于適體的QCM傳感器,該方法延續(xù)了?zalp[32]基于適體QCM傳感器進(jìn)行ATP定量檢測(cè)的高特異性,同時(shí)通過金納米顆粒和酶循環(huán)方法雙重方式進(jìn)行信號(hào)放大,將檢測(cè)限由10 μmol/L降低至1.3 nmol/L,是原方法的近10 000倍。

    4.2 表征蛋白質(zhì)靶標(biāo)的優(yōu)勢(shì)

    以蛋白質(zhì)為靶標(biāo)的適體QCM傳感器應(yīng)用較廣泛。首先,可用于適體使用條件的優(yōu)化,Hianik等[49]利用QCM 檢測(cè)適體濃度、鹽離子濃度、pH等因素對(duì)適體與凝血酶在芯片表面結(jié)合的影響,動(dòng)態(tài)檢測(cè)了適體與凝血酶結(jié)合過程中各影響因素造成的結(jié)合行為變化。Nübel等[50]通過適體QCM檢測(cè)發(fā)現(xiàn),特異性的腫瘤壞死因子α(Tumor necrosis factor α,TNFα)適體趨向于與多聚體形式的TNFα進(jìn)行特異性結(jié)合,破解了該適體與靶細(xì)胞親和力高但與靶蛋白的親和力較弱的謎題,為該適體后期的使用提供了較有力的理論依據(jù)。其次,可用于蛋白質(zhì)高靈敏度的檢驗(yàn),Chen等[35]利用金納米粒的放大作用,運(yùn)用適體QCM傳感器將凝血酶的檢測(cè)限由12.5 nmol/L降低至0.1 nmol/L,并在實(shí)際血清樣品中取得較好的檢測(cè)效果。另外,He等[51]通過金納米粒檢測(cè)技術(shù)和滾環(huán)擴(kuò)增技術(shù)聯(lián)合使用,將凝血酶的檢測(cè)限降低至0.78 aM,可用于超高靈敏度的凝血酶檢測(cè)。

    4.3 表征病毒靶標(biāo)的優(yōu)勢(shì)

    在病毒檢測(cè)方面,Brockman等[42]構(gòu)建了基于適體的QCM傳感器用于檢測(cè)禽流感病毒H5N1,結(jié)合磁性納米微粒的信號(hào)放大作用,該傳感器的檢測(cè)限可達(dá)到1 HAU,并具有較高的特異性,同類型病毒H7N2、H9N2和H5N9等引起的信號(hào)響應(yīng)均較小。此外,Wang等[52]結(jié)合高分子水凝膠技術(shù),合成特異性的適體-高分子水凝膠復(fù)合物,固定在QCM表面后用于病毒的檢測(cè),檢測(cè)限為0.0128 HAU,比Brockman的方法靈敏度高100倍,檢測(cè)時(shí)間也由1 h縮短為0.5 h。隨后,該團(tuán)隊(duì)結(jié)合碳量子點(diǎn)技術(shù),將檢測(cè)范圍由原來的0.0128-0.64 HAU提升至0.4-32 HAU,檢測(cè)時(shí)間有所縮短,并且該傳感器有非常好的穩(wěn)定性,存放96 d后其檢測(cè)性能依然較好[53]。

    對(duì)于石英晶體微天平傳感器在適體性能表征方面的研究重點(diǎn)主要在于信號(hào)放大作用,但信號(hào)放大的過程中易造成非特異性偏差。本課題組正在利用QCM-D技術(shù)開展靶標(biāo)為蛋白質(zhì)的適體相關(guān)的實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目[54],從目前的研究中推測(cè):在使用QCM-D技術(shù)時(shí)需要特別關(guān)注的是蛋白質(zhì)在芯片表面的非特異性吸附,所以不同的適體固定方法需要考慮添加不同的封閉劑進(jìn)行封閉?,F(xiàn)階段對(duì)于細(xì)胞、細(xì)菌和病毒相關(guān)基于適體的石英晶體微天平傳感器的報(bào)道較少,主要原因是這幾類靶標(biāo)在石英晶體微天平檢測(cè)過程中易出現(xiàn)沉降現(xiàn)象及由于細(xì)胞等在溶液中可處于浮動(dòng)狀態(tài),與芯片上固定的適體直接結(jié)合時(shí)會(huì)出現(xiàn)信號(hào)響應(yīng)過小的現(xiàn)象,本課題組也相應(yīng)的進(jìn)行了精子細(xì)胞與對(duì)應(yīng)適體的結(jié)合力表征,并聯(lián)合顯微鏡等常規(guī)技術(shù)用以監(jiān)測(cè)精子細(xì)胞在石英晶體芯片上的動(dòng)態(tài)過程,目前精子細(xì)胞作為靶標(biāo)相關(guān)的數(shù)據(jù)處理模型仍處于研發(fā)狀態(tài)。因此,基于適體的石英晶體微天平傳感器的應(yīng)用中需要對(duì)信號(hào)響應(yīng)放大及減少非特異性吸附等方面進(jìn)行改進(jìn)。同時(shí),QCM-D技術(shù)的使用價(jià)格稍貴,儀器設(shè)備需要小心維護(hù)。

    5 展望

    隨著該類傳感器越來越被學(xué)者關(guān)注,傳感器存在的以上問題正在被逐步解決,應(yīng)用范圍也在逐漸擴(kuò)大。適體化學(xué)成分可為DNA、RNA等,不僅可以用于適體與靶標(biāo)結(jié)合行為的表征和高靈敏高特異性傳感器的構(gòu)建,還可作為其他基于適體傳感器構(gòu)建過程中輔助技術(shù),常用于適體在傳感器表面固定量的實(shí)時(shí)檢測(cè),并可與其他表征技術(shù)聯(lián)用,多方面進(jìn)行分子間相互作用的表征。除此之外,QCM在檢測(cè)適體與靶標(biāo)分子相互作用時(shí)越來越受到認(rèn)可,可作為其他技術(shù)的驗(yàn)證性方法。

    猜你喜歡
    凝血酶天平靶標(biāo)
    說說天平的使用
    超聲引導(dǎo)下壓迫聯(lián)合瘤腔注射凝血酶治療醫(yī)源性假性動(dòng)脈瘤的臨床觀察
    “百靈”一號(hào)超音速大機(jī)動(dòng)靶標(biāo)
    天平使用前后的兩次平衡
    納米除草劑和靶標(biāo)生物的相互作用
    磁珠固定化凝血酶的制備及其在槐米中活性化合物篩選中的應(yīng)用
    天平的平衡
    復(fù)雜場(chǎng)景中航天器靶標(biāo)的快速識(shí)別
    前列腺特異性膜抗原為靶標(biāo)的放射免疫治療進(jìn)展
    凝血酶在預(yù)防乳腺微創(chuàng)旋切術(shù)后出血中的應(yīng)用價(jià)值
    日日啪夜夜撸| 一级毛片黄色毛片免费观看视频| 亚洲国产日韩欧美精品在线观看| 精品久久久噜噜| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 亚洲av电影在线观看一区二区三区 | av在线天堂中文字幕| 国产亚洲91精品色在线| 777米奇影视久久| 最新中文字幕久久久久| 搡女人真爽免费视频火全软件| 久久久成人免费电影| 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看 | 亚洲精品国产av成人精品| 精品久久久久久久末码| 久久精品综合一区二区三区| 精品久久久久久久久av| 偷拍熟女少妇极品色| 美女xxoo啪啪120秒动态图| 91久久精品国产一区二区成人| 日韩成人av中文字幕在线观看| 97在线视频观看| 亚洲熟妇中文字幕五十中出| 久久久精品欧美日韩精品| 国国产精品蜜臀av免费| 男女边吃奶边做爰视频| 黄片无遮挡物在线观看| 亚洲综合色惰| 99久久中文字幕三级久久日本| 一边亲一边摸免费视频| 舔av片在线| 成人特级av手机在线观看| 超碰av人人做人人爽久久| 午夜亚洲福利在线播放| 久久韩国三级中文字幕| 最近手机中文字幕大全| 在线免费观看不下载黄p国产| 欧美丝袜亚洲另类| 三级毛片av免费| 亚洲一区高清亚洲精品| 国产在视频线在精品| 亚洲图色成人| 可以在线观看毛片的网站| 小蜜桃在线观看免费完整版高清| 十八禁国产超污无遮挡网站| 一级爰片在线观看| 在线播放无遮挡| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 人妻一区二区av| 亚洲色图av天堂| 精品一区二区三区人妻视频| 国产精品综合久久久久久久免费| 特级一级黄色大片| 天堂网av新在线| 亚洲图色成人| 亚洲天堂国产精品一区在线| 国产黄片美女视频| 特级一级黄色大片| 精品国产一区二区三区久久久樱花 | 国产精品一区二区三区四区免费观看| 国产精品99久久久久久久久| 国产精品一区二区在线观看99 | 日日撸夜夜添| 久久精品国产自在天天线| 一级片'在线观看视频| 国产黄片视频在线免费观看| 禁无遮挡网站| 亚洲精品第二区| 麻豆乱淫一区二区| 中文字幕亚洲精品专区| 国产一区有黄有色的免费视频 | 91av网一区二区| 亚洲精品成人久久久久久| av又黄又爽大尺度在线免费看| 有码 亚洲区| 91在线精品国自产拍蜜月| 亚洲国产最新在线播放| 日韩一区二区三区影片| 免费观看精品视频网站| 欧美人与善性xxx| 免费观看av网站的网址| 亚洲真实伦在线观看| 久久久午夜欧美精品| 久久热精品热| 精品国产三级普通话版| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 日本免费a在线| 免费观看的影片在线观看| 免费看av在线观看网站| 可以在线观看毛片的网站| 亚洲欧美成人精品一区二区| 夫妻性生交免费视频一级片| 亚洲电影在线观看av| 国产伦精品一区二区三区视频9| 草草在线视频免费看| 国产精品爽爽va在线观看网站| 深爱激情五月婷婷| 婷婷色综合www| 亚洲精品国产av蜜桃| 天堂av国产一区二区熟女人妻| 国产伦一二天堂av在线观看| 免费av不卡在线播放| 国产永久视频网站| eeuss影院久久| av又黄又爽大尺度在线免费看| 中国国产av一级| 97热精品久久久久久| 久久久色成人| 国产一级毛片在线| 老女人水多毛片| 亚洲精华国产精华液的使用体验| 亚洲第一区二区三区不卡| 久久久午夜欧美精品| 亚洲国产精品sss在线观看| 99久久精品热视频| 2018国产大陆天天弄谢| 亚洲av电影在线观看一区二区三区 | 汤姆久久久久久久影院中文字幕 | 天天躁日日操中文字幕| 国产精品嫩草影院av在线观看| 免费黄色在线免费观看| 99热这里只有精品一区| 久久久久久久亚洲中文字幕| 久久久久免费精品人妻一区二区| 国产精品人妻久久久久久| 国产在线男女| 午夜福利高清视频| 亚洲精品日韩av片在线观看| 亚洲自偷自拍三级| 国产av国产精品国产| 日韩欧美精品免费久久| 亚洲人与动物交配视频| 国产在线一区二区三区精| 尾随美女入室| 色综合色国产| 1000部很黄的大片| 草草在线视频免费看| 女人十人毛片免费观看3o分钟| 性插视频无遮挡在线免费观看| 禁无遮挡网站| 国产伦理片在线播放av一区| 国产成人免费观看mmmm| 麻豆乱淫一区二区| 夫妻性生交免费视频一级片| 亚洲内射少妇av| 日韩一区二区三区影片| 国产av码专区亚洲av| 国产成人福利小说| 别揉我奶头 嗯啊视频| 国产精品一区二区性色av| 最近视频中文字幕2019在线8| 蜜桃亚洲精品一区二区三区| 日本黄大片高清| 听说在线观看完整版免费高清| 久久久久久久国产电影| 男女啪啪激烈高潮av片| 亚洲精品久久午夜乱码| 国产在线一区二区三区精| 我的老师免费观看完整版| 舔av片在线| 成年av动漫网址| 身体一侧抽搐| 久久6这里有精品| 亚洲人成网站高清观看| 日本色播在线视频| 亚洲国产色片| av福利片在线观看| 听说在线观看完整版免费高清| 欧美成人午夜免费资源| 日韩一本色道免费dvd| 久久午夜福利片| 啦啦啦啦在线视频资源| 联通29元200g的流量卡| 国产精品一区二区在线观看99 | 成人亚洲精品av一区二区| 亚洲最大成人中文| 亚洲国产欧美人成| 99久国产av精品| 九九在线视频观看精品| 最近中文字幕高清免费大全6| 精品人妻一区二区三区麻豆| 欧美三级亚洲精品| 免费高清在线观看视频在线观看| 亚洲国产av新网站| 一二三四中文在线观看免费高清| 最近2019中文字幕mv第一页| 亚洲经典国产精华液单| av一本久久久久| 中文字幕亚洲精品专区| 日日啪夜夜撸| 在线 av 中文字幕| 国产白丝娇喘喷水9色精品| 五月玫瑰六月丁香| 成人亚洲精品av一区二区| 国产一级毛片七仙女欲春2| 亚洲av一区综合| videos熟女内射| 日韩av在线免费看完整版不卡| 国产av国产精品国产| 精品一区二区三卡| 国产成人91sexporn| 亚洲人与动物交配视频| 肉色欧美久久久久久久蜜桃 | 国产乱来视频区| 亚洲成人av在线免费| 国产一区二区亚洲精品在线观看| 亚洲国产精品国产精品| 亚洲国产精品sss在线观看| 毛片女人毛片| 精品酒店卫生间| 2018国产大陆天天弄谢| 国产乱人偷精品视频| 精品人妻偷拍中文字幕| 97热精品久久久久久| 国产亚洲精品av在线| 七月丁香在线播放| 嘟嘟电影网在线观看| 欧美三级亚洲精品| 午夜亚洲福利在线播放| 亚洲人成网站在线观看播放| 精品午夜福利在线看| 国产乱来视频区| 色综合色国产| 免费大片18禁| 亚洲丝袜综合中文字幕| 日日撸夜夜添| 熟妇人妻不卡中文字幕| 只有这里有精品99| 国产片特级美女逼逼视频| 不卡视频在线观看欧美| 久久精品综合一区二区三区| 又黄又爽又刺激的免费视频.| 少妇人妻一区二区三区视频| 国产精品久久久久久精品电影小说 | 女人被狂操c到高潮| 国产成人精品久久久久久| 天美传媒精品一区二区| 波多野结衣巨乳人妻| 婷婷六月久久综合丁香| 极品教师在线视频| 亚洲av日韩在线播放| 啦啦啦中文免费视频观看日本| 午夜精品一区二区三区免费看| 日本色播在线视频| 建设人人有责人人尽责人人享有的 | 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 国产男女超爽视频在线观看| 成人午夜高清在线视频| 中文资源天堂在线| 国产一区亚洲一区在线观看| av黄色大香蕉| 婷婷六月久久综合丁香| 又爽又黄无遮挡网站| 国产成人精品久久久久久| 日韩av在线大香蕉| 国产精品不卡视频一区二区| 九色成人免费人妻av| 成年av动漫网址| 亚洲精品久久久久久婷婷小说| 日韩欧美精品免费久久| 成人亚洲精品一区在线观看 | 哪个播放器可以免费观看大片| 亚洲成人久久爱视频| 黄色日韩在线| 卡戴珊不雅视频在线播放| 久久久欧美国产精品| 久久久久久久久大av| 欧美丝袜亚洲另类| 日韩精品青青久久久久久| 最后的刺客免费高清国语| 不卡视频在线观看欧美| 一级毛片久久久久久久久女| 亚洲人成网站在线观看播放| 一级a做视频免费观看| 亚洲美女搞黄在线观看| 亚洲成人中文字幕在线播放| 麻豆乱淫一区二区| 日韩精品青青久久久久久| 亚洲四区av| 黄色一级大片看看| 午夜亚洲福利在线播放| 尾随美女入室| 乱人视频在线观看| 精品久久久久久久人妻蜜臀av| 亚洲综合色惰| 久久久久久久久久久丰满| 日本与韩国留学比较| 精品一区二区三区视频在线| 高清午夜精品一区二区三区| 美女内射精品一级片tv| 岛国毛片在线播放| 国精品久久久久久国模美| 欧美日本视频| 精品一区在线观看国产| 赤兔流量卡办理| 美女国产视频在线观看| 熟妇人妻不卡中文字幕| 最新中文字幕久久久久| 午夜福利成人在线免费观看| 亚洲成人精品中文字幕电影| 国产乱来视频区| 午夜福利高清视频| 五月天丁香电影| 久久久久久久久久人人人人人人| 卡戴珊不雅视频在线播放| 高清视频免费观看一区二区 | 看十八女毛片水多多多| 色播亚洲综合网| 麻豆成人av视频| 精品久久国产蜜桃| 天堂av国产一区二区熟女人妻| 97超视频在线观看视频| 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美| 欧美日韩精品成人综合77777| 三级国产精品片| 边亲边吃奶的免费视频| 亚洲四区av| 99视频精品全部免费 在线| 国产av国产精品国产| av在线亚洲专区| 男女边吃奶边做爰视频| 波多野结衣巨乳人妻| 一级片'在线观看视频| 国产 一区 欧美 日韩| 日韩制服骚丝袜av| 又爽又黄a免费视频| 亚洲美女视频黄频| 日日啪夜夜爽| 国产成人91sexporn| 亚洲久久久久久中文字幕| 亚洲国产精品sss在线观看| 人妻少妇偷人精品九色| 国产精品1区2区在线观看.| 嫩草影院新地址| 人妻一区二区av| 我要看日韩黄色一级片| 亚洲欧美成人精品一区二区| 深爱激情五月婷婷| 亚洲在久久综合| 最近视频中文字幕2019在线8| 午夜视频国产福利| 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看 | 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 禁无遮挡网站| 国产免费一级a男人的天堂| 久久午夜福利片| 成人亚洲精品一区在线观看 | 国产精品久久久久久精品电影| 特大巨黑吊av在线直播| 亚洲欧洲国产日韩| 欧美 日韩 精品 国产| 2021天堂中文幕一二区在线观| 亚洲人与动物交配视频| 国产极品天堂在线| 国产视频内射| 国产午夜精品久久久久久一区二区三区| 久久精品国产亚洲网站| 91aial.com中文字幕在线观看| 免费在线观看成人毛片| 91aial.com中文字幕在线观看| 99热这里只有是精品在线观看| 午夜福利在线在线| 亚洲成人一二三区av| 国产精品无大码| 麻豆精品久久久久久蜜桃| 国产亚洲5aaaaa淫片| 久久精品夜色国产| 国产黄频视频在线观看| 特大巨黑吊av在线直播| 婷婷六月久久综合丁香| 久久久a久久爽久久v久久| 日韩大片免费观看网站| 亚洲三级黄色毛片| 日韩av免费高清视频| 可以在线观看毛片的网站| 精品久久久久久久久av| 97超碰精品成人国产| av一本久久久久| kizo精华| 校园人妻丝袜中文字幕| 网址你懂的国产日韩在线| 国产免费视频播放在线视频 | 国产老妇伦熟女老妇高清| 欧美三级亚洲精品| 乱系列少妇在线播放| 男女边摸边吃奶| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 亚洲av国产av综合av卡| 亚洲精品中文字幕在线视频 | 99热6这里只有精品| 蜜臀久久99精品久久宅男| 韩国av在线不卡| 午夜福利在线在线| 99久国产av精品| 男女下面进入的视频免费午夜| 亚洲国产成人一精品久久久| 国产精品久久久久久精品电影| 观看免费一级毛片| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| 成人午夜精彩视频在线观看| 免费看美女性在线毛片视频| 亚洲最大成人中文| videossex国产| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 老司机影院成人| 人妻夜夜爽99麻豆av| 乱系列少妇在线播放| 国产黄色免费在线视频| 啦啦啦啦在线视频资源| 搡女人真爽免费视频火全软件| 色尼玛亚洲综合影院| 99久久中文字幕三级久久日本| 国产成人a区在线观看| 精品久久久久久久久av| 免费看不卡的av| 观看美女的网站| 亚洲欧美日韩东京热| 久久6这里有精品| 欧美最新免费一区二区三区| 美女cb高潮喷水在线观看| av在线蜜桃| 日韩 亚洲 欧美在线| 男人舔奶头视频| 麻豆精品久久久久久蜜桃| av免费观看日本| 别揉我奶头 嗯啊视频| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片 精品乱码久久久久久99久播 | 国产在线男女| 在线观看美女被高潮喷水网站| 国产成人精品福利久久| 美女内射精品一级片tv| 亚洲av日韩在线播放| 日韩 亚洲 欧美在线| 自拍偷自拍亚洲精品老妇| 女的被弄到高潮叫床怎么办| 成人国产麻豆网| 真实男女啪啪啪动态图| 一级a做视频免费观看| 欧美日本视频| 91精品伊人久久大香线蕉| av天堂中文字幕网| 成人av在线播放网站| 亚洲精品日韩在线中文字幕| 亚洲av不卡在线观看| 草草在线视频免费看| 亚洲av成人精品一区久久| 男女边吃奶边做爰视频| 国产成人一区二区在线| 精品久久久久久久末码| av网站免费在线观看视频 | 午夜福利高清视频| 国产精品伦人一区二区| 97人妻精品一区二区三区麻豆| 国产一级毛片在线| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄| 精品久久久噜噜| 狂野欧美激情性xxxx在线观看| 麻豆成人av视频| 欧美成人a在线观看| 身体一侧抽搐| 亚洲一区高清亚洲精品| 久久久久久伊人网av| 一级毛片aaaaaa免费看小| 成人漫画全彩无遮挡| 国产精品.久久久| 国产亚洲av嫩草精品影院| av网站免费在线观看视频 | 亚洲精品视频女| 超碰97精品在线观看| 免费播放大片免费观看视频在线观看| 亚洲在线观看片| 听说在线观看完整版免费高清| 少妇高潮的动态图| 国产亚洲精品久久久com| 在线观看av片永久免费下载| 女的被弄到高潮叫床怎么办| 日韩三级伦理在线观看| 日韩成人伦理影院| av卡一久久| 人妻夜夜爽99麻豆av| 成年免费大片在线观看| 婷婷六月久久综合丁香| av专区在线播放| 亚洲精品久久午夜乱码| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 非洲黑人性xxxx精品又粗又长| 哪个播放器可以免费观看大片| 午夜久久久久精精品| 国国产精品蜜臀av免费| 少妇高潮的动态图| av女优亚洲男人天堂| 欧美日韩在线观看h| 亚洲不卡免费看| 国产精品一区二区三区四区久久| 国产精品不卡视频一区二区| 欧美xxxx黑人xx丫x性爽| 午夜福利高清视频| 欧美极品一区二区三区四区| 久久人人爽人人爽人人片va| 十八禁网站网址无遮挡 | 黄片无遮挡物在线观看| 国产综合懂色| 成人漫画全彩无遮挡| av福利片在线观看| 最近的中文字幕免费完整| 日本色播在线视频| 天堂网av新在线| 观看美女的网站| 国产精品久久久久久久电影| 国产亚洲一区二区精品| 日韩大片免费观看网站| 人妻一区二区av| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片| 婷婷色麻豆天堂久久| 国产91av在线免费观看| 国产精品三级大全| 国产黄片美女视频| 午夜激情欧美在线| 久久久成人免费电影| 国产在线男女| 好男人视频免费观看在线| 我的老师免费观看完整版| 国产一级毛片在线| 又粗又硬又长又爽又黄的视频| 伊人久久精品亚洲午夜| 好男人在线观看高清免费视频| 色综合亚洲欧美另类图片| 少妇的逼水好多| 日韩av在线大香蕉| 中文字幕av成人在线电影| 亚洲美女搞黄在线观看| a级毛片免费高清观看在线播放| 三级经典国产精品| 能在线免费观看的黄片| 看非洲黑人一级黄片| 国产探花在线观看一区二区| 一夜夜www| 免费观看在线日韩| 亚洲一区高清亚洲精品| 精品午夜福利在线看| 天天一区二区日本电影三级| 99久久精品国产国产毛片| 国产真实伦视频高清在线观看| 亚洲人成网站高清观看| 最近中文字幕高清免费大全6| 三级国产精品欧美在线观看| 国产一级毛片在线| 少妇的逼好多水| 久久鲁丝午夜福利片| 亚洲国产精品成人久久小说| 亚洲欧洲国产日韩| 国产成人午夜福利电影在线观看| 能在线免费看毛片的网站| 人人妻人人澡欧美一区二区| 老师上课跳d突然被开到最大视频| 深爱激情五月婷婷| 大话2 男鬼变身卡| 久久久久久久国产电影| a级毛片免费高清观看在线播放| 国产男女超爽视频在线观看| 99热这里只有是精品在线观看| 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看 | 久久久国产一区二区| 伦理电影大哥的女人| 久99久视频精品免费| 久久久久精品久久久久真实原创| 久久久久久久亚洲中文字幕| 一区二区三区四区激情视频| 国产永久视频网站| 校园人妻丝袜中文字幕| 性色avwww在线观看| 22中文网久久字幕| 精品久久久久久久久久久久久| 国产精品爽爽va在线观看网站| 国产熟女欧美一区二区| 国产v大片淫在线免费观看| 国产精品一区二区三区四区久久| 岛国毛片在线播放| 亚洲精品成人av观看孕妇| 97超视频在线观看视频| 国内精品一区二区在线观看| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 一级毛片 在线播放| 亚洲在久久综合| 成人av在线播放网站| 亚洲伊人久久精品综合| 久久久久久久久久成人| 国产精品嫩草影院av在线观看| 最新中文字幕久久久久| 国产精品人妻久久久久久| 精品久久久精品久久久| 亚洲成人中文字幕在线播放| 精品久久久久久久人妻蜜臀av| 国语对白做爰xxxⅹ性视频网站| 91av网一区二区| 成人午夜精彩视频在线观看| 亚洲va在线va天堂va国产| 日本午夜av视频| 国产午夜精品一二区理论片| 春色校园在线视频观看| 哪个播放器可以免费观看大片| 天堂av国产一区二区熟女人妻| 一区二区三区乱码不卡18| 五月伊人婷婷丁香| 欧美高清成人免费视频www| 午夜精品在线福利| 久久精品久久久久久噜噜老黄| 免费观看精品视频网站| 好男人视频免费观看在线| 欧美日韩在线观看h| 日韩欧美一区视频在线观看 | 纵有疾风起免费观看全集完整版 | 国产真实伦视频高清在线观看| 美女被艹到高潮喷水动态| 插阴视频在线观看视频|