基于適體的石英晶體微天平傳感器的研究進(jìn)展

吳莉婷 蘇雪 林俊生

（華僑大學(xué)醫(yī)學(xué)院，泉州362021）

核酸適配體，又稱適體（Aptamer），是一類短鏈的功能性寡核苷酸片段，可以是RNA、單鏈DNA，偶見報(bào)道為雙鏈DNA。適體在鹽溶液中形成凸環(huán)、發(fā)卡、假結(jié)、G-四堿基體等特殊的三維空間結(jié)構(gòu)，在氫鍵、疏水作用力、范德華力等作用力下與靶標(biāo)分子特異性結(jié)合［1］。適體與靶標(biāo)分子結(jié)合特異性高且親和力強(qiáng)，解離常數(shù)范圍在10-12-10-9mol/L之間［2］，已被廣泛地應(yīng)用于分析、檢測(cè)、治療、傳感器等多個(gè)領(lǐng)域［3］。作為功能性分子，適體在經(jīng)過體外篩選后，需要對(duì)其特異性、穩(wěn)定性、親和力及與靶標(biāo)間的相互作用等功能進(jìn)行表征。現(xiàn)階段常用的表征方法有點(diǎn)雜交、熒光免疫、流式細(xì)胞術(shù)和高效液相等。近年來，將適體作為識(shí)別分子應(yīng)用于生物傳感器也顯示出了良好的應(yīng)用前景［4］。石英晶體微天平（Quartz crystal microbalance，QCM）是利用石英晶體的壓電效應(yīng)，將電極表面的質(zhì)量變化轉(zhuǎn)化為振蕩電路輸出的電信號(hào)頻率變化的一種生物傳感器，由于具有靈敏度高，檢測(cè)方便、迅速，裝置簡(jiǎn)單，且在檢測(cè)過程中無需標(biāo)記等優(yōu)點(diǎn)而得到重視［5］?，F(xiàn)今基于適體的QCM傳感器已經(jīng)被用于小分子［6］、蛋白質(zhì)［7］、細(xì)胞［8］、細(xì)菌［9］和病毒［10］等多種靶標(biāo)的檢測(cè)，并表現(xiàn)出一定的普適性。此外，QCM還具有實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，精確度高，穩(wěn)定性強(qiáng)及可再生等優(yōu)點(diǎn)［11］。因此，該技術(shù)被廣泛地應(yīng)用于高靈敏度生物傳感器領(lǐng)域?；诖?，本文將對(duì)基于適體的石英晶體傳感器的相關(guān)研究及應(yīng)用進(jìn)行綜述，旨在為適體的篩選以及適體在基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)、臨床診斷和疾病治療中的進(jìn)一步應(yīng)用提供參考。

1 基于適體傳感器的分類

從結(jié)構(gòu)上來看，基于適體的生物傳感器主要由兩個(gè)部分組成：一是利用適體分子作為感受器，具有識(shí)別能力；二是信號(hào)轉(zhuǎn)換器，主要包括電化學(xué)信號(hào)轉(zhuǎn)換器、光學(xué)信號(hào)轉(zhuǎn)換器、壓電石英晶體轉(zhuǎn)換器等。當(dāng)待測(cè)靶標(biāo)分子與適體分子特異性結(jié)合后產(chǎn)生一個(gè)生物信號(hào)，適體傳感器通過信號(hào)轉(zhuǎn)換器將此信號(hào)轉(zhuǎn)變并放大為可以輸出的信號(hào)。

以電極作為換能器的電化學(xué)傳感器起步較早，是將檢測(cè)到的生物信號(hào)轉(zhuǎn)換為電信號(hào)的一種傳感系統(tǒng)，依據(jù)待測(cè)靶標(biāo)與適體結(jié)合前后構(gòu)象的變化，可以設(shè)計(jì) Signal-off［12-13］和 Signal-on［14］兩種模式的適體電化學(xué)傳感器，前者出現(xiàn)結(jié)合后信號(hào)降低，而后者結(jié)合后信號(hào)增強(qiáng)，前者的靈敏度一般低于后者。目前來說，電化學(xué)生物傳感器技術(shù)相對(duì)成熟，應(yīng)用廣泛。后期研究將其結(jié)合適體的特異性和親和力研制出一種新型的電流型電化學(xué)傳感器，用于針對(duì)凝血酶不同表位的兩種適體的檢測(cè)，最低可檢測(cè)出10 nmol/L的凝血酶［15-17］。另外，我國(guó)西南大學(xué)實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的基于殼聚糖/碳納米管/石墨烯/鐵氰化鎳（CS-CNTs-Gra-FP）納米復(fù)合材料的電化學(xué)適體傳感器用于檢測(cè)凝血酶適體也取得良好的結(jié)果。他們利用（CS-CNTs-Gra-FP）作為FP的固相載體，并結(jié)合金納米技術(shù)，此方法不僅增大了電極的比表面積、電子的傳輸速率，同時(shí)也增加了FP的固載量，從而極大的提高了該類適體傳感器的靈敏度，用來檢測(cè)凝血酶適體檢測(cè)限能達(dá)到3 pmol/L［18］。

光學(xué)生物傳感器是利用待測(cè)靶標(biāo)與光發(fā)生相互作用時(shí)，光的一些參數(shù)會(huì)發(fā)生變化，通過檢測(cè)這些參數(shù)的變化，分析待測(cè)靶標(biāo)的濃度和結(jié)構(gòu)等特征來實(shí)現(xiàn)檢測(cè)的。光學(xué)適體傳感器可將適體識(shí)別得到的生物信號(hào)轉(zhuǎn)化為光學(xué)信號(hào)輸出，該技術(shù)可利用熒光、干涉、折射、表面等離子共振技術(shù)（Surface plasmon resonance technology，SPR）、橢偏、化學(xué)發(fā)光等多種方式進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)根據(jù)所選的檢測(cè)材料的不同主要可分為光纖維適體傳感器、表面等離子共振適體傳感器、化學(xué)發(fā)光適體傳感器和熒光適體傳感器等。化學(xué)發(fā)光傳感器作為學(xué)科交叉與滲透的產(chǎn)物，成為近年來非?；钴S的研究領(lǐng)域，如酶基化學(xué)發(fā)光傳感器［19］、免疫化學(xué)發(fā)光傳感器［20］、化學(xué)發(fā)光反應(yīng)同時(shí)作為分子識(shí)別反應(yīng)的傳感器［21］等。嚴(yán)喜鸞等［22］利用基于適體生物傳感器的堿性磷酸酯酶化學(xué)發(fā)光檢測(cè)腺苷，該方法以羧基磁珠為固相載體，將腺苷適體與地高辛修飾過的腺苷適體互補(bǔ)序列固定到羧基磁珠的表面，檢測(cè)時(shí)先加入一定的待測(cè)靶標(biāo)腺苷，再加入抗地高辛的堿性磷酸酯酶，用化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)發(fā)光值，根據(jù)靶標(biāo)加入前后化學(xué)發(fā)光的變化強(qiáng)度來定量腺苷濃度，結(jié)果顯示，在1.0×10-7-1.0×10-3mol/L范圍內(nèi)，腺苷濃度的對(duì)數(shù)與發(fā)光強(qiáng)度呈線性關(guān)系（R2=0.976 9），檢測(cè)限能達(dá)到1.0×10-7mol/L。而Lee等［23］利用適體光纖生物傳感器定量檢測(cè)凝血酶與凝血酶適體的結(jié)合能力，檢測(cè)限低至10 nmol/L。

壓電晶體生物傳感器是利用晶體的壓電效應(yīng)發(fā)展起來的，相對(duì)于之前的各種基于適體的生物傳感器具有實(shí)時(shí)在線監(jiān)測(cè)，靈敏度高，且不需要任何的標(biāo)記，方便快捷的優(yōu)勢(shì)。此類傳感器的研究相對(duì)更多，如壓電免疫傳感器［24］、氰根離子壓電傳感器［25］、石英晶體微天平［26］等。其中壓電免疫傳感器是在壓電晶體的表面固定一層能與待測(cè)靶標(biāo)特異性結(jié)合的適體，引起壓電晶體的頻率變化，根據(jù)頻率的變化數(shù)值來定量測(cè)定待測(cè)靶標(biāo)的含量。氰根離子壓電傳感器是在鍍銀的石英晶體表面修飾一層硫化銀膜，該膜可選擇性的與氰根小分子適體結(jié)合，引起壓電晶體振蕩頻率的改變，此傳感器用以檢測(cè)水中的游離氰離子的線性范圍可達(dá)到2×10-5-0.02 μmol/L。石英晶體微天平則是利用石英晶體芯片一面的電極進(jìn)行化學(xué)反應(yīng)，此芯片表面同時(shí)為質(zhì)量傳感器的傳感面，可用來在線跟蹤電極表面的質(zhì)量變化。Abadian等［27］在芯片表面修飾了一層有代表性輸尿管支架表面的聚合物，隨后用尿素酶涂覆，以促進(jìn)磷酸鈣和磷酸鎂的結(jié)晶，使用QCM定量檢測(cè)聚合物表面上晶體沉積的變化。

2 基于適體的石英晶體微天平傳感器基本原理

該技術(shù)以適體為感應(yīng)元件，石英晶體芯片作為換能器，將芯片表面吸附物質(zhì)的質(zhì)量信號(hào)轉(zhuǎn)換為頻率信號(hào)，用于檢測(cè)適體與靶標(biāo)間相互作用的一種質(zhì)量敏感型壓電傳感器［28］。信號(hào)采集是在檢測(cè)過程中石英晶體受到交變電壓的影響產(chǎn)生振蕩電路，當(dāng)振蕩頻率與石英晶體的固有頻率不一致時(shí)無法被記錄，只有當(dāng)兩者的共振頻率一致時(shí)，晶體芯片的振動(dòng)信號(hào)最大，從而被記錄。在一定條件下，當(dāng)石英晶體表面吸附物質(zhì)質(zhì)量改變時(shí)，晶體固有頻率隨吸附質(zhì)量的大小而改變，從而使得到的信號(hào)發(fā)生改變。1959年，Sauerbrey［29］研究表明，石英晶體表面質(zhì)量負(fù)載與石英晶體頻率變化之間存在以下關(guān)系：

式中f0為石英晶體的基頻，A為石英晶體電極的有效面積，ρq為石英晶體密度，μq為石英晶體剪切模量，Δm為石英晶體表面的質(zhì)量變化，負(fù)號(hào)表明表面質(zhì)量增加引起石英諧振器頻率降低。由Sauerbrey方程可知，晶體表面質(zhì)量變化與頻率變化存在線性關(guān)系?；谶m體的石英晶體微天平傳感器在晶體芯片表面固定適體作為特異性的感應(yīng)元件，與靶標(biāo)結(jié)合過程中引起芯片表面吸附質(zhì)量增大，從而引起頻率下降，用于定性或者定量分析適體與靶標(biāo)間的相互作用。

3 石英晶體微天平傳感器在適體功能性表征方面的應(yīng)用

自1990年至今，已有大量適體被篩選出來，其靶標(biāo)可分為小分子化合物、蛋白質(zhì)、細(xì)胞、細(xì)菌、病毒及寄生蟲，甚至是特異性的組織［30］等，石英晶體微天平所具有的特性，使其逐步成為近年來適體與靶標(biāo)相互作用的表征和用于構(gòu)建高靈敏的適體石英晶體傳感器的方法之一。根據(jù)靶標(biāo)的不同，現(xiàn)已應(yīng)用于功能性表征的靶標(biāo)主要為小分子或離子、蛋白質(zhì)（圖1）、細(xì)胞或者細(xì)菌和病毒等，如表1所示。

4 石英晶體微天平傳感器在適體性能表征方面的優(yōu)缺點(diǎn)

石英晶體微天平技術(shù)作為微質(zhì)量傳感器，它獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)使得其被廣泛應(yīng)用于化學(xué)、物理、生物、醫(yī)學(xué)和表面科學(xué)等領(lǐng)域中，用于進(jìn)行待測(cè)物質(zhì)的成分分析或者質(zhì)量測(cè)定和黏彈性結(jié)構(gòu)檢測(cè)等，它表現(xiàn)出來的在線跟蹤檢測(cè)過程的變化是其他方法無法比擬的，將其應(yīng)用于適體與靶標(biāo)的親和力表征中也同樣不可替代。

圖1 QCM用來表征蛋白質(zhì)類靶標(biāo)適體的示意圖

表1 基于適體的石英晶體微天平傳感器的部分應(yīng)用

4.1 表征小分子靶標(biāo)的優(yōu)勢(shì)

石英晶體微天平為質(zhì)量依賴型傳感器，相對(duì)分子質(zhì)量較小，需要構(gòu)建高靈敏度的生物傳感器信號(hào)放大的過程必不可少。由于金納米顆粒的密度大，適體修飾的金納米顆粒易于修飾合成，故而金納米顆粒的放大作用在檢測(cè)中的使用最為廣泛［43］。Dong等［44］根據(jù) Hg2+與短鏈 HS-5′-（CH2）6-TTTT-3′能夠形成T-Hg（II）-T“三明治”結(jié)構(gòu)的原理，并結(jié)合納米金顆粒等材料，構(gòu)建了基于適體的QCM傳感器用于高敏檢測(cè)Hg2+。該技術(shù)檢測(cè)限可低至0.24 nmol/L，在特異性、可重復(fù)利用性不變的情況下，比Chen和Sheng等［45-46］構(gòu)建的同類型的傳感器檢測(cè)限低一個(gè)數(shù)量級(jí)，比常規(guī)使用的比色法和熒光測(cè)定法高10-100倍。此外，Zheng等［47］結(jié)合金納米顆粒的放大作用，利用特異性核酸適體不僅與靶標(biāo)分子可進(jìn)行特異性結(jié)合，同時(shí)可與互補(bǔ)鏈形成雙鏈的特點(diǎn)，設(shè)計(jì)了末端帶有-SH修飾的核酸適體互補(bǔ)序列，構(gòu)建了基于適體與腺苷和互補(bǔ)序列間競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合腺苷特異性檢測(cè)QCM傳感器，在腺苷濃度為0-2 μmol/L時(shí)，存在較好的線性關(guān)系（R2=0.991 48）。與之相似，Dong等［33］利用了兩種兩端可形成雙鏈，中間部分均含茶堿特異性結(jié)合單元的RNA適體，利用QCM通過金納米顆粒的放大作用，構(gòu)建了高靈敏度的茶堿的檢測(cè)方法，檢測(cè)限可降低至8.2 nmol/L。Song等［48］構(gòu)建了一種酶循環(huán)放大信號(hào)的ATP基于適體的QCM傳感器，該方法延續(xù)了?zalp［32］基于適體QCM傳感器進(jìn)行ATP定量檢測(cè)的高特異性，同時(shí)通過金納米顆粒和酶循環(huán)方法雙重方式進(jìn)行信號(hào)放大，將檢測(cè)限由10 μmol/L降低至1.3 nmol/L，是原方法的近10 000倍。

4.2 表征蛋白質(zhì)靶標(biāo)的優(yōu)勢(shì)

以蛋白質(zhì)為靶標(biāo)的適體QCM傳感器應(yīng)用較廣泛。首先，可用于適體使用條件的優(yōu)化，Hianik等［49］利用QCM 檢測(cè)適體濃度、鹽離子濃度、pH等因素對(duì)適體與凝血酶在芯片表面結(jié)合的影響，動(dòng)態(tài)檢測(cè)了適體與凝血酶結(jié)合過程中各影響因素造成的結(jié)合行為變化。Nübel等［50］通過適體QCM檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，特異性的腫瘤壞死因子α（Tumor necrosis factor α，TNFα）適體趨向于與多聚體形式的TNFα進(jìn)行特異性結(jié)合，破解了該適體與靶細(xì)胞親和力高但與靶蛋白的親和力較弱的謎題，為該適體后期的使用提供了較有力的理論依據(jù)。其次，可用于蛋白質(zhì)高靈敏度的檢驗(yàn)，Chen等［35］利用金納米粒的放大作用，運(yùn)用適體QCM傳感器將凝血酶的檢測(cè)限由12.5 nmol/L降低至0.1 nmol/L，并在實(shí)際血清樣品中取得較好的檢測(cè)效果。另外，He等［51］通過金納米粒檢測(cè)技術(shù)和滾環(huán)擴(kuò)增技術(shù)聯(lián)合使用，將凝血酶的檢測(cè)限降低至0.78 aM，可用于超高靈敏度的凝血酶檢測(cè)。

4.3 表征病毒靶標(biāo)的優(yōu)勢(shì)

在病毒檢測(cè)方面，Brockman等［42］構(gòu)建了基于適體的QCM傳感器用于檢測(cè)禽流感病毒H5N1，結(jié)合磁性納米微粒的信號(hào)放大作用，該傳感器的檢測(cè)限可達(dá)到1 HAU，并具有較高的特異性，同類型病毒H7N2、H9N2和H5N9等引起的信號(hào)響應(yīng)均較小。此外，Wang等［52］結(jié)合高分子水凝膠技術(shù)，合成特異性的適體-高分子水凝膠復(fù)合物，固定在QCM表面后用于病毒的檢測(cè)，檢測(cè)限為0.0128 HAU，比Brockman的方法靈敏度高100倍，檢測(cè)時(shí)間也由1 h縮短為0.5 h。隨后，該團(tuán)隊(duì)結(jié)合碳量子點(diǎn)技術(shù)，將檢測(cè)范圍由原來的0.0128-0.64 HAU提升至0.4-32 HAU，檢測(cè)時(shí)間有所縮短，并且該傳感器有非常好的穩(wěn)定性，存放96 d后其檢測(cè)性能依然較好［53］。

對(duì)于石英晶體微天平傳感器在適體性能表征方面的研究重點(diǎn)主要在于信號(hào)放大作用，但信號(hào)放大的過程中易造成非特異性偏差。本課題組正在利用QCM-D技術(shù)開展靶標(biāo)為蛋白質(zhì)的適體相關(guān)的實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目［54］，從目前的研究中推測(cè)：在使用QCM-D技術(shù)時(shí)需要特別關(guān)注的是蛋白質(zhì)在芯片表面的非特異性吸附，所以不同的適體固定方法需要考慮添加不同的封閉劑進(jìn)行封閉?，F(xiàn)階段對(duì)于細(xì)胞、細(xì)菌和病毒相關(guān)基于適體的石英晶體微天平傳感器的報(bào)道較少，主要原因是這幾類靶標(biāo)在石英晶體微天平檢測(cè)過程中易出現(xiàn)沉降現(xiàn)象及由于細(xì)胞等在溶液中可處于浮動(dòng)狀態(tài)，與芯片上固定的適體直接結(jié)合時(shí)會(huì)出現(xiàn)信號(hào)響應(yīng)過小的現(xiàn)象，本課題組也相應(yīng)的進(jìn)行了精子細(xì)胞與對(duì)應(yīng)適體的結(jié)合力表征，并聯(lián)合顯微鏡等常規(guī)技術(shù)用以監(jiān)測(cè)精子細(xì)胞在石英晶體芯片上的動(dòng)態(tài)過程，目前精子細(xì)胞作為靶標(biāo)相關(guān)的數(shù)據(jù)處理模型仍處于研發(fā)狀態(tài)。因此，基于適體的石英晶體微天平傳感器的應(yīng)用中需要對(duì)信號(hào)響應(yīng)放大及減少非特異性吸附等方面進(jìn)行改進(jìn)。同時(shí)，QCM-D技術(shù)的使用價(jià)格稍貴，儀器設(shè)備需要小心維護(hù)。

5 展望

隨著該類傳感器越來越被學(xué)者關(guān)注，傳感器存在的以上問題正在被逐步解決，應(yīng)用范圍也在逐漸擴(kuò)大。適體化學(xué)成分可為DNA、RNA等，不僅可以用于適體與靶標(biāo)結(jié)合行為的表征和高靈敏高特異性傳感器的構(gòu)建，還可作為其他基于適體傳感器構(gòu)建過程中輔助技術(shù)，常用于適體在傳感器表面固定量的實(shí)時(shí)檢測(cè)，并可與其他表征技術(shù)聯(lián)用，多方面進(jìn)行分子間相互作用的表征。除此之外，QCM在檢測(cè)適體與靶標(biāo)分子相互作用時(shí)越來越受到認(rèn)可，可作為其他技術(shù)的驗(yàn)證性方法。