APE1介導的功能核酸生物傳感器研究進展

賀萬崇 黃昆侖，2 許文濤，2

（1. 中國農業(yè)大學食品科學與營養(yǎng)工程學院，北京 100083；2.農業(yè)部農業(yè)轉基因生物安全評價（食用）重點實驗室，北京 100083）

在人類正常的生命活動中，作為遺傳物質的DNA經常會遭受各種各樣的損傷，其中非常重要的一種損傷形式即為堿基缺失損傷。堿基缺失位點（AP位點）會在機體正常狀態(tài)下自發(fā)形成，也可以由外源因子及氧化損傷誘導產生。在正常的生理狀態(tài)下，相較于脫嘧啶位點，脫嘌呤位點更為常見。每天每個細胞會產生1-2萬個左右脫嘌呤位點，500個左右脫嘧啶位點，根據細胞類型不同，生成的AP位點的數(shù)量也會有所不同［1］。在對于AP位點的堿基切除修復（Base excision repair，BER）過程中，脫嘌呤/脫嘧啶核酸內切酶（Apurinic/apyrimidinic endonuclease，APE）扮演著重要的角色，而APE1又是APE家族中非常重要的一種。研究表明，哺乳動物細胞中AP位點的切除主要是在APE1的作用下實現(xiàn)的（占到了整個BER途徑的95%以上）［2］，其能夠特異性地在AP位點處切開DNA鏈，并與其他酶，如DNA修復酶（PARP）、DNA聚合酶β等，先后作用實現(xiàn)對于堿基缺失損傷的切除修復［3］。

在目前已有的許多快速檢測手段中，很多都利用到了各種酶的特異性切割能力。同時，以包括核酸探針、適配體、G四聯(lián)體在內的功能核酸為基礎的生物傳感器因其靈活多樣的特點在過去幾十年間也得到了廣泛的應用。而由于APE1對于AP位點有著特異性作用，因此可以利用其與功能核酸聯(lián)用設計功能核酸生物傳感器用于各種靶物質的檢測。如設計一段帶有AP位點的功能核酸探針，利用APE1對其進行特異性切割，得到的產物能夠發(fā)出熒光或與其他物質發(fā)生特異性結合生成電化學信號。到目前為止，研究者已經制備出了一些與APE1活性相關的功能核酸生物傳感器，其中既有APE1介導的用于檢測其他酶如DNA糖基化酶的活性，又有對APE1本身的活性進行檢測。根據它們的信號輸出原理，可以將其分為電化學生物傳感器、熒光生物傳感器等。同時，其中還有一些實現(xiàn)了與納米材料如金納米粒子、二氧化硅納米粒子的結合，未來有著應用于體內檢測的價值。

目前與APE1相關的功能核酸生物傳感器主要可以分為以下兩類：利用APE1特殊的酶活性構建功能核酸生物傳感器，通過輸出電化學或熒光信號實現(xiàn)對一些靶物質或酶活性的精確檢測［4-5］；以APE1及其酶活性為目標，將構建好的特殊的核酸探針分別遞送至正常細胞及癌癥細胞，通過生成的熒光信號證明APE1作為癌癥生物標志物的利用價值并實現(xiàn)對于癌癥的早期診斷，或者將APE1特異性抗體（anti-APE1）與金納米粒子（gold nanoparticles，Au NPs）和石墨烯等一些納米元件結合構建免疫生物傳感器，以APE1自身為靶物質對其進行免疫定量檢測（圖1）［6-7］。

圖1 與APE1相關的生物傳感器

1 APE1的基本特性

1.1 AP位點

AP位點是一種常見的會嚴重威脅人體基因組穩(wěn)定的DNA損傷類型。機體在正常狀態(tài)下，可能會通過自發(fā)脫嘌呤/嘧啶、損傷特異性DNA糖苷酶水解脫氧核糖和受損堿基之間的N-糖苷鍵或糖苷鍵的自發(fā)水解生成AP位點。由于嘧啶與嘌呤相比與脫氧核糖相連的糖苷鍵更為穩(wěn)定，因此脫嘌呤的形式更為常見。常見的水解N-糖苷鍵生成AP位點的DNA酶有甲基嘌呤DNA糖苷酶（MPG）、人類8-羥基-鳥嘌呤DNA糖苷酶（hOGG1）等。另外，S-腺苷甲硫氨酸（SAM）是一種內源性烷化劑，能將DNA堿基烷化使其帶負電，使得生成的N-糖苷鍵穩(wěn)定性減弱，從而脫掉堿基，生成AP位點［8-10］。

1.2 APE1基因與蛋白

人類的APE1基因定位于14號染色體長臂（14q11.2-12），是目前已知的人類基因組中最短的序列之一，從轉錄起始位點到polyT尾部的總長度約為2.6 kb，其中含有4個內含子、5個外顯子（第一個外顯子不編碼），有4個外顯子的長度都小于200 bp，另一個約為800 bp［11］。這個較大的外顯子包含有54%的APE1蛋白編碼區(qū)和所有的3’非編碼區(qū)。另外，APE1基因的啟動子內不存在TATA盒，而是含有多功能轉錄起始位點［12］。

人類APE1的相對分子質量為37 000，由318個氨基酸組成（圖2），其C端具有修復活性，N端含有核定位序列，是APE1氧化還原酶活性所必需的（圖3）。其中212位的天冬酰胺（Asn-212）和α8環(huán)內的第222-229位氨基酸對于APE1與DNA上的AP位點結合并在AP位點處發(fā)揮其酶活性切開DNA鏈有著十分重要的作用［13-14］。人類APE1的氨基酸序列高度保守，與其他哺乳動物甚至果蠅、細菌之間都存在著高度同源性［9］。研究表明，APE1在人體內普遍存在且總體表達水平都較高，但是在一些惡性腫瘤，尤其是卵巢癌、進展期宮頸癌、非小細胞肺癌和胃癌細胞中的表達有明顯增高［15-19］，Wen等［20］對APE1與卵巢癌之間的關系進行的研究發(fā)現(xiàn)，APE1的過量表達明顯促進了卵巢癌癥狀的發(fā)展。Chen等［21］通過體外試驗證明，降低APE1的活性有助于提高放射療法殺滅人類胰腺癌細胞的效果。另外，Str?bel等［22］還發(fā)現(xiàn)，APE1介導的DNA修復過程會提高惡性膠質瘤對于抗癌藥物的耐受性。這些研究成果證明，APE1可以作為一種生物標志物用于癌癥的早期診斷。因此，構建生物傳感器實現(xiàn)對APE1活性的高靈敏、高特異性檢測對于癌癥的早期診斷有著非常重要的意義。

圖2 人類APE1的氨基酸序列

1.3 APE1對AP位點的作用

AP位點可以在插入酶的作用下，以另一條完整鏈為模板根據堿基互補配對原則補充正確的堿基進行修復；也可以在APE1的作用下，從5′-3′方向在缺失堿基片段處將DNA鏈切開，然后在DNA聚合酶作用下互補合成，最后在DNA連接酶的作用下完成修復［2］。

圖3 人類APE1的三維結構

2 APE1介導的功能核酸電化學生物傳感器

DNA甲基化是一種常見的DNA損傷形式，在正常狀況下不易被生物傳感器所檢測。利用APE1能夠在AP位點處切開DNA的特殊性質，將其與另外一些酶和信號分子聯(lián)用，Wu等［4］實現(xiàn)了對于DNA甲基化損傷的電化學形式的檢測。在DNA發(fā)生甲基化以后，首先利用人類烷基腺嘌呤DNA糖基化酶（hAAG）切除甲基化的腺嘌呤，在DNA上生成AP位點，之后APE1能夠在AP位點處切開DNA鏈生成不同長度的小的DNA片段。與正常的長鏈DNA相比，信號分子Ru（bpy）2（dppz）2+與短鏈DNA片段的結合能力降低，導致其與DNA結合生成的電化學信號出現(xiàn)明顯的減弱（圖4）。實驗表明，光電信號減弱的程度與造成DNA甲基化損傷的物質——甲基甲磺酸的量呈現(xiàn)良好的線性關系，該種生物傳感器能夠檢測到低至1 mmol/L的甲基甲磺酸造成的堿基甲基化，在此濃度下傳感器表面的DNA中的3-甲基腺嘌呤的量約為42.5 fmol。

圖4 APE1介導的功能核酸電化學生物傳感器用于DNA甲基化損傷檢測的原理圖［4］

3 APE1介導的功能核酸熒光生物傳感器

利用包括APE1在內的一些具有特殊活性的酶，將它們與具有熒光特性的物質結合，能夠實現(xiàn)對于一些靶物質的熒光信號檢測。Wang等［5］利用APE1和DNA聚合酶β以及量子點和熒光基團實現(xiàn)了對于hOGG1活性的檢測。他們首先通過鏈霉親和素-生物素的連接方式將反義鏈上修飾有8-氧鳥嘌呤（8-oxoG）的雙鏈DNA固定在量子點表面，當hOGG1存在時，其能識別8-oxoG并切斷脫氧核糖和受損堿基之間的N-糖苷鍵，釋放受損堿基形成AP位點。之后APE1在AP位點處發(fā)揮作用打開DNA的一條鏈，隨后在DNA聚合酶β的作用下，將標記有熒光基團Cy5的dGTP填補在AP位點處，生成帶有熒光標記的DNA雙鏈（圖5）。隨后，由于量子點與Cy5之間的熒光能量共振轉移（Fluorescence resonance energy transfer，F(xiàn)RET）效應，Cy5的熒光信號即可指示hOGG1的活性。實驗證明，當hOGG1的比活在 2×10-6U/μL-2×10-3U/μL 之間時，Cy5 的熒光信號與其比活的對數(shù)呈現(xiàn)出良好的線性關系。

圖5 APE1介導的功能核酸熒光生物傳感器用于hOGG1活性檢測的原理圖［5］

4 APE1介導的功能核酸納米生物傳感器

除了僅僅使用APE1與其他具有特異活性的酶以及一些信號分子外，將APE1與一些納米材料聯(lián)用能夠使APE1更好地發(fā)揮其特異性功能用于一些靶物質的檢測。

2015年，Zhang等［23］將APE1與二氧化硅-金納米粒子結合，實現(xiàn)了對DNA糖基化酶的活性檢測。與之前介紹的APE1介導的電化學傳感器的基本原理類似，他們將標記有電化學信號分子的DNA探針連接在固定于電極上的二氧化硅-金納米粒子上，提高了傳感器中DNA探針的穩(wěn)定性及電化學信號轉導的靈敏度，同時，他們還將信號分子Ru（bpy）2（dppz）2+修飾在納米材料單壁碳納米管（Single-walled carbon nanotube，SWCNT）上，之后再與DNA探針連接，這使得DNA探針上能夠標記較多的信號分子，實現(xiàn)了信號放大的功能。當hOGG1的比活在2-200 U/mL之間時，該生物傳感器的信號與酶的比活呈現(xiàn)良好的線性關系，同時該生物傳感器對于hOGG1的比活的檢出限能夠低至0.225 U/mL。

5 以APE1為靶物質的生物傳感器

5.1 APE1功能核酸生物傳感器

目前，對APE1活性進行檢測的功能核酸生物傳感器主要是利用熒光信號對APE1的活性進行表征。通過設計帶有AP位點并標有熒光基團的發(fā)卡狀功能核酸探針，F(xiàn)ang等［24］實現(xiàn)了對于APE1酶活性的定量檢測。另外，利用G四聯(lián)體與特異性物質結合發(fā)熒光的原理，Huang等［25］也實現(xiàn)了對APE1酶活性的熒光信號檢測。他們首先設計了在莖部具有AP位點的DNA發(fā)卡結構。APE1能夠在該處切開DNA的一條鏈生成一個新的3′-OH使得克列諾聚合酶能夠在此處開始引發(fā)聚合反應打開發(fā)卡結構形成雙鏈DNA，在形成的DNA雙鏈中包含有一段Nt.BbvCI核酸內切酶能夠識別的序列，Nt.BbvCI核酸內切酶會在此處切斷DNA的一條鏈，此時克列諾聚合酶重新發(fā)揮聚合酶作用使得富含鳥嘌呤的DNA單鏈片段脫落下來，通過不斷的循環(huán)過程生成大量的富含鳥嘌呤的DNA單鏈（圖6）。隨后，富含鳥嘌呤的DNA單鏈與熒光染料N-甲基卟啉二丙酸IX（NMM）發(fā)生特異性結合形成G4結構生成強烈的熒光信號?；谶@一原理，實現(xiàn)了對于APE1活性檢測的信號放大。實驗證明，當APE1的比活在0.01 U/mL-1.0 U/mL之間時，熒光信號強度與其有著良好的線性關系，該檢測方法對APE1活性的檢出限能夠低至0.006 U/mL。

2017年，Zhai等［6］利用APE1的特性，結合二氧化硅-金納米粒子，根據簡單的切割原理實現(xiàn)了對于活細胞中APE1活性的熒光檢測。同時，該方法有望應用于針對癌癥細胞的靶向藥物遞送。在該傳感器中，研究者將標有熒光基團以及修飾有AP位點的DNA納米探針通過鏈霉親和素-生物素的特異結合連接在二氧化硅-金納米粒子表面，由于此時熒光基團與納米粒子距離較近，熒光處于被淬滅狀態(tài)。當APE1具有活性時，能將DNA探針切斷釋放出標記有熒光基團的DNA單鏈，熒光基團重新發(fā)出熒光。如果將熒光基團替換為治療癌癥的藥物，由于APE1是一種典型的癌癥細胞的生物標志物，故該方法也具有應用于靶向遞送治療癌癥藥物的潛力。

圖6 G四聯(lián)體功能核酸生物傳感器用于循環(huán)放大檢測APE1活性的原理圖［25］

5.2 APE1免疫生物傳感器

除了檢測APE1的酶活性，目前還有一些研究以APE1為靶物質直接進行檢測。如Han等［26］利用金和鎳納米粒子的信號放大功能實現(xiàn)了對痕量APE1的檢測，Zhao等［27］利用抗體及信號分子Ru（bpy）32+實現(xiàn)了對于APE1的電化學信號免疫定量檢測。Zhuo等［28］利用與ELISA相似的原理，實現(xiàn)了對APE1的檢測，該方法的亮點在于其構建了包括碳納米管和金納米粒子在內的多種材料的復合微球。之后將APE1的特異性抗體以及信號分子標記在其表面，提高了APE1抗體的穩(wěn)定性，實現(xiàn)了對于APE1的電化學信號檢測。當APE1的濃度在1 fg/mL-1 pg/mL之間時，該檢測方法生成的電化學信號與APE1的活性呈現(xiàn)良好的線性關系，同時該方法對于APE1的的檢出限能夠低至0.3 fg/mL。與之類似，Zhong等［7］也制作了由金納米粒子和石墨烯組成的納米載體，以APE1為靶物質對其進行了雙抗體夾心法的電化學檢測。但總起來講，盡管直接以APE1為靶物質進行檢測能夠得到非常低的檢出限值，但無法直觀地反映其活性大小，而實際上APE1的活性大小才是其作為癌癥生物標志物反映機體狀況的關鍵。因此在對APE1進行檢測時，還是應當主要側重于利用其特異性設計生物傳感器，檢測其酶活性的大小。

6 APE家族其他成員的特性及傳感器檢測應用

APE家族共有4種類型的酶，它們在修復核酸損傷方面的的作用是類似的，都是在AP位點處的磷酸骨架上制造缺口。根據制造出的缺口的種類不同可以將它們分為I型和II型。

6.1 APE家族成員的分類及其特性

研究者主要將APE家族的成員分為兩大類：I型APE在AP位點的3′端通過β-消除作用切開核酸鏈，在AP位點處生成3′-OH以及帶有5′-磷酸基團的正常核酸鏈；II型APE在AP位點的5′端通過水解作用切開核酸鏈，在AP位點處生成5′-磷酸基團以及帶有3′-OH的正常核酸鏈［29］。目前APE家族的成員共有4位，它們都能識別并作用于AP位點，但作用機理和生成的切口略有不同。絕大多數(shù)APE都屬于屬于II型。人體內具有兩種APE，分別為APE1和APE2，不過APE1的活性遠高于APE2，在人體內的堿基切除修復過程中發(fā)揮了95%以上的作用，因此APE1是人體內最主要的APE［30］。人體內的APE2屬于II型APE，同時其活性十分依賴于人體內的金屬離子。

6.2 與APE4相關的功能核酸生物傳感器

與APE1相似，利用其他APE家族成員的特異性活性同樣能夠構建各種各樣的功能核酸生物傳感器。目前除APE1之外研究最多、應用最廣泛的是APE4。

利用APE4的活性以及滾環(huán)放大（Rolling circle amplification，RCA）技術得到帶有許多G四聯(lián)體結構的RCA產物，Wu等［31］實現(xiàn)了對于DNA糖基化酶活性的熒光信號放大。另外，Leung等［32］利用G四聯(lián)體同特異性信號分子結合發(fā)熒光的特性，同樣構建出了檢測APE4活性的熒光功能核酸生物傳感器。此外，將APE4與RCA相結合，同時利用了核酸外切酶III的特殊性質，Kong等［33］構建了帶有循環(huán)過程的功能核酸生物傳感器實現(xiàn)了對于熒光信號的放大。首先，APE4在AP位點處切開DNA單鏈，生成的大片段能夠作為引物探針與鎖式探針特異性結合開啟滾環(huán)擴增。而滾環(huán)擴增得到的產物能夠有間隔地與許多標記有熒光基團和淬滅基團的信號探針結合。之后，核酸外切酶III發(fā)揮作用，從信號探針的3′末端開始將信號探針切碎，生成的游離的標記有熒光基團的核酸重新發(fā)出熒光。而剩下的滾環(huán)擴增產物則可以進入下一個循環(huán)。該方法對檢測APE4或APE1的活性有較大的應用潛力。

7 結語

總體來說，目前APE1在功能核酸檢測領域的應用還是較少且比較單一的，在未來的研究中應著力充分發(fā)揮APE1的仿生學功能，使APE1成為功能核酸檢測中常用的酶工具之一。同時，APE1介導的功能核酸檢測技術的檢測對象還應進一步擴大，目前該類型的生物傳感器檢測對象絕大多數(shù)為DNA糖基化酶的活性，未來可以利用APE1的特異性切割活性，得到類型豐富的、能與更多靶物質發(fā)生特異性反應的功能核酸，使其在功能核酸重金屬及小分子檢測領域發(fā)揮更大的功能。另外，利用APE1的功能核酸生物傳感器的檢測手段還應進一步豐富，如將其與更多的熒光信號分子、電化學信號分子結合，使APE1能夠應用于更廣泛的檢測領域。

另外，由于APE1是一種比較典型的癌癥生物標志物，借鑒功能核酸生物傳感器進行檢測的原理，同樣可以將APE1的活性與標有熒光基團的功能核酸結合實現(xiàn)對于癌癥細胞的特異性體內成像以及治療癌癥藥物的靶向遞送，這對于癌癥的早期診斷和治療有著十分重要的意義。