同種異體排斥反應(yīng)的研究進(jìn)展和實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)的臨床觀點(diǎn)

劉偉（譯），Qiang Shi（石強(qiáng)），Afzal Nikaein（著） （.天津市第一中心醫(yī)院，天津009；.威斯康星大學(xué)，麥迪遜分校，醫(yī)學(xué)與公共衛(wèi)生學(xué)院外科學(xué)系移植科，美國(guó) 威斯康星州 麥迪遜 900； .醫(yī)療城達(dá)拉斯醫(yī)院移植免疫中心，美國(guó) 德克薩斯州 達(dá)拉斯 750）

全球器官移植的需求一直在穩(wěn)步增長(zhǎng)，新的挑戰(zhàn)可能會(huì)在未來幾年內(nèi)大大改變醫(yī)療領(lǐng)域。根據(jù)美國(guó)器官共享網(wǎng)絡(luò)（United Network for Organ Sharing，UNOS）的數(shù)據(jù)，2016年美國(guó)進(jìn)行了超過33 600例器官移植手術(shù)。由于醫(yī)療保健、營(yíng)養(yǎng)和公共衛(wèi)生的改善，將延長(zhǎng)全球人類的預(yù)期壽命，對(duì)器官移植的需求一直在穩(wěn)步增加。

為了進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)器官移植的可行性，除了降低成本和增加可移植器官的可用性外，更重要的是減少移植排斥反應(yīng)及改善移植物的功能。最近，分子診斷學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)和合成生物學(xué)等新的檢測(cè)方法逐漸應(yīng)用于受體移植狀態(tài)的評(píng)估，并且越來越多與移植物排斥反應(yīng)相關(guān)的新基因、微小RNA、蛋白質(zhì)和反應(yīng)途徑被陸續(xù)發(fā)現(xiàn)［1］。隨著這些發(fā)現(xiàn)的不斷加快，評(píng)估這些分子標(biāo)記物在臨床診斷中的意義則變得更為重要。除了評(píng)估這些指標(biāo)對(duì)同種異體移植早期排斥反應(yīng)的檢測(cè)靈敏度和特異性外，還必須了解這些指標(biāo)所表示的臨床信息，最終成功地將我們的科研成果轉(zhuǎn)化為臨床決策指標(biāo)。

在這篇綜述中，我們將討論導(dǎo)致同種異體移植排斥反應(yīng)的先天和適應(yīng)性分子和細(xì)胞免疫反應(yīng)。另外，我們將重點(diǎn)關(guān)注移植時(shí)發(fā)生的排斥反應(yīng)，以及僅在活檢樣本中發(fā)現(xiàn)的亞臨床排斥反應(yīng)。然后從實(shí)際角度介紹新型預(yù)測(cè)器官移植排斥反應(yīng)發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的檢測(cè)技術(shù)。最后提出有助于實(shí)驗(yàn)室診斷移植物排斥反應(yīng)的新方法。最終目標(biāo)是提供見解，幫助研究人員在實(shí)體器官移植后對(duì)排斥反應(yīng)發(fā)生進(jìn)行早期診斷成為可靠、無(wú)創(chuàng)的工具，并幫助臨床醫(yī)生根據(jù)生物標(biāo)記物開發(fā)個(gè)性化的移植前和移植后治療。

1 同種異體反應(yīng)細(xì)胞及其作用方式

值得一提的是，同種異體移植物的免疫損傷涉及先天免疫系統(tǒng)和適應(yīng)性免疫系統(tǒng)之間復(fù)雜的相互作用［2］。圖1列出了與同種異體排斥反應(yīng)有關(guān)的成分以及先天和適應(yīng)性免疫系統(tǒng)的主要特征。通常，在器官移植手術(shù)期間發(fā)生的組織損傷觸發(fā)先天免疫系統(tǒng)，包括由吞噬細(xì)胞和樹突細(xì)胞提呈的同種異體抗原。先天免疫系統(tǒng)的激活啟動(dòng)并放大了初始T細(xì)胞和B細(xì)胞分化，而B細(xì)胞需要T細(xì)胞的幫助以產(chǎn)生抗體。即使免疫系統(tǒng)的某一個(gè)組成部分可能占主導(dǎo)地位并導(dǎo)致排斥反應(yīng)，但排斥反應(yīng)通常是由多種機(jī)制、多因素整合產(chǎn)生。正如Thomas等［3］的研究表明，移植器官的失敗是由微血管中人類白細(xì)胞抗原（human leucocyte antigen，HLA）抗體介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)造成，這一結(jié)果是先天性和適應(yīng)性免疫反應(yīng)所產(chǎn)生的細(xì)胞因子造成的。

1.1 對(duì)供體器官的初始先天免疫反應(yīng)：危險(xiǎn)相關(guān)的分子模式（danger-associated molecular pattern，DAMP）能夠促進(jìn)同種異體移植物的即時(shí)免疫反應(yīng)。在受體與供體器官接觸的0～12小時(shí)內(nèi)，危險(xiǎn)相關(guān)分子立即起作用。DAMP與模式識(shí)別受體（pattern recognition receptor，PRR）結(jié)合，而這些模式受體的成員、分子結(jié)構(gòu)和功能均與移植物排斥反應(yīng)相關(guān)［4-5］。PRR主要表達(dá)于抗原遞呈細(xì)胞，包括吞噬細(xì)胞、樹突細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞（natural killer cell，NK）、肥大細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和器官實(shí)質(zhì)細(xì)胞。當(dāng)供體器官移植到受體中時(shí)，來自供體器官的抗原遞呈細(xì)胞可以通過血液循環(huán)感知從受損或應(yīng)激組織釋放的宿主衍生分子，并通過激活PRR，導(dǎo)致早期排斥反應(yīng)的發(fā)生。因此，整個(gè)身體能夠感知從受損移植組織釋放的保守肽序列并鑒別出這些肽段來自入侵的非自身抗原。盡管PRR的研究起源于感染的患者中，但最近的研究數(shù)據(jù)表明這些受體參與了器官排斥反應(yīng)［6-7］。

一旦識(shí)別出同種異體移植抗原，PRR就會(huì)觸發(fā)一系列信號(hào)導(dǎo)致細(xì)胞質(zhì)核轉(zhuǎn)錄因子（NF-κB）蛋白復(fù)合物轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞核中。這種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的結(jié)果是導(dǎo)致炎癥相關(guān)的基因轉(zhuǎn)錄迅速增加，通過活化的內(nèi)皮細(xì)胞和實(shí)質(zhì)細(xì)胞穩(wěn)定持續(xù)產(chǎn)生促炎細(xì)胞因子、趨化因子和黏附分子。這種早期炎癥反應(yīng)通過上調(diào)共刺激分子表達(dá)來加速排斥反應(yīng)，這破壞了共刺激和共抑制信號(hào)之間的平衡，導(dǎo)致更大的組織受損。因此，移植后不久就會(huì)發(fā)生抗原非依賴性促炎癥反應(yīng)，它參與早期同種異體移植排斥反應(yīng)［8-9］。盡管有許多實(shí)驗(yàn)方法可以檢測(cè)PRR，但很少有實(shí)驗(yàn)室的檢測(cè)數(shù)據(jù)能夠讓臨床醫(yī)生評(píng)估PRR相關(guān)的先天免疫狀態(tài)。因此，這是臨床實(shí)驗(yàn)室評(píng)估同種異體移植物先天性反應(yīng)的未解決的問題之一，先天性免疫監(jiān)測(cè)將越來越受到重視。

1.2 移植過程中激活的同種異體免疫細(xì)胞的鑒定：適應(yīng)性免疫是對(duì)移植物先天免疫應(yīng)答的延續(xù)，它特異地靶向同種異體移植物。同種異體移植物反應(yīng)性（同種異體反應(yīng)性）免疫細(xì)胞在適應(yīng)性免疫反應(yīng)中起主要作用，這在很大程度上決定了移植物是否被接受、被排斥或耐受（圖1）?；A(chǔ)和臨床研究人員正在研發(fā)實(shí)時(shí)跟蹤這些細(xì)胞的方法，以監(jiān)測(cè)同種異體反應(yīng)，這將使臨床醫(yī)生能夠?qū)σ浦步Y(jié)果進(jìn)行早期預(yù)測(cè)［10］。有多種技術(shù)可用于鑒定和定量供體特異性T細(xì)胞、B細(xì)胞和漿細(xì)胞，這些方法的簡(jiǎn)要概述如下：

用于測(cè)量適應(yīng)性免疫應(yīng)答的最古老和最廣泛使用的體外試驗(yàn)是1963年建立的混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)（mixed lymphocyte reaction，MLR）。來自供體的外周血單核細(xì)胞與來自受體的外周血單核細(xì)胞共培養(yǎng)，并監(jiān)測(cè)同種異體反應(yīng)性T細(xì)胞的活化和增殖以及產(chǎn)生細(xì)胞因子的情況［11］。這種臨床相關(guān)的功能測(cè)定經(jīng)過廣泛優(yōu)化和標(biāo)準(zhǔn)化，重復(fù)性符合臨床監(jiān)測(cè)標(biāo)準(zhǔn)。根據(jù)MLR監(jiān)測(cè)的讀數(shù)，我們還可以通過修改MLR的實(shí)驗(yàn)方法，并通過MLR的檢測(cè)讀數(shù)得出同種異體移植物排斥反應(yīng)的各種指標(biāo)。例如，溴脫氧尿苷可用于指示增殖細(xì)胞，并且可通過使用有限稀釋法依次測(cè)定經(jīng)過不同濃度稀釋的應(yīng)答細(xì)胞來檢測(cè)針對(duì)供體細(xì)胞的細(xì)胞毒性。與流式細(xì)胞術(shù)或酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)試驗(yàn)（ELISpot）結(jié)合使用，MLR使我們能夠精確量化刺激后產(chǎn)生細(xì)胞因子的細(xì)胞數(shù)量，并確定參與共刺激、抗原遞呈、細(xì)胞因子產(chǎn)生和趨化性等各種免疫活動(dòng)的細(xì)胞表面分子表達(dá)。細(xì)胞周期標(biāo)志物Ki67或細(xì)胞內(nèi)羧基熒光素琥珀酰亞胺酯，其強(qiáng)度在每次細(xì)胞分裂時(shí)減半，通過對(duì)其定量測(cè)量細(xì)胞增殖情況，而MLR主要測(cè)量的是T細(xì)胞增殖情況。來自人外周血的初始和記憶CD4+和CD8+T細(xì)胞均證明可用此方法檢測(cè)細(xì)胞增殖。根據(jù)實(shí)驗(yàn)方法和樣品類型不同［12-13］，1%～10%的T細(xì)胞群體具有同種異體反應(yīng)性。

圖1 涉及同種異體排斥的分子和細(xì)胞成分

需要注意的是，MLR結(jié)果表明存在同種異體識(shí)別的直接途徑，其中T細(xì)胞被同種異體抗原遞呈細(xì)胞激活。MLR數(shù)據(jù)與體內(nèi)情況存在差別，其中一個(gè)重要差別是：體內(nèi)T細(xì)胞是被源自自體細(xì)胞呈遞的供體蛋白分子肽激活。這種差異在免疫識(shí)別方面是至關(guān)重要的，因?yàn)楫?dāng)它們由自體細(xì)胞呈遞時(shí)，整個(gè)主要組織相容性復(fù)合物（major histocompatibility complex，MHC）分子在受到異體細(xì)胞和自體細(xì)胞遞呈的抗原肽激活時(shí)，功能是完全不同的，另外它們產(chǎn)生不同克隆的能力也有所不同。目前MLR主要用于制藥行業(yè)，尚未用于臨床評(píng)估。

為了給臨床提供細(xì)胞排斥反應(yīng)的證據(jù)，需要檢測(cè)出能夠識(shí)別供體MHC的T細(xì)胞的確切數(shù)量和含有的不同的T細(xì)胞克隆。鑒定同種異體反應(yīng)性克隆的方法包括新一代測(cè)序以及熒光激活細(xì)胞分選［14-15］。在離體培養(yǎng)中，將受體T細(xì)胞與供體細(xì)胞反應(yīng)，并使用羧基熒光素琥珀酰亞胺酯標(biāo)記對(duì)分裂細(xì)胞進(jìn)行分選。從該分裂群體以及未處理的受體T細(xì)胞中提取基因組DNA，并對(duì)T細(xì)胞β鏈CDR3區(qū)域進(jìn)行高通量測(cè)序。將數(shù)據(jù)組合以產(chǎn)生特異于T細(xì)胞的“指紋”，用于受體對(duì)供體細(xì)胞的反應(yīng)。利用這種技術(shù)，可以在移植后的外周循環(huán)中鑒定出由于同種異體反應(yīng)而產(chǎn)生的數(shù)千個(gè)克隆。幾個(gè)小組正通過使用這種方法研究它們的臨床相關(guān)反應(yīng)。

MHC分子的區(qū)段可以形成肽MHC多聚體，當(dāng)用熒光團(tuán)標(biāo)記時(shí)，這些寡聚體可以特異性結(jié)合靶MHC，使多克隆同種異體反應(yīng)細(xì)胞能夠追蹤到單一供體抗原。由于其具有高特異性和可重復(fù)性，肽MHC多聚體已成為測(cè)量小鼠中抗原特異性T細(xì)胞應(yīng)答的最廣泛的工具之一。

在此技術(shù)用于人類之前，仍有一些難題需要解決。肽MHC多聚體的設(shè)計(jì)需要選擇同種異體反應(yīng)細(xì)胞可識(shí)別的肽，而個(gè)別人群可能表達(dá)與研究用HLA等位基因不同的亞型，這一缺陷暫時(shí)限制了該方法的使用。使用肽多聚體進(jìn)行功能研究的另一個(gè)缺點(diǎn)是肽與細(xì)胞上受體結(jié)合的動(dòng)力學(xué)。這種結(jié)合可能改變T細(xì)胞增殖并表現(xiàn)出效應(yīng)功能。例如，T細(xì)胞在體內(nèi)結(jié)合天然加工的抗原的平均時(shí)間為7秒，但結(jié)合合成肽的平均時(shí)間長(zhǎng)達(dá)967秒。這種結(jié)合時(shí)間的延長(zhǎng)是否影響下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的方式尚未明確?？茖W(xué)家現(xiàn)已使用可逆形式的肽MHC，但如何應(yīng)用還有待進(jìn)一步的研究。

對(duì)于某些類型的淋巴細(xì)胞，細(xì)胞培養(yǎng)條件尚未完全優(yōu)化，因此，體內(nèi)刺激同種異體細(xì)胞的研究是鑒定同種異體反應(yīng)性T細(xì)胞的另一種方法?？珞w遲發(fā)型超敏反應(yīng)模型是目前使用的檢測(cè)方法，其使用患者樣本研究同種異體排斥反應(yīng)［16-17］。研究人員從受體中分離外周單核細(xì)胞并制備裂解的供體細(xì)胞。然后，他們將這些細(xì)胞的混合物注入嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺陷小鼠的足跖中。24小時(shí)后，注射同種異體反應(yīng)單核細(xì)胞的小鼠比單獨(dú)注射自身單核細(xì)胞的對(duì)照小鼠產(chǎn)生更大的腫脹和過敏反應(yīng)。該反應(yīng)表明患者通過間接途徑對(duì)供體抗原產(chǎn)生免疫記憶，因?yàn)榱呀馕锶狈ν暾墓w抗原遞呈細(xì)胞。盡管體內(nèi)試驗(yàn)比體外和離體模型更具優(yōu)勢(shì)，這些刺激是在幾個(gè)月到幾年內(nèi)從移植組織中獲取和加工的，通過這些方法進(jìn)行的刺激可能無(wú)法反映器官移植過程中供體抗原的真實(shí)情況。

基于肽MHC四聚體的檢測(cè)體系已用于檢測(cè)移植致敏后抗原特異性B細(xì)胞的擴(kuò)增和分化。在通過同種異體反應(yīng)抗原進(jìn)行初始刺激后，B細(xì)胞經(jīng)歷了亞型轉(zhuǎn)換過程，被激活并離體分化成抗體分泌細(xì)胞。IgG的亞型轉(zhuǎn)換可以通過IgG ELISpot方法或細(xì)胞上清中的IgG類別測(cè)定完成。最近，一些研究組使用包被有HLA分子的微球結(jié)合HLA特異性B細(xì)胞，形成HLA珠-B細(xì)胞結(jié)合物，并可通過流式細(xì)胞術(shù)鑒定。通過這種方法，可以快速確定HLA等位基因特異性B細(xì)胞的特性、頻率以及它們的表型，檢測(cè)時(shí)間與供體特異性抗體的常規(guī)檢測(cè)相同［18］。

B細(xì)胞的原代培養(yǎng)物（抗體產(chǎn)生者）比T細(xì)胞培養(yǎng)物更難進(jìn)行培養(yǎng)，而且暫時(shí)還未建立體外B細(xì)胞檢測(cè)體系?？朔鶥細(xì)胞培養(yǎng)困難的一種解決方案是使用飼養(yǎng)細(xì)胞與B細(xì)胞接觸，促進(jìn)B細(xì)胞增殖和分化。這種方法可以將記憶B細(xì)胞分化為長(zhǎng)壽漿細(xì)胞，它們產(chǎn)生的同種異體抗體是產(chǎn)生抗體介導(dǎo)排斥反應(yīng)的關(guān)鍵［16］。漿細(xì)胞是另一種難以追蹤的細(xì)胞類型，因?yàn)樗鼈儾槐磉_(dá)特異的標(biāo)記物，幾乎不表達(dá)CD19或B細(xì)胞受體。雖然漿細(xì)胞表達(dá)CD138，但由于其他細(xì)胞也會(huì)表達(dá)CD138，因此缺乏特異性。最近使用固定抗IgG和生物素化MHC單體的ELISpot試驗(yàn)來檢測(cè)分泌MHC特異性抗體的漿細(xì)胞。研究人員利用這種方法對(duì)漿細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，移植后漿細(xì)胞在脾臟的數(shù)量增加了104倍，在骨髓增加了103倍。這些組織駐留的長(zhǎng)壽漿細(xì)胞被認(rèn)為是血清學(xué)記憶的原因，并且是供體特異性抗體產(chǎn)生的主要來源。一旦鑒定出漿細(xì)胞，立即制定脫敏方案，該方案可以消除患者體內(nèi)產(chǎn)生排斥反應(yīng)抗體的細(xì)胞［16-18］。

2 同種異體抗體：特征和臨床相關(guān)性

在過去10年中，制藥工業(yè)已經(jīng)生產(chǎn)出有效的免疫抑制藥物，可以預(yù)防或治療T細(xì)胞介導(dǎo)的排斥反應(yīng)［19-20］。因此，已經(jīng)很好地控制了移植患者移植后數(shù)天或數(shù)月內(nèi)急性細(xì)胞免疫排斥反應(yīng)的發(fā)生。但大多數(shù)同種異體移植物的丟失是由于移植后幾個(gè)月開始發(fā)生的抗體介導(dǎo)的排斥反應(yīng)（antibody mediated rejection，AMR）造成的。大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室依靠如Luminex平臺(tái)的免疫測(cè)定，對(duì)患者的HLA抗體進(jìn)行檢測(cè)。在臨床實(shí)踐中，群體反應(yīng)性抗體（panel reactive antibody，PRA）在移植前和移植后均為常規(guī)檢測(cè)項(xiàng)目。計(jì)算的PRA（cPRA）是基于當(dāng)?shù)厝巳旱腜RA頻率的校正比率，用于指示當(dāng)?shù)毓w組織庫(kù)中，供體患者產(chǎn)生急性排斥反應(yīng)的可能性。此外，移植前PRA正在成為虛擬交叉配型的一部分。

2.1 AMR及其特征：AMR是一種通過多種機(jī)制發(fā)生的動(dòng)態(tài)過程。一般認(rèn)為急性排斥反應(yīng)依賴于補(bǔ)體系統(tǒng)，而慢性排斥反應(yīng)不依賴補(bǔ)體［21-22］。圖2顯示了AMR的基礎(chǔ)機(jī)制，主要由新生供體特異性抗體參與的AMR導(dǎo)致移植物失功。在最初的同種異體反應(yīng)中，HLA和非HLA抗原激活T細(xì)胞并將加工的抗原遞呈給最終產(chǎn)生抗體的B細(xì)胞，最終通過B細(xì)胞產(chǎn)生單克隆抗體。這些抗體在特異性、對(duì)補(bǔ)體蛋白的親和力、同亞型/亞類、平均熒光強(qiáng)度、密度和糖基化均具有差別［11，23］。當(dāng)新生供體特異性HLA抗體或非HLA抗體（如IgG1和IgG3）能夠固定補(bǔ)體蛋白時(shí)，它們傾向于激活補(bǔ)體復(fù)合物，并將補(bǔ)體通路的C3d或C4d片段沉積在微血管周圍。補(bǔ)體固定抗體在C1q結(jié)合試驗(yàn)中也具有陽(yáng)性反應(yīng)。然而，某些抗體的亞型，如IgG2和IgG4，缺乏補(bǔ)體固定能力，并不會(huì)在微血管上引起補(bǔ)體沉積［24-25］。在急性排斥反應(yīng)中，供體特異性抗體通過結(jié)合補(bǔ)體激活Fc受體，從而引起移植物損傷。在供體特異性抗體新生或長(zhǎng)期存在時(shí)，這些抗體會(huì)作用于內(nèi)皮表面，并通過偶聯(lián)和聚集同種異體HLA分子激活信號(hào)通路［26-27］。

圖2 抗體介導(dǎo)的排斥反應(yīng)和預(yù)后的機(jī)制

交叉配型是一種成熟的實(shí)驗(yàn)室方法，用于在微量滴定板上檢測(cè)與補(bǔ)體結(jié)合抗體裂解淋巴細(xì)胞的能力。然而，目前沒有類似的方法檢測(cè)微血管床中發(fā)生慢性排斥反應(yīng)的早期跡象。圖3顯示了移植物的病理學(xué)結(jié)果以及可在實(shí)驗(yàn)室中監(jiān)測(cè)的移植物失功指標(biāo)。這些指標(biāo)包括供體特異性抗體、C4d表達(dá)和移植物活檢組織異常，包括微血管炎癥及其慢性后遺癥、移植腎小球病和基底膜多層化。移植物功能延遲恢復(fù)的根源在于微血管炎癥，這會(huì)顯著影響患者的整體預(yù)后［28-30］。目前用于病理評(píng)估的方法是活組織檢查，但它昂貴且不切實(shí)際。但目前的血液檢測(cè)排斥反應(yīng)，如PRA可能會(huì)產(chǎn)生模棱兩可的結(jié)果。因此，必須開發(fā)一種能夠準(zhǔn)確和特異性的診斷移植患者排斥反應(yīng)發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的檢測(cè)手段。

圖3 移植物排斥的病理生理學(xué)和臨床診斷和預(yù)后的可檢測(cè)改變

2.2 抗體庫(kù)和移植結(jié)果之間的差異：盡管PRA是AMR中使用最廣泛的預(yù)測(cè)試驗(yàn)，但PRA所代表的致敏程度可變且不一致。受者的抗體狀態(tài)與受體移植環(huán)境不一定完全一致［31-32］，但其不可以用于精確選擇相容性供體或比較選擇不同供體時(shí)，患者的相對(duì)預(yù)致敏程度［33］。研究發(fā)現(xiàn)，這些抗體同生不同命［34-35］，而且它們的功能或臨床意義差異非常大。在分子水平上，致病性抗體與抗原表位結(jié)合，以此激活細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)途徑并導(dǎo)致一系列生物反應(yīng)。有害的同種異體抗體如果被補(bǔ)體激活，通過白細(xì)胞黏附、內(nèi)皮細(xì)胞激活和微血管增殖等反應(yīng)促進(jìn)病理改變，最終導(dǎo)致移植物損傷。如果一些抗體僅與非活化抗原表位結(jié)合，則它們可能不會(huì)損傷移植物。如今，越來越多的文章報(bào)道表位生物學(xué)研究以及抗體和抗原表位的相互作用如何影響實(shí)體器官移植［19，36-38］。隨著對(duì)同種異體抗體與HLA抗原表位結(jié)合的了解加深，有望揭示出臨床AMR的解決方案。

為了彌合抗體性質(zhì)和臨床結(jié)果之間的差異，我們簡(jiǎn)要回顧B細(xì)胞是如何產(chǎn)生抗體的。Kosmoliaptsis等［39］的研究詳細(xì)介紹了HLA分子的高分辨率分型、三維結(jié)構(gòu)與其同種抗體結(jié)合特征之間的關(guān)系。初始B細(xì)胞識(shí)別的任何特定三維結(jié)構(gòu)均可以引發(fā)單克隆B細(xì)胞系發(fā)育，產(chǎn)生針對(duì)該區(qū)域的特異性抗體。這些區(qū)域統(tǒng)稱為“表位”。由于HLA抗原分子巨大，受體的免疫細(xì)胞僅識(shí)別HLA分子的某個(gè)表位而不是與整個(gè)HLA分子反應(yīng)［40］。實(shí)際上沒有任何抗體可以識(shí)別整個(gè)HLA分子，抗體識(shí)別的僅特定的抗原表位。換言之，供受體一個(gè)HLA分子錯(cuò)配，可能產(chǎn)生多個(gè)針對(duì)不同錯(cuò)配表位的單克隆抗體。事實(shí)上，這些抗體譜決定了受體對(duì)同種異體移植物的耐受能力。迄今為止，已經(jīng)開發(fā)了幾種算法用來分析肽 - 表位的結(jié)合能力，以此預(yù)測(cè)AMR的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)?？茖W(xué)家在不久的將來就可以確定每個(gè)HLA分子上的所有表位，這將是獲得確切B細(xì)胞克隆特征的重大進(jìn)步［41］。

2.3 固相珠測(cè)定的缺點(diǎn)：20世紀(jì)90年代，基于Luminex的固相檢測(cè)技術(shù)通過引入熒光標(biāo)記微球成為最廣泛使用的HLA抗體檢測(cè)方法。該方法將一種或多種體外合成的人類HLA抗原固定在微球上。如果患者的血清含有HLA抗體，它將與相應(yīng)的微球結(jié)合，并通過Luminex檢測(cè)得出結(jié)果。微球不僅可以指示血清中存在的抗體的類型，而且還基于微球表面上抗體飽和度不同顯示的平均熒光強(qiáng)度的變化提示抗體數(shù)量。血液中循環(huán)的抗體越多，微球表面上抗原 - 抗體結(jié)合的飽和度則越高［42］。

該方法非常靈敏并具有特異性，但在臨床使用多年后逐漸發(fā)現(xiàn)大量患有慢性AMR的患者在診斷時(shí)沒有檢測(cè)到循環(huán)HLA抗體。最近的幾篇綜述文章描述了實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)報(bào)告與臨床結(jié)果之間存在相當(dāng)大差異的理論和現(xiàn)實(shí)原因。Filipone等［41］的研究顯示，固相珠測(cè)定僅檢測(cè)可以與制造商設(shè)計(jì)的固定化表位結(jié)合的同種異體反應(yīng)性抗體。如果反應(yīng)性抗體的結(jié)合區(qū)域不適用于微球上靶HLA的表位，則將產(chǎn)生陰性結(jié)果［42-43］。之前發(fā)現(xiàn)不良免疫反應(yīng)之前，均不能獲得各種抗體等位基因的信息。生產(chǎn)用于同種異體抗體檢測(cè)微球的制造商依賴的是抗原表位而不是整個(gè)HLA分子結(jié)構(gòu)的合成肽。不幸的是，很少有臨床系統(tǒng)研究結(jié)果可以評(píng)估這種技術(shù)對(duì)臨床結(jié)果的影響程度。此外，抗體與微球上抗原的結(jié)合沒有功能意義，因此這些測(cè)定的結(jié)果不能使我們斷定檢測(cè)到的抗體是否具有病理學(xué)后果。該測(cè)試只能表明患者的致敏狀態(tài)，但不能用于預(yù)測(cè)實(shí)際臨床結(jié)果。試劑盒也缺乏相關(guān)方面的單獨(dú)測(cè)試，實(shí)驗(yàn)室很難對(duì)靈敏度、熒光閾值設(shè)定、非天然HLA影響等制訂同一標(biāo)準(zhǔn)。這些問題均與該試劑盒的設(shè)計(jì)相關(guān)，以上問題仍有待解決，希望最終可達(dá)到直接檢測(cè)致病性同種異體反應(yīng)性抗體的水平。

由于上述原因，急需研發(fā)能區(qū)分致病性抗體和非致病性抗體的試劑盒。正如我們前面提到的，致病性抗體不僅通過結(jié)合抗原上的相應(yīng)表位而發(fā)揮其作用，而且還可以引發(fā)隨后的生物反應(yīng)。它們可以通過Fc介導(dǎo)或Fab介導(dǎo)的兩種不同途徑引起排斥反應(yīng)（圖2）。約20%腎功能穩(wěn)定且經(jīng)過活檢認(rèn)定沒有排斥反應(yīng)癥狀的患者對(duì)供體特異性抗體呈陽(yáng)性反應(yīng)。一半以上的預(yù)存供體特異性抗體患者沒有發(fā)生排斥反應(yīng)，且在活檢時(shí)未發(fā)現(xiàn)亞臨床AMR癥狀。然而，在含有低滴度供體特異性抗體的患者中卻可能發(fā)生排斥反應(yīng)，這表明供體特異性抗體水平與排斥反應(yīng)的發(fā)生率不完全相關(guān)。使用功能性抗體測(cè)試可以解決這些問題。這些檢測(cè)方法的開發(fā)將為通過Luminex系統(tǒng)評(píng)估器官排斥反應(yīng)的發(fā)生提供補(bǔ)充數(shù)據(jù)。

2.4 用于檢測(cè)AMR的新檢測(cè)方法：為了滿足功能檢測(cè)的需要，我們正在開發(fā)一種新型的細(xì)測(cè)定方法。我們?cè)O(shè)計(jì)了一個(gè)由人體細(xì)胞制成的模擬細(xì)胞系統(tǒng)，在體內(nèi)反映受體體液因子與移植血管之間錯(cuò)綜復(fù)雜的相互作用。實(shí)驗(yàn)室研究表明，將群體反應(yīng)性抗體與內(nèi)皮細(xì)胞一起孵育后，會(huì)導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞被激活并發(fā)生功能障礙［38，44-45］。進(jìn)一步的研究表明，HLA抗體和非HLA抗體可以充當(dāng)刺激劑引發(fā)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)。移植組織的炎癥反應(yīng)和細(xì)胞增殖是同種異體器官存活的最重要決定因素［11，19］。我們正在努力將實(shí)驗(yàn)室研究結(jié)果轉(zhuǎn)化為能夠定量檢測(cè)的技術(shù)。我們對(duì)檢測(cè)方法的研發(fā)基于活化的內(nèi)皮細(xì)胞釋放促炎細(xì)胞因子并在表面上表達(dá)高水平的黏附分子。這巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)的分子基礎(chǔ)，病理上定義為血管炎或微血管炎癥，是早期異體排斥反應(yīng)的代表。

供體特異性抗體的功能檢測(cè)影響器官移植的臨床決策。目前，活組織檢查是診斷AMR的唯一方法，暫時(shí)沒有其他檢測(cè)方法可以確診AMR。 AMR的當(dāng)前診斷依賴于基于細(xì)胞和/或結(jié)構(gòu)改變的Banff分類，然而，這些分類被認(rèn)為是“假定的”，而不是決定性的。此外，沒有明確的方法來診斷亞臨床AMR［33，46］。我們提出的檢測(cè)方法可能潛在地反映了受體體液免疫應(yīng)答與移植血管床之間相互作用的狀態(tài)，并以更高的準(zhǔn)確性和精確度掌握移植物的健康狀況。該方法不僅可以檢測(cè)內(nèi)皮細(xì)胞活化的發(fā)生，還可以量化受體血清和供體細(xì)胞之間相互作用的程度，這可能是器官排斥反應(yīng)的最早跡象［21-22］。因此，該檢測(cè)的研究成果可為臨床醫(yī)生在不經(jīng)過活檢的情況下監(jiān)測(cè)移植物的健康情況和檢測(cè)移植排斥反應(yīng)的發(fā)生提供幫助。