當(dāng)歸與糖皮質(zhì)激素治療哮喘對HMGB1表達(dá)及陰虛癥狀的影響①

程小麗 段海婧 王志旺 付曉艷 姚 楠 劉雪楓 王瑞瓊

(甘肅中醫(yī)藥大學(xué),蘭州730000)

《神農(nóng)本草經(jīng)》謂當(dāng)歸“主咳逆上氣”，《本草蒙筌》言其“血藥補(bǔ)陰”、對陰虛“咳逆上氣”有“補(bǔ)血養(yǎng)陰、和血降氣”之功，如臨床上當(dāng)歸配伍用于治療陰虛證支氣管哮喘[1]。另一方面，糖皮質(zhì)激素是目前治療哮喘、特別是重癥哮喘的常用藥，但用藥早期可引起陰虛癥狀[2]。本實(shí)驗(yàn)擬將當(dāng)歸與氫化可的松合用治療哮喘小鼠模型，通過考察平喘指標(biāo)與陰虛指標(biāo)，探討當(dāng)歸與糖皮質(zhì)激素在治療哮喘中的增效(平喘)減副(陰虛)作用；同時(shí)，從高遷移率族蛋白B1(HMGB1)的角度探討當(dāng)歸與糖皮質(zhì)激素平喘的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1藥品與試劑 當(dāng)歸(RASI)，采于甘肅省岷縣，經(jīng)楊扶德教授鑒定為Radix Angelicae Sinensis的干燥根，加工成飲片后用水煎煮，取濾液適當(dāng)濃縮后冷藏備用；注射用氫化可的松琥珀酸鈉(Hydrocortisone sodium succinate,HSS)天津生物化學(xué)制藥有限公司生產(chǎn)，國藥準(zhǔn)字H12020493，批號：011606014；卵蛋白(OVA)，批號：SLBQ8172V、Sigma公司生產(chǎn)；氫氧化鋁，批號：20161003,天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn)；TNF-α、IL-1β及IL-6試劑盒，批號：20170404、20170501、20170403南京建成生物工程研究所生產(chǎn)，HMGB1 Polyclonal antibody，批號：B0201,美國Immuno Way公司生產(chǎn)。

1.1.2儀器 CH Technologies的鼻部暴露/全身暴露吸入染毒系統(tǒng)；江蘇魚躍醫(yī)療設(shè)備股份有限公司的402AI型超聲霧化器；北京廣源達(dá)科技發(fā)展有限公司的EMKA型動(dòng)物肺功能檢測系統(tǒng)；成都泰盟科技有限公司的ZZ-6型小鼠自主活動(dòng)測試儀。

1.1.3動(dòng)物 SPF級BALB/c小鼠，雌雄各半，體重16～19 g，由甘肅中醫(yī)藥大學(xué)科研實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供并進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，許可證號：SCXK(甘)2011-0001。

1.2方法

1.2.1分組、造模并給藥 將小鼠隨機(jī)分為6組，即空白對照組(Blank control)、陰虛模型組(Yin deficiency,采用0.05 g/kg氫化可的松造模)、哮喘模型組(Asthma)、氫化可的松組(HSS,采用0.05 g/kg氫化可的松治療)、當(dāng)歸組(RASI,8 g/kg當(dāng)歸)、合用組(RASI+HSS,8 g/kg當(dāng)歸與0.05 g/kg氫化可的松合用)，每組12只。根據(jù)文獻(xiàn)[3]復(fù)制哮喘模型，實(shí)驗(yàn)第1、8天每只小鼠腹腔注射OVA致敏液0.2 ml(內(nèi)含100 μg OVA和2 mg氫氧化鋁的生理鹽水混懸液)，同時(shí)背部皮下注射等量致敏液，空白對照組與陰虛模型組以生理鹽水代替致敏。第15天開始激發(fā)，讓小鼠吸入1% OVA激發(fā)液20 min，1次/d，連續(xù)7 d，空白對照組與陰虛模型組以生理鹽水代替。從激發(fā)開始在激發(fā)前1 h灌胃下述藥物：當(dāng)歸組與合用組小鼠每天給予上述劑量當(dāng)歸，陰虛模型組、氫化可的松組及合用組從激發(fā)第3天開始每天給予上述劑量氫化可的松。

1.2.2一般情況 實(shí)驗(yàn)過程中檢測動(dòng)物體重，第20天測定小鼠24 h內(nèi)的進(jìn)食與飲水量；實(shí)驗(yàn)第21天晚上8點(diǎn)測定小鼠自主活動(dòng)，開啟自主活動(dòng)儀，將小鼠放入并適應(yīng)3 min后，測定5 min的活動(dòng)次數(shù)與站立(抬頭)次數(shù)。

1.2.3哮喘行為學(xué) 實(shí)驗(yàn)第20天，按上述激發(fā)方法讓小鼠吸入2%OVA激發(fā)液120 s，觀察10 min內(nèi)小鼠抓鼻次數(shù)、撓癢次數(shù)、哮喘發(fā)作及其癥狀，對哮喘行為學(xué)進(jìn)行半定量分析[4]。

1.2.4肺功能 實(shí)驗(yàn)第22天測定肺功能，調(diào)試肺功能儀，將小鼠放入封閉系統(tǒng)中，啟動(dòng)系統(tǒng)，等小鼠安靜后記錄呼吸頻率、潮氣量等肺功能指標(biāo)。

1.2.5采集標(biāo)本、測定指標(biāo) 實(shí)驗(yàn)第22天，小鼠經(jīng)戊巴比妥麻醉后處死，手術(shù)暴露氣管，結(jié)扎左支氣管，提取支氣管肺泡灌洗液(BALF)，離心后取其上清液按試劑盒說明書測定TNF-α、IL-1β和IL-6的含量。摘取肺臟，取左肺組織，分別進(jìn)行HE染色與免疫組化染色，觀測肺組織炎性細(xì)胞浸潤程度[5]與HMGB1表達(dá)水平并進(jìn)行半定量分析。

2 結(jié)果

2.1當(dāng)歸與氫化可的松及其合用對哮喘小鼠進(jìn)食及飲水量的影響 實(shí)驗(yàn)第20天時(shí)，陰虛模型組、氫化可的松組小鼠的進(jìn)食量與飲水量明顯增加，與空白對照組、哮喘模型組比較分別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；合用組小鼠的進(jìn)食量與飲水量下降，與氫化可的松組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

2.2當(dāng)歸與氫化可的松及其合用對哮喘小鼠體重的影響 致敏和激發(fā)前，各組小鼠體重沒有差異，實(shí)驗(yàn)第22天陰虛模型組、氫化可的松組小鼠的體重明顯下降，分別與空白對照組、哮喘模型組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；在當(dāng)歸的干預(yù)下，合用組小鼠的體重明顯增加，與氫化可的松組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表2。

GroupsDose(g/kg)Foodintake(g/d)Waterintake(ml/d)Blank control-3.32±1.365.79±0.85Yin deficiency-5.37±1.591)7.80±1.101)Asthma-3.38±1.375.87±0.84HSS0.055.32±1.602)7.88±1.112)RASI83.50±1.205.51±0.86HSS+RASI0.05+83.82±1.333)6.59±1.053)

Note：RASI.Radix Angelicae Sinensis;HSS.Hydrocortisone sodium succinate;vs blank control,1)P<0.01;vs asthma,2)P<0.01;vs HSS,3)P<0.05.

2.3當(dāng)歸與氫化可的松及其合用對哮喘小鼠自主活動(dòng)的影響 陰虛模型組、氫化可的松組小鼠的站立(抬頭)次數(shù)、活動(dòng)次數(shù)明顯增加，分別與空白對照組、哮喘模型組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,0.01)；合用組小鼠的站立次數(shù)與活動(dòng)次數(shù)明顯減少，與氫化可的松組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見表3。

2.4當(dāng)歸與氫化可的松及其合用對小鼠哮喘行為學(xué)的影響 在OVA激發(fā)下，哮喘模型組哮喘發(fā)作的小鼠增多，哮喘行為學(xué)評分增加，與空白對照組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；在當(dāng)歸、氫化可的松及其合用的干預(yù)下，小鼠上述哮喘指標(biāo)得到明顯緩解，與哮喘模型組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,0.01)。合用組的作用有進(jìn)一步增強(qiáng)的趨勢，但與當(dāng)歸組、氫化可的松組比較沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表4。

2.5當(dāng)歸與氫化可的松及其合用對哮喘小鼠肺功能的影響 哮喘模型組小鼠呼吸頻率(Frequence,F)顯著增加，潮氣量(TV)顯著下降，與空白對照組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。在當(dāng)歸、氫化可的松及其合用的干預(yù)下，F(xiàn)明顯下降，TV明顯增加，與哮喘模型組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；合用組TV增加更明顯，與當(dāng)歸組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,0.01)，見表5。

GroupsDose(g/kg)Body weight(g)First dayFourteenth dayTwenty-second dayBlank control-25.7±2.130.3±4.232.4±3.8Yin deficiency-25.3±1.730.3±3.228.1±2.21)Asthma-25.4±2.531.1±3.332.2±3.0HSS0.0525.2±1.529.2±3.228.4±2.42)RASI825.1±1.829.6±3.931.4±3.7HSS+RASI0.05+825.1±2.330.5±3.730.3±2.83)

Note：RASI.Radix Angelicae Sinensis;HSS.Hydrocortisone sodium succinate.Vs blank control,1)P<0.01;vs asthma,2)P<0.01;vs HSS,3)P<0.05.

GroupsDose(g/kg)Standing timesper 5 minActivity timesper 5 minBlank control-36.3±14.13.3±1.9Yin deficiency-67.8±19.61)7.2±2.41)Asthma-49.1±18.14.8±2.0HSS0.0569.0±17.22)6.8±2.32)RASI847.3±19.24.5±1.5HSS+RASI0.05+845.8±15.33)4.2±1.93)

Note：RASI.Radix Angelicae Sinensis;HSS.Hydrocortisone sodium succinate.Vs blank control,1)P<0.01;vs asthma,2)P<0.05;vs HSS,3)P<0.01.

2.6當(dāng)歸與氫化可的松及其合用對哮喘小鼠肺組織病理學(xué)的影響 空白對照組小鼠肺組織鏡下病理變化不明顯(圖1A)；哮喘模型組小鼠肺組織出現(xiàn)明顯的病理變化，支氣管壁充血、結(jié)構(gòu)紊亂，上皮細(xì)胞腫脹，基底膜增厚、邊緣模糊(圖1C)。在氫化可的松、當(dāng)歸及其合用干預(yù)下，上述肺組織病理變化得到一定的緩解(圖1D～F)。對支氣管壁及其周圍組織炎性細(xì)胞浸潤程度進(jìn)行半定量分析，結(jié)果顯示，氫化可的松組、 當(dāng)歸組及合用組支氣管炎性細(xì)胞浸潤程度出現(xiàn)緩解，與哮喘模型組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05、0.01)，見圖1、表6。

GroupsDose(g/kg)nAsthmaattackAsthmaticbehaviors scoreBlank control-1213.58±1.51Yin deficiency-1203.50±1.88Asthma-12101)7.50±2.471)HSS0.051212)3.17±1.192)RASI81233)3.67±2.062)HSS+RASI0.05+81202)2.25±1.602)

Note：RASI.Radix Angelicae Sinensis;HSS.Hydrocortisone sodium succinate.Vs blank control,1)P<0.01;vs asthma,2)P<0.01,3)P<0.05.

GroupsDose(g/kg)F(bpm)TV(ml)Blank control-122.9±13.90.117±0.018Yin deficiency-127.3±14.60.115±0.016Asthma-173.4±25.41)0.084±0.0111)HSS0.05140.6±19.32)0.105±0.0152)RASI8152.5±22.23)0.096±0.0133) 4)HSS+RASI0.05+8137.2±16.32)0.112±0.0162)

Note：RASI.Radix Angelicae Sinensis;HSS.Hydrocortisone sodium succinate.Vs blank control,1)P<0.01;vs asthma,2)P<0.01;3)P<0.05；vs HSS+RASI,4)P<0.05.

2.7當(dāng)歸與氫化可的松及其合用對哮喘小鼠BALF中細(xì)胞因子的影響 哮喘模型組小鼠BALF中TNF-α、IL-1β和IL-6顯著升高，與空白對照組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。經(jīng)當(dāng)歸、氫化可的松及其合用干預(yù)后，TNF-α、IL-1β和IL-6明顯下降，與哮喘模型組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；合用組比當(dāng)歸組、氫化可的松組降幅更大，部分指標(biāo)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05、0.01)，見表7。

2.8當(dāng)歸與氫化可的松及其合用對哮喘小鼠肺組織HMGB1表達(dá)的影響 如圖2所示，HMGB1主要表達(dá)于氣道上皮細(xì)胞和炎癥細(xì)胞的細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)中，呈棕黃色。空白對照組小鼠HMGB1呈弱陽性表達(dá)，而在哮喘模型組中表達(dá)明顯增強(qiáng)；在當(dāng)歸、氫化可的松及其合用的干預(yù)下，HMGB1的表達(dá)有一定的減弱趨勢。對HMGB1表達(dá)進(jìn)行半定量分析，結(jié)果顯示，哮喘模型組HMGB1表達(dá)的平均光密度值明顯升高，與空白對照組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)； 在當(dāng)歸、氫化可的松及其合用的干預(yù)下，HMGB1表達(dá)的平均光密度值下降，其中合用組與哮喘模型組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖2、表8。

圖1 當(dāng)歸與氫化可的松及其合用對哮喘小鼠肺組織病理學(xué)的影響(HE染色,×10)Fig.1 Effects of RASI,HSS and their combination on lung histopathology in asthmatic mice(HE stain-ing,×10)Note: A.Blank control group;B.Yin deficiency model group;C.Asthma model group;D.HSS group;E.RASI group;F.RASI and HSS group.

GroupsDose(g/kg)nInf.cell infiltration in bronchus-(0)+(1)++(2)+++(3)Mean seriesValue of R(95% Confidence interval)Blank control-1284000.330.19±0.17Yin deficiency-1293000.250.12±0.17Asthma-1200572.580.80±0.171)HSS0.051206601.500.47±0.172)RASI81205611.670.52±0.172)HSS+RASI0.05+81207501.420.44±0.173)

Note：RASI.Radix Angelicae Sinensis;HSS.Hydrocortisone sodium succinate.Vs blank control,1)P<0.01;vs asthma,2)P<0.05,3)P<0.01.

GroupsDose(g/kg)TNF-α(pg/ml)IL-1β(pg/ml)IL-6(pg/ml)Blank control-231.93±34.94205.73±28.82144.43±29.11Yin deficiency237.85±36.42211.48±27.71149.20±31.58Asthma-349.74±49.551)439.28±45.481)392.37±46.351)HSS0.05276.31±40.812)288.69±34.442)250.51±36.262)3)RASI8291.79±41.102)3)358.06±37.482)4)304.83±39.862)4)HSS+RASI0.05+8258.21±36.642)261.68±30.992)211.23±34.272)

Note：RASI.Radix Angelicae Sinensis;HSS.Hydrocortisone sodium succinate.Vs blank control,1)P<0.01;vs asthma,2)P<0.01;vs HSS+RASI,3)P<0.05,4)P<0.01.

圖2 當(dāng)歸與氫化可的松及其合用對哮喘小鼠肺組織HMGB1表達(dá)的影響(×40)Fig.2 Effects of RASI,HSS and their combination on expression of HMGB1 in asthmatic mice(×40)Note: A.Blank control group;B.Yin deficiency model group;C.Asthma model group;D.HSS group;E.RASI group;F.RASI and HSS group.

GroupsDose(g/kg)nHMGB1Blank control-120.212±0.009Yin deficiency-120.210±0.007Asthma-120.256±0.0161)HSS0.05120.245±0.013RASI8120.249±0.014HSS+RASI0.05+8120.241±0.0132)

Note：RASI.Radix Angelicae Sinensis;HSS.Hydrocortisone sodium succinate.Vs blank control,1)P<0.01;vs asthma,2)P<0.05.

3 討論

當(dāng)歸是臨床常用中藥，素有“十方九歸”之說，《神農(nóng)本草經(jīng)》開篇就說當(dāng)歸“主咳逆上氣”，即當(dāng)歸可用于治療支氣管哮喘等呼吸系統(tǒng)疾病，臨床上當(dāng)歸與其他中藥配伍成復(fù)方，如《和劑局方》中的蘇子降氣湯、《慎齋醫(yī)書》中的百合固金湯和《醫(yī)學(xué)入門》中的加味益母丸，發(fā)揮補(bǔ)血養(yǎng)陰潤肺、活血通脈降氣等功效。藥理學(xué)研究顯示，當(dāng)歸揮發(fā)油對氣管平滑肌有顯著的解痙作用[6]，在體研究顯示當(dāng)歸對哮喘動(dòng)物模型有明顯的平喘作用[7]。糖皮質(zhì)激素是目前治療急性和重癥哮喘的常用藥，其抗炎等作用可明顯緩解哮喘的臨床癥狀。本次實(shí)驗(yàn)采用大劑量氫化可的松(0.05 g/kg)來復(fù)制陰虛動(dòng)物模型，同時(shí)采用該劑量來治療哮喘，對比觀察當(dāng)歸、氫化可的松及其合用對哮喘的治療作用，結(jié)果顯示，當(dāng)歸、激素及其合用能明顯降低哮喘行為學(xué)評分，減少哮喘發(fā)作動(dòng)物數(shù)；降低呼吸頻率，增加潮氣量，改善肺功能。病理學(xué)顯示，當(dāng)歸、激素及其合用能明顯緩解哮喘小鼠肺組織病理變化，降低炎性細(xì)胞對氣道的浸潤程度，當(dāng)歸與激素合用后上述作用有進(jìn)一步增強(qiáng)的趨勢。

高遷移率族蛋白B1(High-mobility group box 1,HMGB1)是一種非常保守的非組蛋白核蛋白，廣泛分布于機(jī)體多種組織的細(xì)胞核中，核內(nèi)的HMGB1主要調(diào)控DNA的復(fù)制及RNA的轉(zhuǎn)錄。在TNF-α、IL-1及IL-6等細(xì)胞因子的刺激下，釋放至胞外的HMGB1與炎癥細(xì)胞或直接與上述細(xì)胞因子相互作用而促進(jìn)炎癥反應(yīng)，參與哮喘等多種炎癥性疾病的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)歸[8]。TNF-α是一種促炎細(xì)胞因子，介導(dǎo)炎性細(xì)胞聚集，刺激其釋放大量IL-6等炎性因子，參與哮喘氣道的炎癥反應(yīng)及其重塑[9]。IL-6是一種小分子量活性多肽，在炎癥反應(yīng)中參與急性期反應(yīng)蛋白的合成，活化T細(xì)胞以及終末分化B細(xì)胞，是氣道炎癥反應(yīng)過程中的重要因子[10]。IL-1主要由巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，其中IL-1β又名淋巴細(xì)胞活化因子，可促進(jìn)嗜酸性粒細(xì)胞黏附于血管內(nèi)皮細(xì)胞并浸潤至氣道黏膜，加速其脫顆粒而誘發(fā)哮喘[11]。本次實(shí)驗(yàn)顯示，當(dāng)歸、氫化可的松及其合用能明顯降低BALF中TNF-α、IL-1β及IL-6水平，當(dāng)歸與激素合用后的上述作用更強(qiáng)，同時(shí)對HMGB1的表達(dá)也產(chǎn)生一定的抑制作用。

激素在治療哮喘的過程中，患者常出現(xiàn)喘息痰黃、腰膝酸軟、五心煩熱等陰虛癥狀[2]。實(shí)驗(yàn)顯示，大劑量糖皮質(zhì)激素可引起動(dòng)物進(jìn)食及飲水量增加、煩躁易動(dòng)、尿黃便干等陰虛癥狀，現(xiàn)已成為復(fù)制陰虛動(dòng)物模型的常用方法之一[12]。當(dāng)歸質(zhì)地柔潤，補(bǔ)血而使陰液充足，故有“血藥補(bǔ)陰”之說，臨床上配伍當(dāng)歸經(jīng)常用于治療陰虛型哮喘。本次實(shí)驗(yàn)顯示，當(dāng)歸可緩解激素引起的進(jìn)食量與飲水量增加、體重下降、自主活動(dòng)增多等陰虛癥狀。

綜上所述，當(dāng)歸、糖皮質(zhì)激素及其合用對支氣管哮喘有明顯的治療作用，而抑制HMGB1通路是其協(xié)同增效的機(jī)制之一；同時(shí)合用當(dāng)歸可明顯緩解激素引起的陰虛癥狀。