大葉秦艽花環(huán)烯醚萜類成分對膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎小鼠的治療作用及相關(guān)機(jī)制探討①

賈 娜 崔 佳 趙 超 李銳莉 文愛東

(空軍軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院藥劑科，西安710032)

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(Rheumatoid arthritis，RA)是一種以關(guān)節(jié)滑膜炎為特征性改變的慢性自身免疫疾病，引起關(guān)節(jié)內(nèi)骨、軟骨、甚至關(guān)節(jié)內(nèi)韌帶和肌腱的細(xì)胞外基質(zhì)進(jìn)行性和不可逆性破壞，導(dǎo)致關(guān)節(jié)畸形、強(qiáng)直和功能喪失，甚至殘廢[1]?；|(zhì)金屬蛋白酶(Matrix metalloproteinase,MMPs)是細(xì)胞外基質(zhì)(Extracellular matrix,ECM)降解及重構(gòu)的重要介質(zhì)，能夠?qū)е萝浌恰㈨g帶及骨破壞[2]。秦艽始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，可祛風(fēng)濕，舒經(jīng)絡(luò)，清虛熱，利濕退黃，用于風(fēng)濕疾病治療己有近兩千年歷史。環(huán)烯醚萜(Iridoids)是從龍膽科植物大葉秦艽的花中提取得到的單萜化合物，具有多種藥理作用，是秦艽的特征性成分和主要活性成分[3]。課題組之前的研表明，大葉秦艽花具有顯著的抗炎鎮(zhèn)痛活性[4]。本實(shí)驗(yàn)在前期研究的基礎(chǔ)上，擬采用CIA小鼠模型進(jìn)一步考察大葉秦艽花環(huán)烯醚萜類成分(GMI)是否具有抗類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎活性，并探討其可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料、試劑 動(dòng)物：健康清潔級雄性C57BL/6J小鼠，10～14周齡，第四軍醫(yī)大學(xué)試驗(yàn)動(dòng)物中心提供。分籠飼養(yǎng)，室溫20～25℃，濕度40%～60%，自由攝食飲水。本研究所涉及的動(dòng)物相關(guān)操作均在西京醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)下進(jìn)行(批準(zhǔn)號(hào)：XJYYLL-2014302)。

藥物與試劑：大葉秦艽花于2013年采自陜西隴縣，經(jīng)西北大學(xué)胡正海教授鑒定為大葉秦艽(Gentiana macrophylla Pall.)的花，樣品存放于西北大學(xué)陜西省生物醫(yī)藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；環(huán)烯醚萜類化合物(GMI)由空軍軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院藥劑科新藥研發(fā)中心制備，純度65.2%；地塞米松片購自浙江仙琚制藥股份有限公司；雞Ⅱ型膠原購自美國Sigma公司；弗氏完全佐劑和弗氏不完全佐劑購自美國Chondrex公司；MMP1和MMP3多克隆抗體購自美國Proteintech公司；勻漿器為德國IKA公司產(chǎn)品。

1.2方法

1.2.1CIA模型的建立 雞CⅡ溶解于0.1 mol/L冰醋酸中，濃度為4 mg/ml，放置于4℃過夜。將溶解的膠原與弗氏完全佐劑等體積混合，冰浴中使用勻漿器充分乳化。免疫動(dòng)物時(shí)，在小鼠尾根部多點(diǎn)皮內(nèi)注射0.1 ml乳劑?；A(chǔ)免疫后第14天，以同樣的方法等體積混合膠原與弗氏不完全佐劑，避開初次免疫部位，進(jìn)行加強(qiáng)免疫。同時(shí)，對照組等體積注射生理鹽水[5]。

從加強(qiáng)免疫后(實(shí)驗(yàn)第14天)開始觀察并記錄關(guān)節(jié)炎指數(shù)(AI)，1次/7 d。采用5級評分法：無紅腫為0分；小趾關(guān)節(jié)紅腫為1分；趾關(guān)節(jié)和足跖腫脹為2分；踝關(guān)節(jié)以下足爪腫脹為3分；含踝關(guān)節(jié)在內(nèi)的全部足爪腫脹為4分。計(jì)算繼發(fā)側(cè)足爪評分之和，即為每只大鼠的AI。評分2分以上為成功模型。

1.2.2分組 將實(shí)驗(yàn)小鼠隨機(jī)分為5組，每組10只，分別為正常組、CIA模型組、地塞米松(DEX)組(0.25 mg/kg)、GMI組(30 mg/kg)和GMI組(15 mg/kg)。各組動(dòng)物灌胃給藥，1次/d，連續(xù)28 d，末次給藥1 h后進(jìn)行手術(shù)。正常組和CIA組每次注射等量生理鹽水，其余實(shí)驗(yàn)步驟與GMI給藥組相同。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，小鼠腹腔注射戊巴比妥鈉處死(65 mg/kg)。

1.2.3滑膜組織病理學(xué)檢測 采用蘇木素-伊紅(HE)染色法進(jìn)行檢測。取各組小鼠右后踝關(guān)節(jié)，4%多聚甲醛固定，10%EDTA 脫鈣，常規(guī)脫水，石蠟包埋，切片，HE 常規(guī)染色，光鏡下觀察踝關(guān)節(jié)滑膜組織形態(tài)學(xué)病理改變。

1.2.4ELISA測定血清中TNF-α、IL-1β和IL-6的水平 采用ELISA法進(jìn)行測定。腹主動(dòng)脈取血，3 000 r/min離心15 min，取上清，備用，按照ELISA試劑盒操作說明測定TNF-α、IL-1β和IL-6的含量。反應(yīng)終止后5 min內(nèi)用酶標(biāo)儀在450 nm波長測光密度(OD值)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算濃度。

1.2.5蛋白質(zhì)免疫印跡(Western blot)滑膜組織中MMP1和MMP3的含量 采用Western blot法進(jìn)行測定。將取好的踝關(guān)節(jié)滑膜組織置于勻漿器，冰上研磨提取組織總蛋白，BCA法測定蛋白濃度；SDS-PAGE電泳，5%的濃縮膠80 V，30 min，15%的分離膠120 V，45 min；150 A轉(zhuǎn)膜2 h；脫脂奶粉封閉 2 h；加入一抗(MMP1、MMP3和β-actin，1∶1 000)過夜放置于4℃過夜；用TBST溶液洗膜15 min，3次；二抗(1∶1 200)于室溫孵育2 h；TBST溶液洗膜15 min，3次；加入顯影液配制1 ml(1∶1)，放入化學(xué)發(fā)光儀檢測；采用Quantity One 軟件對顯影出的條帶進(jìn)行分析，計(jì)算分析MMP1、MMP3和β-actin 條帶的灰度比值。

2 結(jié)果

2.1GMI對AI值的影響 與CIA模型比較，給予地塞米松能抑制AI值的增加，GMI組(30 mg/kg)和GMI組(15 mg/kg)均可顯著降低AI值，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖1。

2.2GMI對小鼠踝關(guān)節(jié)滑膜組織病理學(xué)的影響 在光學(xué)顯微鏡下觀察，正常組的踝關(guān)節(jié)滑膜組織排列整齊，未見充血、水腫、炎細(xì)胞浸潤等的炎性現(xiàn)象，滑膜細(xì)胞增生及血管翳形成不可見；與正常組比較，CIA模型組滑膜組織細(xì)胞排列密集且凌亂，滑膜組織細(xì)胞數(shù)量較多，出現(xiàn)充血及大量炎性細(xì)胞，可觀察到淋巴細(xì)胞；與模型組比較，地塞米松組及GMI(30 mg/kg)組滑膜組織充血及炎細(xì)胞數(shù)量明顯減少，GMI(15 mg/kg)組滑膜組織病理變化不明顯。見圖2。

圖1 GMI對AI值的作用Fig.1 Effects of GMI on arthritis scoresNote: Compared with CIA group，*.P<0.05.

圖2 GMI對小鼠踝關(guān)節(jié)滑膜組織病理變化的影響(HE，×40)Fig.2 Effects of GMI on histopathological changes in joints of CIA mice(HE，×40)Note: A.Normal group；B and C.CIA group；D.Dex group；E.GMI(30 mg/kg)group；F.GMI(15 mg/kg)group.

圖3 GMI對小鼠血清中TNF-α(A)、IL-1β(B)和IL-6(C)含量的影響Fig.3 Effects of GMI on TNF-α(A),IL-1β(B)和IL-6(C)Note: Compared with normal group,#.P<0.05；compared with CIA group，*.P<0.05.

2.3GMI對小鼠血清中TNF-α、IL-1β和IL-6含量的影響 與正常組比較，模型組小鼠血清TNF-α、IL-1β和IL-6含量顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)； 與模型組比較， 地塞米松組、GMI組(30 mg/kg)和GMI組(15 mg/kg)能夠顯著抑制血清TNF-α，IL-1β和IL-6的含量，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖3A～C。

2.4GMI對滑膜組織中MMP1和MMP3含量的影響 與正常組相比， CIA模型組小鼠滑膜組織中MMP1和MMP3的蛋白表達(dá)明顯增高；而地塞米松組、GMI組(30 mg/kg)和GMI組(15 mg/kg)蛋白水平較CIA組顯著降低(P<0.05)。提示GMI能夠抑制CIA小鼠滑膜組織中MMP1和MMP3表達(dá)的增高。見圖4。

3 討論

RA最終表現(xiàn)為不可逆的關(guān)節(jié)侵蝕和軟骨破壞。成纖維樣滑膜細(xì)胞緊鄰滑膜下層，靠近軟骨，在類風(fēng)濕滑膜炎癥、血管翳形成和滑膜增生等RA關(guān)鍵病理環(huán)節(jié)中占據(jù)主導(dǎo)地位[6]。MMPs是細(xì)胞外基質(zhì)降解及重構(gòu)的重要介質(zhì)。在RA血管翳與軟骨交界處及關(guān)節(jié)其他部位均發(fā)現(xiàn)多種MMPs的過量表達(dá)。MMPs能夠引起胞外基質(zhì)的降解以及最終導(dǎo)致軟骨、韌帶及骨破壞。MMPs對RA關(guān)節(jié)的破壞作用至少包括兩條途徑：首先為直接降解軟骨和骨質(zhì)；其次，MMPs在血管再生方面具有重要的作用，而血管翳是RA的突出特征，血管生成時(shí)，微血管基底膜和間質(zhì)成分被降解。MMPs在RA關(guān)節(jié)損傷過程中起著重要作用，可作為反映病情活動(dòng)指標(biāo)和監(jiān)測軟骨破壞程度指標(biāo)。已有臨床研究表明，抑制RA患者M(jìn)MP-2、3、9的表達(dá)，可以有效保護(hù)RA患者的骨關(guān)節(jié)破壞[7]。因此MMPs是RA治療的重要靶點(diǎn)。關(guān)節(jié)的滑膜組織增生、纖維素滲出、成纖維細(xì)胞和炎細(xì)胞浸潤、血管翳形成，以及骨和軟骨進(jìn)行性不可逆的破壞，都與細(xì)胞因子失調(diào)有關(guān)。TNF-α可促進(jìn)滑膜細(xì)胞產(chǎn)生主要致炎細(xì)胞因子IL-1、IL-6等[8]。

RA發(fā)病以青壯年為多，致殘率高達(dá)60%～70%，嚴(yán)重威脅人類的生命健康?，F(xiàn)行臨床上針對RA的治療策略主要有：一是在起始期使用非甾體類抗炎藥物進(jìn)行保守控制，但這并不能阻止RA病變的自然過程；二是當(dāng)明顯的侵蝕狀態(tài)顯現(xiàn)出來時(shí)使用抗風(fēng)濕藥物，例如金制劑、青霉胺、免疫抑制劑(氨甲蝶呤)等，但會(huì)出現(xiàn)血小板減少、尿蛋白、過敏性皮疹等副作用；三是激素療法，首選的腎上腺皮質(zhì)激素對關(guān)節(jié)腫痛作用迅速，但效果不持久，并且長期應(yīng)用可導(dǎo)致物質(zhì)代謝和水鹽代謝紊亂，骨質(zhì)疏松等嚴(yán)重不良反應(yīng)。另外目前一些針對免疫細(xì)胞和細(xì)胞因子的生物制劑日漸用于RA的治療，但對于RA后期患者仍療效欠佳，并且半衰期短，還可導(dǎo)致嚴(yán)重心血管不良反應(yīng)[9]。因此開發(fā)一種副作用小且作用持久的RA 治療藥物是亟待解決的難題。

本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明，GMI能顯著降低CIA小鼠的AI，有效改善CIA小鼠的組織病理學(xué)改變，顯著抑制血清中炎性因子TNF-α、IL-1β和IL-6的分泌，降低關(guān)節(jié)滑膜組織中MMP1和MMP3的表達(dá)水平，且呈一定的劑量依賴性。提示GMI對RA疾病的發(fā)生發(fā)展過程具有一定的治療作用，其藥理作用可能通過降低血清中炎性因子TNF-α、IL-1β和IL-6的含量，并進(jìn)一步抑制MMP1和MMP3的表達(dá)水平，從而減輕軟骨損傷，發(fā)揮抗RA的療效。本實(shí)驗(yàn)為將GMI開發(fā)成為療效確切、安全經(jīng)濟(jì)的RA臨床治療藥物提供理論基礎(chǔ)。