下調(diào)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中TRPC5的表達(dá)對(duì)人巨噬細(xì)胞凋亡的影響及機(jī)制研究

閆博陽(yáng) 趙津璋 陳 虹

(黑龍江省佳木斯市中心醫(yī)院，佳木斯154002)

動(dòng)脈粥樣硬化(Atherosclerosis，AS)是常見(jiàn)的一種動(dòng)脈硬化類型，是引起多種心血管疾病發(fā)生的病理基礎(chǔ)，具有發(fā)病率高、致殘率高和死亡率高的特點(diǎn)，由其導(dǎo)致的心腦血管疾病已成為目前威脅人類健康及誘發(fā)死亡的一個(gè)主要疾病，且近些年的發(fā)病率和死亡率呈上升趨勢(shì)[1]。巨噬細(xì)胞凋亡是引起AS斑塊不穩(wěn)定的主要細(xì)胞成分，在其病變過(guò)程中發(fā)揮重要作用。有研究發(fā)現(xiàn)，早期和晚期AS中巨噬細(xì)胞凋亡結(jié)果是不同的，在AS病變?cè)缙诰奘杉?xì)胞凋亡可降低病變面積，而晚期的巨噬細(xì)胞凋亡可促進(jìn)心血管疾病的發(fā)生[2,3]。有研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)典瞬時(shí)受體電位(Transient receptor potential canonical，TRPC)通道調(diào)節(jié)的細(xì)胞可參與AS發(fā)生的生理病理過(guò)程，TRPC5為TRPC家族的一個(gè)成員，可參與血管平滑肌細(xì)胞(Vascular smooth muscle cell，VSMCs)細(xì)胞的增殖、收縮、遷移、肥大等病理生理過(guò)程，加速AS的發(fā)展進(jìn)程[4]。巨噬細(xì)胞凋亡調(diào)控的信號(hào)具有復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)體系，在氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)等各種刺激因子作用下，絲氨酸蘇氨酸激酶(Serine/threonine kinase,AKT)、絲裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinases,MAPK)等信號(hào)均可參與調(diào)控巨噬細(xì)胞凋亡[5]。TRPC5基因?qū)x-LDL刺激巨噬細(xì)胞凋亡的影響還未可知。因此，本研究首先檢測(cè)了AS斑塊TRPC5的表達(dá)，利用RNA干擾TRPC5的表達(dá)，通過(guò)ox-LDL與TRPC5的siRNA同時(shí)處理離體培養(yǎng)的巨噬細(xì)胞，檢測(cè)細(xì)胞的增殖凋亡情況，并檢測(cè)對(duì)凋亡相關(guān)蛋白及AKT信號(hào)通路的影響。

1 材料與方法

1.1試劑與儀器 胎牛血清、RPMI1640培養(yǎng)基均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；TRPC5-siRNA及NC-siRNA由上海生工合成；LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑盒、總RNA提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒均購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒：Power SYBR Green PCR Master Mixg購(gòu)自美國(guó)ABI公司；二喹啉甲酸(Bicinchoninic acid，BCA)試劑盒及蛋白提取試劑盒購(gòu)自美國(guó)Nerck Millipore公司；細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒(Cell Counting Kit-8，CCK8)購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所；膜聯(lián)蛋白V-FITC(Annexin V-FITC)/碘化丙錠(PI)細(xì)胞凋亡試劑盒、流式細(xì)胞儀均購(gòu)自美國(guó)BD公司；TRPC5、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(Cysteinyl aspartate specific proteinase 3，Caspase-3)、絲氨酸蘇氨酸激酶(Serine/threonine kinase,AKT)、磷酸化的絲氨酸蘇氨酸激酶(Phosphorylated Serine/threonine kinase,p-AKT)抗體購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀購(gòu)自瑞士Roche；酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司。

1.2方法

1.2.1模型建立 實(shí)驗(yàn)組選取SPF級(jí)5周齡的ApoE-/-小鼠52只，體重18～22 g，對(duì)照組選擇相同年齡及體重范圍的SPF級(jí)ApoE-/-小鼠52只，均購(gòu)自南京君科生物工程有限公司。實(shí)驗(yàn)組小鼠采用含有15%的豬油和1%膽固醇的高脂飲食，以建立AS模型，對(duì)照組小鼠正常飼喂，飼料及飲水不限，溫度18～20℃，相對(duì)濕度為40%～70%。飼喂20周后，測(cè)定血液總膽固醇含量，總膽固醇含量高出對(duì)照組6～10倍，且有AS斑塊形成為建模成功，如無(wú)斑塊形成則繼續(xù)飼喂直至AS模型預(yù)評(píng)達(dá)標(biāo)。取對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組小鼠的AS斑塊組織，用于TRPC5基因表達(dá)檢測(cè)。

1.2.2TRPC5基因表達(dá)檢測(cè) RNA提取試劑盒提取組織中的總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以GAPDH為內(nèi)參基因，通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR對(duì)TRPC5基因表達(dá)進(jìn)行定量。TRPC5 F：5′-ACAAAAAGGTCAACTACTC-ACCG-3′，R：5′-CAGTGGCATAGTCCCCCT-TCT-3′；產(chǎn)物長(zhǎng)度126 bp,GAPDH F：5′-AACTGCTTAGCAC-CCCTGGC-3′，R：5′-ATGACCTTGCCCACACAGCCTT-3′。產(chǎn)物長(zhǎng)度200 bp,反應(yīng)條件如下：95℃預(yù)變性30 s，1個(gè)循環(huán)，PCR反應(yīng)，95℃ 5 s，60℃ 5 s，40個(gè)循環(huán)反應(yīng)結(jié)束，得到Ct值，根據(jù)Ct均值，GAPDH 為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計(jì)算。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.3人巨噬細(xì)胞培養(yǎng) THP-1人單核細(xì)胞株購(gòu)自上海艾研生物科技有限公司；細(xì)胞在37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中用RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)(含胎牛血清)，根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要傳代。以每孔105個(gè)細(xì)胞將傳4～6 代的細(xì)胞接種至6孔板中，細(xì)胞生長(zhǎng)約90%融合時(shí)，加入濃度為1 μg/ml的PMA溶液(999 μl的DMSO中加入PMA原液1 μl)，按照每孔中加入7.5 μl/ml 培養(yǎng)基，加入至培養(yǎng)基中。24 h后細(xì)胞貼壁，證實(shí)巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)成功[6]。

1.2.4細(xì)胞分組及siRNA轉(zhuǎn)染 細(xì)胞分為對(duì)照組、NC組、TRPC5-siRNA、ox-LDL組和TRPC5-siRNA+ox-LDL組。對(duì)照組細(xì)胞無(wú)特殊處理，NC組和TRPC5-siRNA分別轉(zhuǎn)染合成的無(wú)干擾作用的siRNA及具有干擾TRPC5表達(dá)的siRNA，轉(zhuǎn)染濃度為100 nmol/L，ox-LDL組加入50 μg/ml的ox-LDL，x-LDL+TRPC5-siRNA組分別加入TRPC5-siRNA及50 μg/ml的ox-LDL。細(xì)胞轉(zhuǎn)染參照LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染說(shuō)明。培養(yǎng)箱內(nèi)6 h后，更換成新的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.5TRPC5、Caspase3、AKT、p-AKT蛋白表達(dá)檢測(cè) 收集轉(zhuǎn)染24 h的細(xì)胞，加入細(xì)胞裂解液提取細(xì)胞蛋白，BCA法定量蛋白，取40 μg蛋白進(jìn)行10%的SDS-PAGE電泳，電泳結(jié)束后依次進(jìn)行PVDF轉(zhuǎn)膜、脫脂奶粉封閉，4℃孵育一抗( TRPC5、Caspase3、AKT、p-AKT和內(nèi)參GAPDH抗體均按照1∶1 000稀釋)，洗膜，加入1∶2 000稀釋HRP標(biāo)記的羊抗兔二抗，洗膜，暗室中顯影、定影。

1.2.6細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn) 取轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)24 h的NC組、ox-LDL組、TRPC5-siRNA組和TRPC5-siRNA+ox-LDL組細(xì)胞，每孔加入CCK8液10 μl，37℃孵育4 h，酶標(biāo)儀562 nm測(cè)定各孔的吸光度值(OD)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.8細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn) 取轉(zhuǎn)染24 h的細(xì)胞，根據(jù) Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡試劑盒檢測(cè)各組細(xì)胞的凋亡情況。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1TRPC5基因在AS中的表達(dá) 提取AS斑塊中總RNA，通過(guò)RT-PCR及Western blot兩種方法檢測(cè)TRPC5基因的表達(dá)，結(jié)果如圖1所示，對(duì)照組及AS組TRPC5的mRNA表達(dá)分別為0.960±0.170、4.611±1.040，蛋白表達(dá)分別為0.196±0.018、0.788±0.089，TRPC5基因在AS組中的表達(dá)顯著高于在對(duì)照組的表達(dá)(tmRNA=6.001，PmRNA=0.004；t蛋白=11.292，P蛋白=0.000)。

2.2TRPC5在巨噬細(xì)胞中的表達(dá) 各組細(xì)胞中TRPC5的蛋白表達(dá)檢測(cè)結(jié)果如圖2和表1所示，與對(duì)照組比較，NC組TRPC5的蛋白表達(dá)無(wú)明顯變化(P>0.05)，TRPC5-siRNA組TRPC5的蛋白表達(dá)顯著降低(t=5.053，P=0.001)，ox-LDL組TRPC5的蛋白表達(dá)顯著升高(t=14.592，P=0.000)；TRPC5-siRNA+ ox-LDL 組TRPC5的蛋白表達(dá)顯著低于ox-LDL組(t=19.645，P=0.000)，高于TRPC5-siRNA組(t=3.731，P=0.004)。

圖1 TRPC5基因在AS中的表達(dá)Fig.1 Expression of TRPC5 gene in ASNote: A.RT-PCR was used to detect the expression of TRPC5 in AS plaques;B.Western blot was used to detect TRPC5 protein expression in AS plaque;compared with the control group,*.P<0.05.

2.3TRPC5基因?qū)?jīng)ox-LDL刺激的巨噬細(xì)胞增殖的影響 巨噬細(xì)胞經(jīng)ox-LDL和TRPC5-siRNA處理后，CCK8檢測(cè)各組細(xì)胞的增殖情況，結(jié)果如表2 所示，與對(duì)照組比較，NC組細(xì)胞增殖無(wú)明顯變化(P>0.05)，TRPC5-siRNA組細(xì)胞增殖顯著升高(t=

圖2 TRPC5基因在巨噬細(xì)胞中的表達(dá)Fig.2 Expression of TRPC5 gene in macrophagesNote: 1.Control group;2.NC group；3.TRPC5-siRNA group；4.ox-LDL group；5.TRPC5-siRNA+ox-LDL group.

表1TRPC5基因在巨噬細(xì)胞中的表達(dá)

Tab.1ExpressionofTRPC5geneinmacrophages

Groups Relative expression of TRPC5 protein Control0.202±0.018NC0.218±0.022TRPC5-siRNA0.095±0.0111)2)ox-LDL0.511±0.0471)2)TRPC5-siRNA+ox-LDL0.174±0.015F112.344P0.000

Note：Compared with the control group,1)P<0.05;compared with the TRPC5-siRNA+ox-LDL group,2)P<0.05.

表2TRPC5基因?qū)?jīng)ox-LDL刺激的巨噬細(xì)胞增殖的影響

Tab.2EffectofTRPC5geneonproliferationofmacrophagesstimulatedbyox-LDL

GroupsODControl0.538±0.052NC0.524±0.045TRPC5-siRNA 0.689±0.0581)2)ox-LDL 0.341±0.0281)2)TRPC5-siRNA+ox-LDL0.472±0.035F23.382P0.000

Note：Compared with the control group,1)P<0.05;compared with the TRPC5-siRNA+ox-LDL group,2)P<0.05.

4.114，P=0.002)，ox-LDL組細(xì)胞增殖顯著降低(t=5.368，P=0.000)；TRPC5-siRNA+ox-LDL組細(xì)胞增殖顯著高于ox-LDL組(t=3.269，P=0.005)，低于TRPC5-siRNA組(t=5.913，P=0.000)。

2.4TRPC5基因?qū)?jīng)ox-LDL刺激的巨噬細(xì)胞凋亡的影響 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡率結(jié)果如圖3和表3所示，與NC組比較，TRPC5-siRNA組細(xì)胞凋亡率顯著降低(t=8.042，P=0.000)，ox-LDL組細(xì)胞凋亡率顯著升高(t=9.650，P=0.000)；TRPC5-siRNA+ox-LDL組細(xì)胞凋亡率顯著低于ox-LDL組(t=11.049，P=0.000)，高于TRPC5-siRNA組(t=6.643，P=0.000)。

圖3 TRPC5基因?qū)?jīng)ox-LDL刺激的巨噬細(xì)胞凋亡的影響Fig.3 Effect of TRPC5 gene on apoptosis of macrophages stimulated by ox-LDLNote: 1.NC group；2.TRPC5-siRNA group；3.ox-LDL group； 4.TRPC5-siRNA+ox-LDL group.

表3TRPC5基因?qū)?jīng)ox-LDL刺激的巨噬細(xì)胞凋亡的影響

Tab.3EffectofTRPC5geneonapoptosisofmacrophagesstimulatedbyox-LDL

GroupsApoptosis rate(%)NC4.32±0.29TRPC5-siRNA2.02±0.131)2)ox-LDL7.08±0.531)2)TRPC5-siRNA+ox-LDL3.92±0.33F106.493P0.000

Note：Compared with the control group,1)P<0.05;compared with the TRPC5-siRNA+ox-LDL group,2)P<0.05.

2.5TRPC5基因?qū)?jīng)ox-LDL刺激的巨噬細(xì)胞Caspase3、AKT和p-AKT蛋白表達(dá)的影響 通過(guò)Western blot檢測(cè)各組細(xì)胞中凋亡蛋白Caspase3及AKT和磷酸化的AKT的蛋白表達(dá)，結(jié)果如圖4和表4所示，與NC組比較，TRPC5-siRNA組Caspase3蛋白表達(dá)顯著降低，p-AKT蛋白表達(dá)顯著升高(tCaspase3=6.645，PCaspase3=0.000；tp-AKT=10.973，Pp-AKT=0.000)，ox-LDL組Caspase3蛋白表達(dá)顯著升高，p-AKT蛋白表達(dá)顯著降低(tCaspase3=7.884，PCaspase3=0.000；tp-AKT=4.135，Pp-AKT=0.003)。TRPC5-siRNA+ox-LDL組Caspase3蛋白表達(dá)顯著低于ox-LDL組，高于TRPC5-siRNA組(t1=8.785，P1=0.000；t2=5.744，P2=0.000)，p-AKT蛋白表達(dá)顯著低于TRPC5-siRNA組，高于ox-LDL組(t1=6.918，P1=0.000；t2=8.190，P2=0.003)。

圖4 TRPC5基因?qū)?jīng)ox-LDL刺激的巨噬細(xì)胞Caspase3、AKT和p-AKT蛋白表達(dá)的影響Fig.4 Effect of TRPC5 gene on expression of Caspase3,AKT,and p-AKT protein in macrophages stimulated by ox-LDLNote: 1.NC group；2.TRPC5-siRNA group；3.ox-LDL group； 4.TRPC5-siRNA+ox-LDL group.

表4Caspase3、AKT和p-AKT的蛋白相對(duì)表達(dá)量

Tab.4ProteinrelativeexpressionofCaspase3,AKTandp-AKT

GroupsProtein relative expressionCaspase3AKTp-AKTNC0.222±0.0180.542±0.0520.097±0.010TRPC5-siRNA0.104±0.0121)2)0.528±0.0480.235±0.0231)2)ox-LDL0.362±0.0321)2)0.533±0.0540.045±0.0081)2)TRPC5-siRNA+ox-LDL0.206±0.0200.530±0.0510.148±0.016F71.3980.04482.853P0.0000.9870.000

Note：Compared with the control group,1)P<0.05;compared with the TRPC5-siRNA+ox-LDL group,2)P<0.05.

3 討論

AS是一種慢性進(jìn)行性疾病，是常見(jiàn)的對(duì)人類身體健康最具危害性的疾病之一，具體的發(fā)病機(jī)制還未明確[7]。ox-LDL已被證實(shí)是誘導(dǎo)AS發(fā)生的主要危險(xiǎn)因素，已有研究表明其刺激巨噬細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞及樹(shù)突狀細(xì)胞后，能引起細(xì)胞發(fā)生凋亡、遷移等變化[8-11]。在AS的發(fā)展過(guò)程中，巨噬細(xì)胞的增殖及凋亡過(guò)程均存在調(diào)節(jié)作用，其功能和數(shù)量改變可影響AS發(fā)展進(jìn)程[12,13]。目前關(guān)于AS中ox-LDL對(duì)巨噬細(xì)胞凋亡的影響已有研究。研究顯示，miR-1在AS斑塊中表達(dá)升高，ox-LDL刺激巨噬細(xì)胞可引起miR-1表達(dá)升高，過(guò)表達(dá)miR-1可增加ox-LDL刺激的巨噬細(xì)胞凋亡，從而參與AS發(fā)展過(guò)程[14,15]；ox-LDL可呈時(shí)間及劑量依賴促進(jìn)TRB3在巨噬細(xì)胞中的表達(dá)，抑制TRB3的表達(dá)可降低ox-LDL對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用和凋亡的促進(jìn)作用[16,17]。TRPC家族成員TRPC1、TRPC4和TRPC5在VSMCs中有大量表達(dá)，TRPC5具有脂質(zhì)離子亞型受體特性，可被ox-LDL中的1-磷酸鞘氨醇成分激活[18,19]。有研究發(fā)現(xiàn)，阿托伐他汀可通過(guò)下調(diào)TRPC5表達(dá)延緩AS進(jìn)程[20]。目前關(guān)于TRPC5對(duì)巨噬細(xì)胞凋亡的影響及機(jī)制還未清楚。

ApoE-/-小鼠是目前已公認(rèn)的作為研究AS藥理學(xué)及發(fā)病機(jī)制等方面最經(jīng)典的一個(gè)模型，其AS發(fā)病機(jī)制與人類該病的形成過(guò)程一致[21]。因此，本研究通過(guò)建立ApoE-/-小鼠AS模型，檢測(cè)到AS斑塊中TRPC5的表達(dá)升高，這說(shuō)明TRPC5可影響AS的發(fā)展。RNA干擾能高效、特異地抑制目的基因表達(dá)，是目前研究基因功能有效的方法，已得到廣泛的應(yīng)用[22,23]。本研究中通過(guò)RNA干擾技術(shù)沉默TRPC5的表達(dá)，檢測(cè)沉默TRPC5表達(dá)對(duì)ox-LDL刺激的巨噬細(xì)胞增殖凋亡的影響，發(fā)現(xiàn)ox-LDL刺激后巨噬細(xì)胞增殖顯著降低，凋亡增加，而抑制TRPC5表達(dá)后可緩解這一效應(yīng)。這提示TRPC5可調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞的增殖凋亡，從而影響AS的發(fā)展進(jìn)程。

Caspase家族在細(xì)胞凋亡過(guò)程中發(fā)揮重要作用，均以酶原這種無(wú)活性的形式存在，Caspase3是該家族中的關(guān)鍵酶，處在Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)下游，作為凋亡者執(zhí)行者之一，活化的Caspase3可使凋亡進(jìn)入不可逆階段[24-26]。有研究顯示，ox-LDL可通過(guò)激活內(nèi)皮細(xì)胞Caspase3的活性，降低Bcl-2活性，從而促進(jìn)細(xì)胞的凋亡[27,28]。AKT是一種絲/蘇氨酸蛋白激酶，分子量約為60 kD，處于PI3K/AKT通路的中心環(huán)節(jié)，是PI3K的一個(gè)直接靶基因，物理刺激、生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子等都可通過(guò)使PI3K激活而活化磷酸化的AKT，活化的AKT可直接催化Caspase3，從而使其失去活性，抑制Caspase3的促凋亡作用[29,30]。研究發(fā)現(xiàn)，巨噬細(xì)胞凋亡過(guò)程中AKT信號(hào)途徑起了關(guān)鍵作用，AKT活性增加可抑制巨噬細(xì)胞的凋亡[31]。本研究中，為了檢測(cè)TRPC5表達(dá)對(duì)ox-LDL刺激的巨噬細(xì)胞Caspase3及AKT信號(hào)通路的影響，通過(guò)Western blot檢測(cè)Caspase3、AKT及p-AKT的蛋白表達(dá)，發(fā)現(xiàn)ox-LDL刺激可上調(diào)Caspase3表達(dá)，下調(diào)p-AKT的表達(dá)，而抑制TRPC5表達(dá)后可緩解這一效應(yīng)。本研究提示TRPC5可通過(guò)激活A(yù)KT信號(hào)通路影響巨噬細(xì)胞的增殖凋亡，對(duì)凋亡的調(diào)節(jié)方式是抑制Caspase3表達(dá)。

綜上所述，TRPC5基因在動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中表達(dá)升高，下調(diào) TRPC5表達(dá)可減弱ox-LDL對(duì)巨噬細(xì)胞增殖的抑制作用和凋亡的促進(jìn)作用，機(jī)制是激活A(yù)KT信號(hào)通路。對(duì)凋亡的調(diào)節(jié)方式是抑制Caspase3表達(dá)。本研究提示TRPC5基因可影響動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)展進(jìn)程，有望為該病進(jìn)一步研究提供新的靶點(diǎn)，值得進(jìn)一步進(jìn)行深入研究。