免疫抑制劑對小鼠流感病毒性肺炎模型建立的影響①

吳佳敏 張晨陽 盧芳國 魏 科 鄧雅琪 李博楊 吳肖男 李 玲

(湖南中醫(yī)藥大學中西醫(yī)結合學院,長沙410208)

流感病毒性肺炎是由于感染流感病毒而引起，其傳染率高，流行面廣，死亡率高，且流感病毒感染后臨床表現(xiàn)輕重不一，又以A型流感病毒抗原變異性最強[1-3]。而目前實驗室流感病毒性肺炎動物模型的建立有一定的難度,主要是由于許多動物對人類常見的A型流感病毒具有天然的免疫力，通常情況下很難引起動物的肺部感染，雖然我們采用的A型流感病毒屬于小鼠肺適應株，但是在病毒性肺炎的程度上還未達到臨床相似癥狀，因此為開發(fā)有效防治流感病毒性肺炎的藥物，流感病毒性肺炎模型的制備是實驗室目前亟待解決的問題。環(huán)磷酰胺作為免疫抑制劑可以抑制機體的體液免疫和細胞免疫，同時有研究表明一定劑量的環(huán)磷酰胺可使動物免疫功能受到抑制，于注射環(huán)磷酰胺第4天白細胞數(shù)量降到最低，而后可逐步恢復，并且不同劑量的環(huán)磷酰胺對于機體的免疫抑制作用存在差異[4]。目前環(huán)磷酰胺被廣泛運用于動物免疫抑制模型的制備，并取得了較好的效果[5]，故我們推測將環(huán)磷酰胺應用于病毒性肺炎小鼠模型的制備，極有可能使小鼠免疫受到抑制而更易于感染流感病毒。本研究將免疫抑制劑應用于流感病毒性肺炎小鼠模型的制備，并篩選出適宜的免疫抑制劑濃度，從而建立一個穩(wěn)定的流感病毒性肺炎小鼠模型。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物 從湖南斯萊克景達實驗動物有限公司購得昆明小鼠，雌雄各半，共120只；動物質(zhì)量合格證號43004700016764；實驗單位使用許可證編號SYXK(湘)2013-0005；許可證號SCXK(湘)2011-0003。

1.1.2病毒株及病毒攻毒量配制 流感病毒小鼠肺適應株(A型，IAV，A/PR/8/34)，由湖南師范大學病毒研究室惠贈。經(jīng)10日齡雞胚尿囊腔接種培養(yǎng)傳代，血凝效價1∶640以上者供試驗用。將病毒尿囊液以滅菌生理鹽水稀釋成50 LD50/0.1 ml(MOI=2.0)置于冰袋中備用。

1.1.3藥物制備 磷酸奧司他韋膠囊(瑞士羅氏公司，批號H20090377)，環(huán)磷酰胺(索萊寶公司，批號302A034)，按動物體表面積劑量換算法，磷酸奧司他韋膠囊21.63 mg/(kg·d)。

1.1.4主要試劑及設備 Trizol Reagent(北京百泰克，批號0020131114)；ELISA試劑盒(上海晶天；批號20161108)；HE染色試劑盒(索萊寶，批號20160831)；BCA試劑盒(上?？禐?；批號00171509)；ELX800-酶標儀(美國Bio-tek，ELX800)；IHC試劑盒(艾佳生物；批號：01110317)。

1.2方法

1.2.1實驗分組及干預方式 ①免疫抑制劑適宜劑量的篩選：分別用100 mg/(kg·d)、75 mg/(kg·d)、50 mg/(kg·d)的環(huán)磷酰胺經(jīng)腹腔注射0.4 ml/只，1次/2 d，一共2次，于4 d后進行A型流感病毒滴鼻感染。建立免疫抑制劑環(huán)磷酰胺高(Cytoxan-H)、中(Cytoxan-M)、低(Cytoxan-L)劑量組、對照組(Control)和正常組(Sham)，共使用小鼠40只。②流感病毒性肺炎小鼠模型建立：腹腔注射劑量為75 mg/(kg·d)的環(huán)磷酰胺0.4 ml/只，1次/2 d，一共2次。于4 d后進行A型流感病毒滴鼻感染。建立環(huán)磷酰胺單用組(Cytoxan)、病毒單用組(Virus)、環(huán)磷酰胺+病毒組(Cytoxan+ Virus)、正常組(Sham)，共使用小鼠80只。

1.2.2脾指數(shù) 計算公式:脾指數(shù)=脾重量(mg)/小鼠體重(g)×10。

1.2.3ELISA法檢測血清中IL-4的含量 采取眼眶取血的方式,采集小鼠的血液,靜置5～10 min后，3 000 r/min離心15 min，取血清置-80℃冰存。用ELISA法檢測各組小鼠血清中炎性因子IL-4的含量。

1.2.4肺、脾病理切片 取肺、脾組織，10%的中性甲醛固定、梯度脫水、二甲苯透明、石蠟包埋，間斷連續(xù)5 μm厚切片，HE染色、脫水、透明、封片。光學顯微鏡下觀察肺組織病理改變。

2 結果

2.1免疫抑制劑適宜劑量的篩選結果

2.1.1各組小鼠一般情況的比較 如圖1A和圖1B所示，免疫抑制劑各劑量組和對照組平均每日體重增長量下降，脾指數(shù)增大，與正常組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05或P<0.01)。如表1所示，各組死亡情況顯示環(huán)磷酰胺高劑量組死亡數(shù)量最多，中劑量組與低劑量組次之，對照組與正常組小鼠未出現(xiàn)死亡。

2.1.2各組小鼠肺組織病理變化的比較 如圖2所示，免疫抑制劑各劑量組和對照組肺泡結構損傷嚴重，明顯肺泡間質(zhì)增寬，充血、水腫伴大量炎癥細胞浸潤，與正常組比較，差異顯著；其中免疫抑制劑高、中劑量組中的炎癥表現(xiàn)較對照組與低劑量組嚴重，低劑量組的肺部炎癥程度與對照組無明顯的差異。

圖1 各組小鼠平均每日體重增長量、脾指數(shù)的比較Fig.1 Average daily weight gain and spleen index in miceNote: Vs sham,*.P<0.05，**.P<0.01.

表1環(huán)磷酰胺對小鼠死亡情況的影響(只)

Tab.1Effectofcyclophosphamideondeathofmice(n)

GroupsMean of interventionFatalityMortalityShamNS00/8ControlVirus00/8Cytoxan-LCytoaxn+Virus22/8Cytoxan-MCytoaxn+Virus22/8Cytoxan-HCytoaxn+Virus55/8

圖2 各組小鼠肺組織病理變化的比較(HE染色，×200)Fig.2 Comparison of pathological changes of lung tissue in each group(HE，×200)

2.1.3各組小鼠脾組織病理變化的比較 脾臟實質(zhì)分為白髓、紅髓和邊緣區(qū)。如圖3所示，正常組脾索由富含血細胞的淋巴組織構成，脾索之間可見脾竇，脾小體邊界明顯，生發(fā)中心清晰可見；對照組中可見紅髓增寬充血，淋巴細胞增多，并伴有大量多核巨細胞浸潤，而脾小體邊界仍較為清晰；環(huán)磷酰胺低劑量組可見脾小體邊界不清，紅髓增寬充血；環(huán)磷酰胺高、中劑量組紅髓中有大量的淋巴細胞細胞浸潤，紅髓增寬明顯，脾小體邊界不清，其中高劑量中淋巴細胞更為彌散，甚至脾小體消失，與對照組相比差異顯著，與同期脾重增加相對應。

2.1.4各組小鼠血清IL-4表達情況的比較 如圖4所示，免疫抑制劑各劑量組和對照組小鼠肺組織中IL-4表達減少，與正常組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；但免疫抑制劑各劑量組IL-4表達量，與對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義。

圖3 各組小鼠肺組織病理變化的比較(HE染色，×100)Fig.3 Comparison of pathological changes of spleen tissue in each group(HE，×100)

圖4 各組小鼠血清IL-4含量的比較Fig.4 Comparison of IL-4 expression in lung tissue of miceNote: Vs sham,*.P<0.05.

圖5 各組小鼠體重比較Fig.5 Weight and spleen index comparison of mice in each groupNote: Vs sham,*.P<0.05.

圖6 各組小鼠肺組織病理變化的比較(HE染色，×200)Fig.6 Comparison of pathological changes of lung tissue in each group (HE，×200)

2.1.5免疫抑制劑適宜劑量的篩選結果 綜合上述結果，且根據(jù)免疫抑制劑環(huán)磷酰胺的藥物毒性和最少用藥原則，本研究擬選擇環(huán)磷酰胺中劑量組的用藥劑量75 mg/(kg·d)為造模免疫抑制劑適宜劑量。

2.2流感病毒性肺炎小鼠模型建立的結果

2.2.1各組小鼠一般情況的比較 如圖5A所示，流感病毒和環(huán)磷酰胺能不同程度抑制小鼠體重的增長，與正常組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，兩者合用更為顯著。如圖5B所示，環(huán)磷酰胺能一定程度抑制免疫器官脾的功能，體現(xiàn)在脾指數(shù)下降，與正常組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，而自感染病毒后第3天起脾指數(shù)升高甚至高于正常組，與感染病毒當天比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，可能與病毒感染后引起脾臟增生有關。

2.2.2各組小鼠肺組織病理變化的比較 如圖6所示，環(huán)磷酰胺+病毒組與病毒單用組的肺組織中均有支氣管炎癥浸潤，上皮增生脫落，肺泡間質(zhì)增寬，并伴大量炎癥細胞浸潤，與正常組比較，差異顯著。其中環(huán)磷酰胺+病毒組的炎癥浸潤與肺泡結構損傷均較病毒組嚴重；環(huán)磷酰胺單用組與正常組肺組織無明顯差異。

2.2.3各組小鼠脾組織病理變化的比較 如圖7所示，病毒感染當天(即環(huán)磷酰胺注射第4天)，環(huán)磷酰胺組與環(huán)磷酰胺+病毒組，脾小結顯著收縮，同時細胞數(shù)量降低且結構分界不清，生發(fā)中心不明顯，與病毒組和正常組差異顯著，與同期小鼠脾重顯著下降相對應。于病毒感染第7天，環(huán)磷酰胺+病毒組紅髓中有大量的淋巴細胞細胞浸潤、彌散，紅髓增寬明顯，脾小體邊界不清，與環(huán)磷酰胺單用組差異顯著，且大量的多核巨細胞浸潤與病毒組相比差異顯著，這與同期小鼠脾重顯著增加相對應。

圖7 于感染病毒當天和第7天各組小鼠肺組織病理變化的比較(HE染色，×100)Fig.7 Comparison of pathological changes of spleen tissue at same day and seventh day (HE，×100)

圖8 各組小鼠血清中IL-4含量的比較Fig.8 Comparison of IL-4 expression in serum of miceNote: Vs sham，*.P<0.05.

2.2.4各組小鼠肺血清中IL-4表達情況的比較 如圖8所示，環(huán)磷酰胺可使小鼠IL-4表達增加,表現(xiàn)為感染病毒當天環(huán)磷酰胺+病毒組與環(huán)磷酰胺單用組IL-4的表達低于正常組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。環(huán)磷酰胺+病毒組與環(huán)磷酰胺單用組IL-4的表達于感染病毒后逐漸增高，于第3天后，IL-4表達水平與正常組相比,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

3 討論

由于動物對于流感病毒具有天然的免疫力，使得流感病毒性肺炎動物模型的建立有一定的難度，然而流感病毒性肺炎是臨床上高發(fā)的一種疾病，所以免疫抑制模型制備的研究有其必要性[6]。環(huán)磷酰胺是目前臨床上常用的抗腫瘤藥物和細胞毒性藥物，是一種免疫抑制劑，并廣泛地運用于動物免疫抑制模型的制備[7]。環(huán)磷酰胺具有細胞毒性，并可抑制機體的免疫功能，但短期用藥可使機體免疫功能短暫抑制并得到很快恢復[8]。

在免疫抑制劑適宜劑量的篩選實驗結果中發(fā)現(xiàn)，注射不同濃度的免疫抑制劑可使小鼠體重增長減慢甚至下降，其中小鼠的死亡情況，以及小鼠肺炎的嚴重程度都與注射的環(huán)磷酰胺濃度成正相關。這一結果表明免疫抑制劑環(huán)磷酰胺可使小鼠更易于感染流感病毒而患病毒性肺炎甚至死亡，然而環(huán)磷酰胺本身也具有一定的藥物毒性可進一步造成小鼠死亡情況的發(fā)生。由脾臟的病理結果可以看出，實驗組與對照組中紅髓明顯增寬，體現(xiàn)為同期脾指數(shù)的增大，而脾小體縮小，淋巴細胞減少，這體現(xiàn)環(huán)磷酰胺的免疫抑制作用，在流感病毒的刺激下，脾臟中還可見到大量的多核巨細胞浸潤，紅髓中出現(xiàn)大量淋巴細胞彌散，其中高、中劑量組的脾臟病理改變皆明顯于環(huán)磷酰胺低劑量組和對照組。環(huán)磷酰胺高、中劑量組的小鼠肺炎程度以及脾臟病理改變無明顯差異，而環(huán)磷酰胺高劑量的小鼠死亡率明顯高于環(huán)磷酰胺中劑量組，本研究目的是使小鼠感染流感病毒的同時，減少因為環(huán)磷酰胺的毒副作用而引起的小鼠死亡情況；故可得出環(huán)磷酰胺中劑量[75 mg/(kg·d)]更適合于該模型的制備。流感病毒性肺炎小鼠模型建立的實驗結果中發(fā)現(xiàn)，注射環(huán)磷酰胺后小鼠的脾指數(shù)下降，在病理結果表現(xiàn)為脾小結顯著收縮，同時淋巴細胞數(shù)量降低且結構分界不清，生發(fā)中心不明顯，這與環(huán)磷酰胺的免疫抑制作用有關，于感染流感病毒后第3天起，脾指數(shù)可逐漸恢復甚至高于正常水平，第7天脾臟病理表現(xiàn)為紅髓大量的淋巴細胞浸潤，彌散，增寬明顯，脾小體縮小，邊界不清，多核巨細胞增多，這是由于脾臟受到免疫抑制而脾小體縮小，與空白組和病毒單用組差異顯著，又因為在流感病毒的刺激下使得紅髓中淋巴細胞代償性增多、彌散，與環(huán)磷酰胺單用組相比差異顯著，紅髓是脾臟免疫應答的主要場所。而感染病毒的當天和感染病毒后第1天IL-4的表達均小于正常組與病毒單用組，隨后呈逐漸上升的趨勢，于感染病毒后第5天，環(huán)磷酰胺單用組IL-4的表達量接近正常，說明停止注射環(huán)磷酰胺后不影響機體IL-4的表達。環(huán)磷酰胺+病毒組的炎癥浸潤與肺泡結構損傷最為嚴重，可見環(huán)磷酰胺可以使小鼠的免疫功能短暫地受到抑制，停止給予免疫抑制劑后免疫功能可逐漸恢復，這一方面有利于小鼠感染流感病毒；另一方面停止給予環(huán)磷酰胺后小鼠的免疫功能很快得以恢復，從而可用于藥物的篩選。

綜上所述，應用濃度為75 mg/(kg·d)的環(huán)磷酰胺作為免疫抑制劑，可使小鼠暫時處于免疫抑制狀態(tài)，再進行流感病毒攻毒，使小鼠更容易感染流感病毒，有利于得到完整且穩(wěn)定的流感病毒性肺炎小鼠模型。