布氏菌疫苗效力評(píng)價(jià)小鼠模型的建立

魏東，李天柱，陳成，尤明強(qiáng)，王國(guó)治

?

布氏菌疫苗效力評(píng)價(jià)小鼠模型的建立

魏東，李天柱，陳成，尤明強(qiáng)，王國(guó)治

100050 北京，中國(guó)食品藥品檢定研究院結(jié)核病疫苗室/衛(wèi)生部生物技術(shù)檢定方法及其標(biāo)準(zhǔn)化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（魏東、陳成、王國(guó)治）；730046 蘭州生物制品研究所有限責(zé)任公司菌苗室二室（李天柱、尤明強(qiáng)）

建立布氏菌疫苗效力評(píng)價(jià)小鼠模型，為布氏菌疫苗有效性評(píng)價(jià)奠定基礎(chǔ)。

測(cè)定感染布氏菌株動(dòng)物的脾臟細(xì)菌數(shù)，比較菌株毒力，篩選出布氏菌疫苗效力評(píng)價(jià)用布氏菌株。通過最小感染劑量的測(cè)定為效力評(píng)價(jià)的感染劑量提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。檢測(cè)動(dòng)物體內(nèi)布氏菌增殖情況，確定動(dòng)物解剖時(shí)間。將不同劑量的布氏菌活疫苗免疫小鼠，4 周后用布氏菌強(qiáng)毒菌株皮下感染，感染 4 周后將動(dòng)物解剖測(cè)定脾臟細(xì)菌數(shù)，分析疫苗保護(hù)效果。

篩選出布氏菌疫苗效力評(píng)價(jià)感染用布氏菌株，該菌株的皮下最小感染劑量為 300 CFU，感染后 4 周動(dòng)物脾臟細(xì)菌數(shù)達(dá)到較高且穩(wěn)定水平。布氏菌活疫苗免疫小鼠后能產(chǎn)生較好的保護(hù)效果，免疫劑量與保護(hù)力水平之間有較好的量效關(guān)系。

建立了布氏菌疫苗效力評(píng)價(jià)小鼠模型，為新型布氏菌疫苗的研制奠定了基礎(chǔ)。

布魯桿菌菌苗； 最小感染量； 效力

布魯氏菌?。ê?jiǎn)稱布?。┦怯刹剪斒暇ê?jiǎn)稱布氏菌）屬引起的一類人畜共患疾病，是《中華人民共和國(guó)傳染病防治法》中規(guī)定報(bào)告的乙類傳染病。布病在世界范圍內(nèi)廣泛流行，是全球特別是發(fā)展中國(guó)家面臨的主要公共衛(wèi)生問題[1-2]。20 世紀(jì)末以來，人布病在世界范圍內(nèi)的發(fā)病率呈上升態(tài)勢(shì)，每年新發(fā)病例數(shù)超過 50 萬例，已成為重要的國(guó)際性公共衛(wèi)生問題[3]。中國(guó)是布病的歷史疫區(qū)，近年來布病流行較為嚴(yán)重，且發(fā)病率逐年遞增，2017 年發(fā)病率為 2.79/10 萬，已經(jīng)連續(xù) 9 年發(fā)病人數(shù)超過 3 萬。

目前，接種疫苗是世界公認(rèn)的能夠降低布病發(fā)生和傳播最有效的、最經(jīng)濟(jì)的方法[4-5]。我國(guó)現(xiàn)人用布氏菌活疫苗采用皮上劃痕接種[6]，該方法操作復(fù)雜，不能準(zhǔn)確定量。改進(jìn)疫苗的免疫途徑是布氏菌疫苗研究的熱點(diǎn)，而有效性評(píng)價(jià)是新疫苗研發(fā)的重要內(nèi)容。為此，本研究建立了布氏菌疫苗效力評(píng)價(jià)小鼠模型，為布氏菌疫苗有效性評(píng)價(jià)奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要材料

1.1.1 動(dòng)物 SPF 級(jí) BALB/c 小鼠，18 ~ 22 g，雌性，由中國(guó)食品藥品檢定研究院（中檢院）實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，飼養(yǎng)在復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院生物安全三級(jí)實(shí)驗(yàn)室。

1.1.2 菌種 羊種布氏菌菌株編號(hào)分別為：CMCC55313（GH12）、CMCC55314（GH18）、CMCC55315（GH21）、CMCC55316（GH23）、CMCC55317（GH24）、CMCC55318（XJ91-60）、CMCC55210（16M），均由中檢院結(jié)核病疫苗室提供。

1.1.3 疫苗 布氏菌活疫苗（104M株）由中檢院結(jié)核病疫苗室制備。

1.1.4 試劑和儀器 胰蛋白大豆瓊脂培養(yǎng)基購自美國(guó) BD 公司；生物安全柜為美國(guó) NuAire LabGard 公司產(chǎn)品；恒溫培養(yǎng)箱為美國(guó) NuAire IR Autoflow 公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 布氏菌毒力比較 分別用 7 株羊種布氏菌感染小鼠，每株菌感染 5 只小鼠，感染用菌液濃度均為 5.0 × 105CFU/ml，每只小鼠后肢皮下注射 0.2 ml 菌液，感染后 2 周解剖，無菌取動(dòng)物脾臟，通過脾臟活菌數(shù)分析，比較各菌株的毒力，篩選出毒力最強(qiáng)的菌株。

1.2.2 最小感染量的測(cè)定 將 18 只BALB/c 小鼠隨機(jī)分成 6 組，每組 3 只動(dòng)物，后肢皮下感染不同劑量的羊種布氏菌 XJ91-60 株，感染劑量分別為1 × 101CFU/只、3 × 101CFU/只、1 ×102CFU/只、3 × 102CFU/只、1 × 103CFU/只、3 × 103CFU/只，感染后 4 周，將小鼠解剖，無菌取脾，測(cè)定脾臟細(xì)菌數(shù)，組內(nèi)全部動(dòng)物出現(xiàn)脾臟感染的最小感染劑量即為最小感染量（minimum infection dose，MID）。

1.2.3 感染動(dòng)物解剖時(shí)間的確定 將羊種布氏菌 XJ91-60 株后肢皮下感染15 只BALB/c 小鼠，感染用菌液濃度為 5.0 × 105CFU/ml，每只小鼠注射 0.2 ml，分別在感染后 2 周、4 周、12 周各解剖5 只動(dòng)物，通過脾臟活菌數(shù)分析，研究布氏菌在感染動(dòng)物體內(nèi)的增殖情況，為解剖時(shí)間的確定提供依據(jù)。

1.2.4 布氏菌疫苗效力評(píng)價(jià)研究 將25 只BALB/c 小鼠隨機(jī)分成 5 組，每組 5 只，免疫組 1（1 × 104/只）、免疫組 2（1 × 105/只）、免疫組 3（1 × 106/只）、免疫組 4（1 × 107/只）、生理鹽水對(duì)照組，注射途徑為后肢皮內(nèi)。免疫后 4 周，經(jīng)皮下感染羊種布氏菌 XJ91-60 株1000 個(gè) MID（3 × 105CFU）。感染后4 周將動(dòng)物解剖，無菌取脾，測(cè)定脾臟感染菌的活菌數(shù)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用 Minitab 16 統(tǒng)計(jì)軟件，將脾臟活菌數(shù)取以 10 為底的對(duì)數(shù)后進(jìn)行檢驗(yàn)，如脾臟無細(xì)菌生長(zhǎng)，按活菌數(shù)為 1 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果以< 0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 布氏菌株毒力比較

7 株羊種布氏菌株皮下感染小鼠后，通過脾臟活菌數(shù)分析，毒力最強(qiáng)的菌株為 XJ91-60 株，以該菌株作為效力評(píng)價(jià)感染用菌，結(jié)果見表 1。

2.2 最小感染量的測(cè)定

小鼠經(jīng)皮下分別感染系列濃度的羊種布氏菌XJ91-60 株，感染 4 周后的脾臟活菌數(shù)測(cè)定結(jié)果見表 2。感染劑量為 3 × 101CFU 時(shí)，即可出現(xiàn)動(dòng)物的脾臟感染；感染劑量為 3 × 102CFU 時(shí)，組內(nèi)全部動(dòng)物出現(xiàn)脾臟感染。因此，羊種布氏菌 XJ 91-60 株的小鼠皮下最小感染量為 3 × 102CFU。

表 1 布氏菌感染動(dòng)物脾臟活菌數(shù)測(cè)定結(jié)果

2.3 感染動(dòng)物解剖時(shí)間的確定

將羊種布氏菌 XJ91-60 株感染小鼠，各檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)脾臟感染率均為 100%，感染后 2 周脾菌數(shù)的對(duì)數(shù)值為 3.53 ± 0.34，感染后 4 周脾菌數(shù)的對(duì)數(shù)值為 5.50 ± 1.19，感染后 12 周脾菌數(shù)的對(duì)數(shù)值為 5.83 ± 1.10，感染后 4 周脾菌數(shù)達(dá)到較高且穩(wěn)定水平，感染后 4 周與感染后 12 周脾菌數(shù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（= 0.44，> 0.05），結(jié)果見圖 1。

2.4 布氏菌疫苗效力評(píng)價(jià)研究

小鼠經(jīng)不同劑量布氏菌疫苗免疫后 4 周用羊種布氏菌 XJ91-60 株進(jìn)行皮下感染，感染后 4 周脾臟細(xì)菌分離情況見圖 2。其中，生理鹽水對(duì)照組動(dòng)物的脾臟細(xì)菌分離數(shù)的對(duì)數(shù)值為 5.29 ± 0.34，免疫組 1（1 × 104/只）的脾臟細(xì)菌分離數(shù)的對(duì)數(shù)值為 2.85 ± 0.56，免疫組 2（1 × 105/只）的脾臟細(xì)菌分離數(shù)的對(duì)數(shù)值為 0.47 ± 0.94，免疫組 3（1 ×106/只）及免疫組 4（1 × 107/只）均未分離到感染菌。免疫組 1 及免疫組 2 的脾臟細(xì)菌分離數(shù)均低于生理鹽水對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（= 7.42，< 0.01；= 9.95，< 0.01）。免疫組 1 的脾臟細(xì)菌分離數(shù)高于免疫組 2，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（= 4.33，< 0.01）。免疫劑量與脾菌數(shù)的相關(guān)性系數(shù)為–0.963，呈強(qiáng)相關(guān)。該結(jié)果表明，布氏菌疫苗能對(duì)小鼠提供較好的保護(hù)效果，該評(píng)價(jià)模型可用于布氏菌疫苗的效力評(píng)價(jià)研究。

表 2 最小感染量測(cè)定結(jié)果

圖 1 感染動(dòng)物體內(nèi)布氏菌XJ91-60 株增殖結(jié)果

Figure 1 Results of proliferation ofXJ91-60 strainin infected animals

3 討論

布病不僅影響畜牧業(yè)和相關(guān)產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，造成社會(huì)經(jīng)濟(jì)損失，并且對(duì)人類的健康構(gòu)成重大威脅[7]，美國(guó)疾病預(yù)防控制中心將布氏菌列為潛在的生物恐怖戰(zhàn)劑[8-9]。鑒于布病造成的嚴(yán)重?fù)p失，世界上許多國(guó)家和地區(qū)制定了相應(yīng)的防控和根除計(jì)劃，研制新型疫苗在此過程中具有重要意義。動(dòng)物模型上的有效性評(píng)價(jià)是新疫苗研制過程中一項(xiàng)重要研究?jī)?nèi)容。

疫苗效力評(píng)價(jià)的動(dòng)物感染模型研究需要確定敏感模型動(dòng)物，挑選毒力最強(qiáng)的菌株用于動(dòng)物感染，確定菌株的最小感染劑量，通過檢測(cè)脾臟感染細(xì)菌達(dá)到較高且穩(wěn)定水平的時(shí)間來確定感染動(dòng)物的解剖時(shí)機(jī)，并通過參考疫苗考核效力評(píng)價(jià)體系的適用性。

小鼠和豚鼠都是布氏菌的易感動(dòng)物，由于小鼠便于操作，它是國(guó)內(nèi)外布氏菌疫苗研究常用的動(dòng)物模型[10]。布氏菌屬經(jīng)典分類為 6 個(gè)種：羊種布氏菌（）、牛種布氏菌（）、豬種布氏菌（）、犬種布氏菌（）、綿羊附睪布氏菌（）以及沙林鼠種布氏菌（），其中對(duì)人致病的主要是牛種、羊種和豬種布氏菌[11]。當(dāng)前，從我國(guó)布病患者分離的感染菌主要是羊種布氏菌[12-13]。所以，本研究從羊種布氏菌株中篩選效力評(píng)價(jià)感染用細(xì)菌[14]，經(jīng)比較，毒力最強(qiáng)的菌株為 XJ91-60 株。將不同劑量布氏菌 XJ91-60 株感染小鼠，感染劑量為 3 ×101CFU 時(shí)即可出現(xiàn)動(dòng)物感染，小鼠皮下注射的最小感染量為 3 × 102CFU，說明該菌株毒力較強(qiáng)。布氏菌 XJ91-60 株皮下感染小鼠 1 個(gè)月后，脾臟細(xì)菌分離數(shù)達(dá)到較高且穩(wěn)定水平，所以確定感染動(dòng)物的解剖時(shí)間為感染后 1 個(gè)月。以布氏菌活疫苗為參考疫苗考核該效力評(píng)價(jià)體系，設(shè)置了 4 個(gè)免疫劑量，免疫后小鼠皮下感染1000 個(gè) MID 羊種布氏菌 XJ91-60 株，對(duì)照組動(dòng)物均能夠分離到大量感染菌，疫苗免疫小鼠能有效抵抗布氏菌強(qiáng)毒株的感染，具有較好的保護(hù)效果，隨免疫劑量增加脾臟細(xì)菌分離數(shù)明顯降低，免疫劑量與保護(hù)力水平之間有較好的量效關(guān)系。本研究建立了布氏菌疫苗效力評(píng)價(jià)的小鼠模型，為新型布氏菌疫苗有效性評(píng)價(jià)奠定了基礎(chǔ)。

圖 2 布氏菌疫苗效力評(píng)價(jià)結(jié)果

Figure 2 Results of efficacy evaluation of brucellosis vaccine

[1] Pappas G, Papadimitriou P, Akritidis N, et al. The new global map of human brucellosis. Lancet Infect Dis, 2006, 6(2):91-99.

[2] Qiu YH, Wang J, He SY. Research progress on the epidemic, detection and prevention of human brucellosis. Chin J Clin Patholosis, 2015, 7(3):187-188, 172. (in Chinese)

邱宇鶴, 王錦, 何淑云. 人布魯氏菌病的流行、檢測(cè)與防治研究進(jìn)展. 實(shí)用檢驗(yàn)醫(yī)師雜志, 2015, 7(3):187-188, 172.

[3] Gwida M, Al Dahouk S, Melzer F, et al. Brucellosis - regionally emerging zoonotic disease? Croat Med J, 2010, 51(4):289-295.

[4] Roth F, Zinsstag J, Orkhon D, et al. Human health benenfits from livestock vaccination for brucellosis: case study. Bull World Health Organ, 2003, 81(12):867-876.

[5] Wang T, Ma WP, Li AQ, et al. Immune effect evaluation of livestock brucellosis in Dabancheng district of Xinjiang municipality. China Anim Health Inspection, 2016, 33(4):6-9, 22. (in Chinese)

王濤, 馬衛(wèi)平, 李愛巧, 等. 新疆達(dá)坂城區(qū)家畜布魯氏菌病免疫效果評(píng)估. 中國(guó)動(dòng)物檢疫, 2016, 33(4):6-9, 22.

[6] Chinese Pharmacopoeia Commission. Pharmacopoeia of the People’s Republic of China. Volume 3, 2015. Beijing: China Medical Science Press, 2015:112-114. (in Chinese)

國(guó)家藥典委員會(huì). 中華人民共和國(guó)藥典. 2015年版三部. 北京: 中國(guó)醫(yī)藥科技出版社, 2015:112-114.

[7] Olsen SC, Palmer MV. Advancement of knowledge of brucellosis over the past 50 years. Vet Pathol, 2014, 51(6):1076-1089.

[8] Greenfield RA, Drevets DA, Machado LJ, et al. Bacterial pathogens as biological weapons and agents of bioterrorism. Am J Med Sci, 2002, 323(6):299-315.

[9] Doganay GD, Doganay M. Brucella as a potential agent of bioterrorism. Recent Pat Antiinfect Drug Discov, 2013, 8(1):27-33.

[10] Smither SJ, Perkins SD, Davies C, et al. Development and characterization of mouse models of infection with aerosolized Brucella melitensis and Brucella suis. Clin Vaccine Immunol, 2009, 16(5):779-783.

[11] Schurig GG, Sriranganathan N, Corbel MJ. Brucellosis vaccines: past, present and future. Vet Microbiol, 2002, 90(1-4):479-496.

[12] Wang DL, Li TF, Liu FQ, et al. Analysis on the monitoring results of brucellosis in 2010. Chin J Ctrl Endem Dis, 2011, 26(4):256-258. (in Chinese)

王大力, 李鐵鋒, 劉鳳岐, 等. 全國(guó)2010年布魯桿菌病監(jiān)測(cè)結(jié)果分析. 中國(guó)地方病防治雜志, 2011, 26(4):256-258.

[13] Liu ZG, Wang M, Liu RH, et a1. Species identification and epidemiological characteristics analysis of Brucella in Ulanqab, Inner Mongolia, China. Chin J Zoonoses, 2016, 32(7):618-622, 631. (in Chinese)

劉志國(guó), 王妙, 劉日宏, 等. 內(nèi)蒙古烏蘭察布布氏菌分離株種型鑒定及流行病學(xué)特征分析. 中國(guó)人獸共患病學(xué)報(bào), 2016, 32(7):618- 622, 631.

[14] Cheng JS, Wu MH, Zhao LX, et a1. Virulence comparision between three different vaccine strains of brucellosis in mice and guinea pigs. Chin J Vet Drug, 2012, 46(9):1-3. (in Chinese)

程君生, 吳梅花, 趙麗霞, 等. 三種布魯氏菌病疫苗株的毒力比較. 中國(guó)獸藥雜志, 2012, 46(9):1-3.

Establishment of the brucellosis vaccine potency evaluation model in mice

WEI Dong, LI Tian-zhu, CHEN Cheng,YOU Ming-qiang, WANG Guo-zhi

TB Vaccine Division, National Institute for Food and Drug Control, Key Laboratory of the Ministry of Health for Research on Quality and Standardization of Biotech Products, Beijing 100050, China (WEI Dong, CHEN Cheng, WANG Guo-zhi); Second Bacterial Vaccine Division, Lanzhou Institute of Biological Products Co., Ltd., Lanzhou 730046, China (LI Tian-zhu, YOU Ming-qiang)

To develop and utilize appropriate animal model ofinfection in order to evaluate the efficacy of vaccines for human brucellosis.

The most virulentstrain was selected by comparing the virulence. In order to establish the minimum infection dose of the selectedstrain in BALB/c mice, groups of 6 animals were injected with series concentration ofbacteria. In order to determine the time of anatomy, mice were culled and the bacterial loads in the spleens were determined at different time after injection. Two experiments were performed to confirm and further characterize this mouse model. The mice were challenged withbacteria at 4 weeks after immunization, and the bacterial loads in the spleens were determined at 4 weeks after injection.

Thestrain used for the evaluation of efficacy of brucellosis vaccine was selected, and the minimum infection dose of the selectedXJ91-60 strain in BALB/c mice was 300 CFU. Bacterial loads in the spleen achieved high and stable level at 4 weeks after injection. The mice immunized with brucellosis vaccinewere protected against challenge with virulentstrain.

Brucellosis vaccine potency evaluation model in mice is established, which lays a foundation for the development of the newbrucellosis vaccine.

Brucella vaccine; Minimum infection dose; Potency

WANG Guo-zhi, Email: vaccine2012@126.com

“重大新藥創(chuàng)制”國(guó)家科技重大專項(xiàng)（2014ZX09304311-002）

王國(guó)治，Email：vaccine2012@126.com

2018-06-26

10.3969/j.issn.1673-713X.2018.05.005