抗人CD30單克隆抗體的制備和活性研究

王蓉，李良，張勝華，甄永蘇，苗慶芳

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抗人CD30單克隆抗體的制備和活性研究

王蓉，李良，張勝華，甄永蘇，苗慶芳

100050 北京，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所腫瘤室

制備抗人 CD30 單克隆抗體并進行活性研究，為其作為抗體偶聯(lián)藥物的靶向運輸載體提供研究依據(jù)。

通過基因工程技術(shù)構(gòu)建真核表達載體 pIZDHL-CD30-IgG，將質(zhì)粒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染 CHO/dhFr-細胞并篩選，獲得穩(wěn)定表達 anti-CD30-IgG 抗體的細胞株并純化抗體，通過 HPLC 檢測其純度。ELISA、Biacore 和流式細胞術(shù)實驗檢測 anti-CD30-IgG 的親和活性；免疫熒光共聚焦實驗觀察其在腫瘤細胞的內(nèi)吞情況；利用小動物活體成像技術(shù)研究抗體在 NOD/SCID 鼠移植瘤模型中的靶向性。

成功構(gòu)建了 anti-CD30-IgG 抗體的表達載體，并篩選出穩(wěn)定表達的單克隆細胞株 CHO-CD30-IgG，純化后的抗體 anti-CD30-IgG 純度達到 98% 以上。Anti-CD30-IgG 與重組人 CD30 抗原具有很好的親和活性，親和常數(shù)為 4.15 × 108L/mol，其可通過腫瘤細胞表面 CD30 受體介導(dǎo)的內(nèi)吞進入細胞。在 NOD/SCID 小鼠 L540 和 Karpas299 移植瘤模型中，anti-CD30-IgG 可以選擇性地富集并滯留在腫瘤部位。

Anti-CD30-IgG 對抗原和腫瘤細胞具有高親和性和特異性，并且可被內(nèi)吞進入腫瘤細胞內(nèi)部，在小鼠體內(nèi)可選擇性靶向并且長時間滯留在腫瘤部位，可作為抗體偶聯(lián)藥物中“彈頭”部分的靶向輸送載體。

抗原，CD30； 抗體，單克隆； 霍奇金?。?大細胞，間變性

霍奇金淋巴瘤（Hodgkin lymphoma，HL）和間變性大細胞淋巴瘤（anaplastic large cell lymphoma，ALCL）是惡性血液腫瘤且在青少年中發(fā)病率較高。隨著化療、放療等一線治療技術(shù)的發(fā)展，HL 和 ALCL 治療取得了重大進展，但仍有約 10% 的 HL 患者和 40% ~ 60% 的ALCL患者對一線治療無應(yīng)答或治療后復(fù)發(fā)，需要接受自體造血干細胞移植（autologous hematopoietic stem-cell transplantation，ASCT）[1-2]。雖然 ASCT 在復(fù)發(fā)性和難治性淋巴瘤的治療中表現(xiàn)為較好的治愈率，但仍有約 50% 的患者經(jīng)二次治療后復(fù)發(fā)，后續(xù)治療愈加困難[3]。因此，復(fù)發(fā)性和難治性 HL 和 ALCL 仍是血液腫瘤治療的重點和難題。

CD30 是腫瘤壞死因子受體超家族（tumor necrosis factor receptor superfamily，TNFRSF）成員之一，屬于 I 型跨膜糖蛋白，在多種惡性血液瘤中過表達，包括 HL 和 ALCL[4]。CD30 低表達于非病理狀態(tài)下活化的 T 細胞、B 細胞表面，而在正常細胞不表達[5]。CD30 在腫瘤細胞的高度特異性和選擇性表達使其成為抗體靶向藥物的理想靶點，而以 CD30 為靶點的單克隆抗體及抗體偶聯(lián)藥物的發(fā)展為 HL 和 ALCL等惡性血液腫瘤的治療提供了新策略。SGN-30 是靶向 CD30 的嵌合抗體，其通過抗體依賴的細胞吞噬作用（antibody-dependent cellular phagocytosis，ADCP）在體內(nèi)發(fā)揮較好的抗腫瘤效果[6]，而抗體偶聯(lián)藥物（antibody-drug conjugate，ADC）SGN-35（brentuximab vedotin，BV）是由 SGN-30 通過連接肽與微管抑制劑 MMAE 偶聯(lián)而成，已獲美國 FDA 批準(zhǔn)上市并在臨床上取得了突出療效[7-8]。盡管如此，在復(fù)發(fā)性或難治性 HL 患者的臨床試驗中，BV 治療顯示中位無進展生存期不到 10 個月，而五年無進展生存率僅為22%[9-10]。在一項隨機、雙盲、控?zé)煹娜谂R床試驗中，經(jīng) BV 治療出現(xiàn)外周感覺神經(jīng)病變的患者占 50% 以上[11]。此外，有報道表明，其“彈頭”藥物 MMAE 導(dǎo)致的耐藥性是患者對 BV 治療產(chǎn)生耐藥性的主要因素之一[12]。因此，以 CD30 為靶點研發(fā)新型針對 HL 和 ALCL 的抗體及 ADCs 具有重要意義。

本研究構(gòu)建了以 CD30 為靶點的抗體 anti-CD30-IgG 并實現(xiàn)了其在 CHO 細胞的高效表達，進一步研究了該抗體與 CD30 抗原和腫瘤細胞的親和性和特異性，以及其在小鼠移植瘤模型中的腫瘤靶向性，為其作為抗體偶聯(lián)藥物的靶向運輸載體提供研究依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞系 中國倉鼠卵巢細胞 CHO/dhFr-細胞購自美國模式培養(yǎng)物集存庫（ATCC）；人霍奇金淋巴瘤細胞系 L540 和 L428 購自美國 Creative Bioarray 公司；人間變性大細胞淋巴瘤細胞系 Karpas299 和 SU-DHL-1 購自北京博奧派克生物科技有限公司；人 Burkitt 淋巴瘤細胞系 Raji 由本室傳代保存。

1.1.2 主要試劑 T4 DNA 連接酶及限制性內(nèi)切酶系列產(chǎn)品均購自美國 NEB 公司；DAPI 購自北京索萊寶生物科技有限公司；重組人 CD30 蛋白（Catalog # 6126-CD）購自美國 R&D Systems 公司；胎牛血清（FBS）為美國 Gibco 公司產(chǎn)品；RPMI-1640 培養(yǎng)基為美國 Hyclone 公司產(chǎn)品；FITC 標(biāo)記山羊抗人抗體購自北京中杉金橋生物技術(shù)公司；Alexa Fluor 488 標(biāo)記羊抗人 IgG（Fcγ特異性）抗體購自美國 Jackson Immuno Research 公司；山羊抗人 IgG（γ 鏈特異性）、堿性磷酸酶標(biāo)記山羊抗人 IgG（Fc 特異性）抗體購自 Sigma 公司；BCA 試劑盒和 DyLight 680 抗體標(biāo)記試劑盒購自美國 Thermo Scientific 公司；尼妥珠單抗購自百泰生物藥業(yè)有限公司。

1.1.3 耗材 細胞培養(yǎng)瓶、細胞培養(yǎng)板、細胞培養(yǎng)皿、離心管等細胞培養(yǎng)耗材均購自美國 Corning 公司；PD-10 脫鹽柱、抗體純化柱子 Protein G HP 為美國 GE Healthcare 公司產(chǎn)品；超濾離心管購自美國 Millipore 公司。

1.1.4 質(zhì)粒 抗體表達質(zhì)粒 pIZDHL 由美國德克薩斯大學(xué)西南醫(yī)學(xué)中心劉小云博士惠贈。

1.1.5 實驗動物 18 ~ 22 g 雌性 NOD/SCID 小鼠購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，飼養(yǎng)在 SPF 環(huán)境中。所有受試動物均可自由進水和攝食，所有實驗均按照國際公認的實驗動物照料和使用原則進行。

1.2 方法

1.2.1 Anti-CD30-IgG 的輕鏈和重鏈可變區(qū)序列設(shè)計 Anti-CD30-IgG 抗體的重鏈可變區(qū)（VH）和輕鏈可變區(qū)（VL）序列來自 anti-CD30 抗體 AC10 的 VH 和 VL 序列（美國專利 Pub. No. US2008/0267976 A1），分別在其 5' 端加入 Kozak 序列（GCCACC）和信號肽序列（輕鏈信號肽ATGGAGACAGACACACTCCTGCTATGGGTACTGCTGCTCTGGGTTCCAGGTTCCACTGGTGAC；重鏈信號肽ATGGGTTGGTCTTGTATTATCCTGT TCCTGGTCGCTACCGCCACTGGGGTCCACTCA），以增強基因的翻譯效率和蛋白的分泌表達。此外，VL 基因兩端加入I 和WI 酶切位點，VH 基因兩端加入I 和I 酶切位點。上述基因序列由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。

1.2.2 表達載體的構(gòu)建 將 VL 基因序列經(jīng)

I 和W I 雙酶切后，用1.5% 瓊脂糖凝膠電泳進行酶切產(chǎn)物分離，切下 250 ~ 500 bp 之間區(qū)域的目的 DNA 片段，并用 DNA 膠回收試劑盒純化線性目的片段。使用 T4 DNA 連接酶連接 VL 基因片段和經(jīng)I 和W I 雙酶切后的真核表達載體 pIZDHL，將獲得的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化 DH5α 感受態(tài)細胞，挑選克隆進行質(zhì)粒提取并酶切驗證 VL 基因是否成功連接，正確的質(zhì)粒命名為 pIZDHL-VL。將質(zhì)粒 pIZDHL-VL 和 VH 基因分別以I 和I 雙酶切，使用 T4 DNA 連接酶連接雙酶切后的基因片段，將獲得的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化 DH5α 感受態(tài)細胞，挑選單克隆進行質(zhì)粒提取并酶切驗證 VL 和 VH 基因是否分別連接上，并測序驗證序列的正確性。將測序正確的單克隆進行質(zhì)粒提取，將重組質(zhì)粒命名為 pIZDHL-CD30-IgG。

1.2.3 表達載體轉(zhuǎn)染 CHO/dhFr-細胞 將質(zhì)粒 pIZDHL-CD30-IgG 經(jīng)I 酶切線性化后回收，采用 Lipofectamine 3000 試劑盒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染 CHO/dhFr-細胞，然后加入博來霉素進行篩選，同時培養(yǎng)基中去除次黃嘌呤和胸腺嘧啶。由于轉(zhuǎn)染質(zhì)粒上有博來霉素抗性基因和二氫葉酸還原酶基因，只有質(zhì)粒轉(zhuǎn)染成功并整合到基因組上的細胞才能生存。經(jīng) 2 ~ 3 周的篩選，存活的細胞團即為陽性細胞，挑選表達量較高的陽性細胞運用博來霉素和有限稀釋法進行單克隆篩選。

1.2.4 ELISA 法篩選高表達細胞株 運用雙抗體夾心 ELISA 測定細胞培養(yǎng)上清中的抗體濃度。96 孔板包被羊抗人 IgG（γ 鏈特異性）抗體并用 2% BSA 封閉。標(biāo)準(zhǔn)品為人源化抗體尼妥珠單抗，將待測細胞培養(yǎng)上清和不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品加入包被的 96 孔板，37 ℃孵育 1 h，PBST 洗 3 次，加入堿性磷酸酶標(biāo)記的山羊抗人 IgG（Fc 特異性）二抗，37 ℃孵育 1 h，PBST 洗 3 次，加入顯色底物 p-NPP 試劑，室溫孵育 5 ~ 10 min，于酶標(biāo)儀檢測 405 nm 處的吸光度值。從中篩選出抗體表達量最高的一株細胞命名為 CHO-CD30-IgG，進行擴大培養(yǎng)，其表達的抗體命名為 anti-CD30-IgG。

1.2.5 Anti-CD30-IgG 的純化和鑒定 將細胞株 CHO-CD30-IgG 擴大培養(yǎng)，待其在 T75 細胞培養(yǎng)瓶中貼壁培養(yǎng)密度達到 90% 以上，1:2 的比例轉(zhuǎn)入新的 T75 培養(yǎng)瓶中貼壁培養(yǎng) 24 h，將培養(yǎng)液換成無血清培養(yǎng)基（CD OptiCHOTM培養(yǎng)液 +2 mmol/L L-谷氨酰胺），于細胞培養(yǎng)箱中持續(xù)培養(yǎng) 10 d 后收集細胞培養(yǎng)液，通過 Protein G 親和層析柱分離純化蛋白。將純化后的抗體通過 SDS-PAGE 凝膠電泳和 HPLC 法檢測抗體的純度，并用 BCA 試劑盒（標(biāo)準(zhǔn)品為牛血清免疫球蛋白 BGG）測定抗體的濃度。

1.2.6 ELISA 法檢測 anti-CD30-IgG 與重組人 CD30 抗原的親和活性 96 孔板包被重組人 CD30 抗原，濃度分別為 0.2、0.4 和 0.8 μg/ml，并用 2% BSA 封閉。加入梯度稀釋的 anti-CD30-IgG，37 ℃孵育 1 h。后續(xù)步驟同 1.2.4 所述。

1.2.7 Biacore 實驗檢測 anti-CD30-IgG 與重組人 CD30 抗原的親和常數(shù) 將 CM5 芯片偶聯(lián)山羊抗人 IgG，使其可以捕獲抗體的 Fc 段，將抗體用 HEPES 緩沖液稀釋到 1 μg/ml 并富集到芯片上。用 pH 4.5 的醋酸鈉緩沖溶液倍比稀釋 CD30 抗原，終濃度分別為 65、32.5、16.25、8.13、4.06 和 2.03 nmol/L。利用 Biacore 儀器將抗原濃度從高到低依次流過抗體表面使其結(jié)合，每個濃度完成后用 3 mol/L MgCl2溶液洗脫抗原和抗體，再重新富集抗體隨后加入抗原與之結(jié)合、解離（流速為30 μl/min）。用 Biacore T200 計算軟件處理實驗結(jié)果，得出抗原-抗體相互作用的結(jié)合速率常數(shù)、解離速率常數(shù)以及親和常數(shù)。

1.2.8 流式細胞術(shù)法檢測 anti-CD30-IgG 與腫瘤細胞的親和活性 將 200 μl細胞懸液（3 × 105個細胞）與梯度稀釋的 anti-CD30-IgG 溶液 4 ℃共孵育 1 h，1500 r/min 離心 5 min，棄上清。PBS 洗滌兩次后，加入FITC 標(biāo)記的羊抗人 IgG 于 4 ℃避光孵育 1 h，1500 r/min 離心 5 min，棄上清。PBS 洗滌兩次后用 500 μl PBS 重懸細胞，300 目尼龍濾網(wǎng)過濾后流式細胞儀檢測熒光強度。

1.2.9 免疫熒光共聚焦實驗檢測 anti-CD30-IgG 與腫瘤細胞的結(jié)合及內(nèi)吞活性 將處于對數(shù)生長期的 Karpas299、L540 和 Raji 細胞分別制成單細胞懸液，細胞計數(shù)并調(diào)整其濃度，按每孔 3 × 104個細胞分別接種于 96 孔板中，37 ℃培養(yǎng) 2 h 后加入 CD30-IgG-LDP，終濃度為 5 μg/ml，4℃孵育30 min 或 37 ℃孵育 24 h 檢測其與細胞表面抗原的結(jié)合及內(nèi)吞情況。收集細胞樣品，PBS 洗 2 次，用細胞甩片機將細胞離心至載玻片上，4% 多聚甲醛固定 10 min，PBST 洗 3 次，0.2% TritonX-100 溶液（溶劑為 PBS）透化 10 min，PBST 洗 3 次，用 5% 的羊血清室溫封閉 2 h。滴加 Alexa Fluor488標(biāo)記的抗人熒光二抗于 37 ℃孵育 30 min，PBST 洗 3 次，DAPI 染細胞核 15 min，PBST 洗 3 次，滴加抗熒光淬滅劑，蓋上蓋玻片并用指甲油將蓋玻片四周封閉，晾干后于免疫熒光共聚焦顯微鏡觀察。

1.2.10 小動物活體成像技術(shù)檢測 anti-CD30-IgG的體內(nèi)腫瘤靶向能力 將霍奇金淋巴瘤細胞 L540 和間變性大細胞淋巴瘤細胞 Karpas299 計數(shù)調(diào)整至 2.5 × 107個/ml，接種至 NOD/SCID 鼠右側(cè)腋下，每只接種 200 μl。當(dāng)腫瘤體積至 200 ~ 400 mm3，將 DyLight 680 標(biāo)記的 anti-CD30-IgG 抗體通過尾靜脈注射入荷瘤小鼠體內(nèi)（n = 2），注射劑量為 20 mg/kg。在給藥后選擇一系列時間點，利用 XENGOEN小動物活體成像儀進行觀察并于不同時間點監(jiān)測標(biāo)記抗體在荷瘤裸鼠體內(nèi)的分布情況。

2 結(jié)果

2.1 表達載體的鑒定

pIZDHL 和 pIZDHL-CD30-IgG 質(zhì)粒示意圖如圖 1 所示。對構(gòu)建的表達載體 pIZDHL-CD30-IgG 分別經(jīng)I、WI 雙酶切和I、I 雙酶切鑒定，結(jié)果如圖 2 所示。VL 和 VH 基因片段的理論長度分別為 414 bp 和 426 bp，pIZDHL-CD30-IgG 經(jīng)雙酶切后，VL 和 VH 片段的電泳條帶在 400 bp 左右，與預(yù)期一致。

2.2 ELISA 篩選高表達單克隆細胞株

將成功轉(zhuǎn)染并經(jīng) ELISA 鑒定成功表達目標(biāo)抗體的細胞進行有限稀釋，從有限稀釋的 96 孔板中挑選形態(tài)較好的單克隆進行擴大培養(yǎng)。每種單克隆細胞計數(shù)后，取 2 × 105個細胞在 1 ml 培養(yǎng)基中培養(yǎng) 96 h，然后取其上清用 ELISA 方法檢測目的抗體 anti-CD30-IgG 的表達量。如圖 3 所示，101 株單克隆細胞都表達抗體 anti-CD30-IgG，表達量各有差異，其中 63 號單克隆細胞抗體表達量在 12 mg/L以上，明顯高于其他單克隆細胞，將此細胞株命名為 CHO-CD30-IgG 并進行擴大培養(yǎng)。

圖 1 質(zhì)粒結(jié)構(gòu)示意圖（A：pIZDHL；B：pIZDHL-CD30-IgG）

Figure 1 Schematic diagrams of plasmids (A: pIZDHL; B: pIZDHL-CD30-IgG)

M1：DL15000 分子量標(biāo)準(zhǔn)；M2：DL2000 分子量標(biāo)準(zhǔn)；1~2：pIZDHL-CD30-IgG 經(jīng)Mlu I、BsiWI 雙酶切鑒定 VL 片段；3~4：pIZDHL-CD30-IgG 經(jīng)Xho I、Nhe I 雙酶切鑒定 VH 片段

Figure 2 Determination of plasmid pIZDHL-CD30-IgG by agarose gel electrophoresis (A: Analysis of pIZDHL-CD30-IgG after being digested withI andWI; B: Analysis of pIZDHL-CD30-IgG after being digested withI andI)

圖 3 不同單克隆細胞中 anti-CD30-IgG 表達量的篩選結(jié)果

Figure 3 The expression levels of anti-CD30-IgG in single cell clones

M：蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)；1：Anti-CD30-IgG 非還原電泳條帶；2：Anti-CD30-IgG 還原電泳條帶；WB：抗人 IgG 二抗探針檢測抗體重鏈和輕鏈的結(jié)果

M: Protein marker; 1: Anti-CD30-IgG under non-reducing condition; 2: Anti-CD30-IgG under reducing condition; WB: Heavy chains and light chains detected by anti-human IgG

圖 4 SDS-PAGE、Western blot（A）和 HPLC（B）分析 anti-CD30-IgG 的表達純化結(jié)果

Figure 4 Analysis of purified anti-CD30-IgG by SDS-PAGE, Western blot (A) and HPLC (B)

圖 5 ELISA（A）、Biacore（B）和流式細胞術(shù)法（C）檢測 anti-CD30-IgG 的親和活性

Figure 5 Binding affinity analysis of anti-CD30-IgG by ELISA (A), Biacore (B) and flow cytometry (C)

2.3 Anti-CD30-IgG 的純化和純度分析

將對數(shù)生長期的 CHO-CD30-IgG 細胞培養(yǎng)基更換為無血清培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng) 10 d 后收集上清，上清中的抗體經(jīng) Protein G 親和層析柱純化，抗體產(chǎn)量約為 20 mg/L。利用 SDS-PAGE 凝膠電泳鑒定抗體的純度和結(jié)構(gòu)，如圖 4A 所示，非還原狀態(tài)下，抗體為單一的完整條帶，分子量在 150 kD 左右；還原狀態(tài)下，抗體鏈間二硫鍵斷裂，表現(xiàn)為輕鏈和重鏈兩條帶，分子量在 25 kD 和 50 kD 左右，與理論大小相符。通過 HPLC 更加直觀地檢測抗體的純度，在 280 nm 波長下顯示為單一蛋白峰，其純度在 98% 以上（圖 4B）。

2.4 Anti-CD30-IgG 的親和活性分析

2.4.1 Anti-CD30-IgG 與重組人 CD30 抗原的親和活性 ELISA 實驗檢測anti-CD30-IgG 與重組人 CD30 抗原的結(jié)合活性。如圖 5A 所示，不同濃度的 anti-CD30-IgG 分別與 0.2、0.4 和 0.8 μg/ml CD30 結(jié)合，均呈現(xiàn)典型的 S 型曲線，在抗原-抗體結(jié)合未飽和情況下，其相互結(jié)合具有抗體濃度依賴性和抗原濃度依賴性。進一步通過 Biacore 實驗計算抗原-抗體的親和常數(shù)，兩者的結(jié)合、解離曲線如圖 5B 所示，anti-CD30-IgG 與重組人 CD30 抗原的親和速率常數(shù)（k）為 4.61 × 105L/(mol·s)，解離速率常數(shù)（k）為 1.10 × 10-3/s，親和常數(shù)（K=k/k）為 4.15 × 108L/mol。

圖 6 Anti-CD30-IgG 與 L540 細胞（A）、Karpas299（B）、Raji 細胞（C）的結(jié)合和內(nèi)吞（× 630）（4 ℃ 下 Anti-CD30-IgG 與 CD30 陽性的 L540 細胞、Karpas299 細胞表面結(jié)合，37 ℃ 下被內(nèi)吞進入細胞；與 CD30 陰性的 Raji 細胞無結(jié)合；綠色熒光 Alexa Fluor 488 標(biāo)記 anti-CD30-IgG）

Figure 6 Binding and internalization of anti-CD30-IgG by L540 (A)，Karpas299 (B) and Raji cells (C) (× 630) [Cell surface binding of anti-CD30-IgG was shown by incubating L540 and Karpas299 with Alexa Fluor 488-labeled anti-CD30-IgG (green) at 4 ℃ and internalization was allowed by incubating at 37 ℃; No binding of anti-CD30-IgG was detected when incubated with the CD30-negative Raji cells]

2.4.2 Anti-CD30-IgG 與腫瘤細胞的親和活性 流式細胞術(shù)法檢測不同濃度的anti-CD30-LDP（0.001 ~ 3 μg/ml）與 CD30 表達量不同的腫瘤細胞的親和活性。本實驗選取霍奇金淋巴瘤 L540 和 L428、間變性大細胞淋巴瘤 Karpas299 和 SU-DHL-1 及人 Burkitt 淋巴瘤細胞系 Raji，其中 L540 和 Karpas299 細胞 CD30 表達量較高，SU-DHL-1 和 L428 細胞 CD30 表達量較低，而 Raji 細胞不表達 CD30[13]。如圖 5C 所示，anti-CD30-IgG 與 CD30 陽性細胞具有很好的結(jié)合能力，其結(jié)合能力的強弱與細胞表面抗原 CD30 的表達量有關(guān)。此外，anti-CD30-IgG 與 CD30 陰性細胞 Raji 不結(jié)合，表明其與抗原或細胞的識別具有特異性。

2.5 Anti-CD30-IgG 通過內(nèi)吞進入腫瘤細胞

通過免疫熒光共聚焦實驗觀察 anti-CD30-IgG 在腫瘤細胞的定位。如圖 6 所示，4 ℃共孵育條件下，anti-CD30-IgG 可與 L540 和 Karpas299 細胞表面結(jié)合，而與 Raji 細胞不結(jié)合，表明 anti-CD30-IgG 可特異性地與抗原 CD30 結(jié)合。而在 37 ℃共孵育條件下，L540 和 Karpas299 細胞內(nèi)可觀察到綠色熒光顆粒（Alexa Fluor 488 標(biāo)記的 anti-CD30-IgG），表明抗體可通過細胞表面 CD30 受體介導(dǎo)的內(nèi)吞進入細胞。

2.6 Anti-CD30-IgG 在小鼠體內(nèi)的腫瘤靶向性

利用小動物活體熒光成像技術(shù)實時監(jiān)測 anti-CD30-IgG 分別在 NOD/SCID 鼠 Karpas299 和 L540 移植瘤模型中的分布和富集情況。如圖 7 所示，尾靜脈注射后 6 h，DyLight 680 標(biāo)記的 anti-CD30-IgG 在腫瘤部位開始富集。在 L540 小鼠移植瘤模型中，12 ~ 96 h 熒光信號富集程度較強，96 h 左右熒光開始減弱，腫瘤部位的熒光信號可持續(xù) 5 d 以上。而 Karpas299 小鼠移植瘤模型中，熒光信號的富集時間相對較短，48 h 后熒光開始減弱，但仍可持續(xù) 3 d 以上。以上結(jié)果表明，在小鼠移植瘤模型中，anti-CD30-IgG 可以選擇性地富集并滯留在腫瘤部位，提示 anti-CD30-IgG 可作為化療藥物的靶向輸送載體。

3 討論

近十幾年，腫瘤靶向性單克隆抗體的發(fā)展改變了惡性腫瘤治療的模式。但是，大多數(shù)單抗藥物單獨使用抗腫瘤活性有限，而 ADCs 是將單克隆抗體與高效細胞毒藥物通過化學(xué)接頭連接在一起，由于具有高效、低毒的特點使其在腫瘤治療領(lǐng)域越來越受到關(guān)注[10, 14]。在 ADCs 的研究中，選擇合適的靶點和有效的抗體是首要環(huán)節(jié)。

作為靶點的抗原需是在腫瘤細胞過表達或特異性表達，具有細胞外表位，并且與特異性抗體結(jié)合后可被內(nèi)吞進入胞內(nèi)從而使得“彈頭”藥物在細胞內(nèi)發(fā)揮細胞毒作用，這些都是 ADCs 發(fā)揮抗腫瘤活性和實現(xiàn)機體耐受性的重要條件[15-16]。CD30 抗原在 HL 和 ALCL 細胞的特異性表達使其成為 ADCs 的理想靶點，靶向 CD30 的 ADC 藥物 BV 在臨床應(yīng)用中展現(xiàn)了良好的治療效果和安全性[8-9]。本研究通過已知的可變區(qū)序列，構(gòu)建并篩選得到重組抗 CD30 的嵌合抗體 anti-CD30-IgG，體外實驗證明其與重組人 CD30 抗原和 CD30 陽性腫瘤細胞都具有很好的特異性和親和性，并且可通過受體CD30 介導(dǎo)的內(nèi)吞被轉(zhuǎn)運至細胞內(nèi)。此外，在小鼠移植瘤模型中，anti-CD30-IgG 具有很好的腫瘤靶向性。以上研究結(jié)果均表明 anti-CD30-IgG 可作為新型 ADCs 的有效載體。

圖 7 小動物活體成像分析 DyLight 680 標(biāo)記的 anti-CD30-IgG 在荷瘤鼠體內(nèi)的分布

Figure 7optical imaging of DyLight 680-labeled anti-CD30-IgG in L540 and Karpas299 xenografts

當(dāng)前，研發(fā)高效、低毒的腫瘤靶向性藥物已成為全球抗腫瘤藥物的發(fā)展趨勢，抗體藥物或抗體偶聯(lián)藥物由于其特異性和靶向性備受研究者青睞，而選擇具有較高腫瘤親和性和特異性的單克隆抗體是 ADCs 發(fā)揮高效、低毒活性關(guān)鍵因素之一。本研究制備了抗 CD30 單克隆抗體 anti-CD30-IgG，并證實其高效親和性、特異性、可被內(nèi)吞進入腫瘤細胞內(nèi)部和在小鼠體內(nèi)腫瘤靶向性等特點符合作為 ADCs 藥物高效運輸載體的條件。在此基礎(chǔ)上，我們下一步工作是將 anti-CD30-IgG 與高效“彈頭”藥物偶聯(lián)或融合制備新型 ADC，為 HL 和 ALCL 等血液惡性腫瘤的治療研發(fā)有發(fā)展前景的候選藥物。

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Preparation and activity study of an anti-CD30 monoclonal antibody

WANG Rong, LI Liang, ZHANG Sheng-hua, ZHEN Yong-su, MIAO Qing-fang

Author Affiliation: Department of Oncology, Institute of Medicinal Biotechnology, Chinese Academy of Medical Science & Peking Union Medical College, Beijing 100050, China

The aim of this study is to prepare an anti-CD30 monoclonal antibody and investigate its activity, by which we provide an evaluation for its use as a drug carrier in antibody-drug conjugates.

The eukaryotic expression vector of pIZDHL-CD30-IgG was constructed by genetic engineering, and transfected into CHO/dhFr-cells to obtain the single cell clones which stably expressed the antibody of anti-CD30-IgG. Anti-CD30-IgG was purified using affinity chromatography and its purity was detected by HPLC. The antigen-binding activity of anti-CD30-IgG was analyzed by ELISA, Biacore and flow cytometry and its internalization in tumor cells was observed by immunofluorescence confocal microscopy. Thetumor-targeting ability of anti-CD30-IgG was monitored by living images.

In this study, we constructed the expression vector of anti-CD30-IgG and selected the CHO single cell clone which successfully expressed high level of anti-CD30-IgG. After purification, we obtained the antibody of anti-CD30-IgG with purity of more than 98%. Anti-CD30-IgG showed specific and high affinity binding to recombinant CD30 with the affinity constant of 4.15 × 108L/mol. Besides, it could bind to CD30+cancer cells and be internalized into target cells through the antigen-mediated endocytosis. Anti-CD30-IgG also exhibited excellent tumor-targeting capability in L540 and Karpas299 xenograft models.

Anti-CD30-IgG shows attractive specificity and affinity to CD30 antigen and it can be internalized into CD30+tumor cells. Anti-CD30-IgG selectively targets tumor tissues in NOD/SCID mice xenograft models. Taken together, anti-CD30-IgG is an appropriate targeted vehicle for the delivery of cytotoxic payloads in antibody-drug conjugates.

Antigens, CD30; Antibodies, monoclonal; Hodgkin disease; Large-cell, anaplastic

MIAO Qing-fang, Email: miaoqf@sina.com

10.3969/j.issn.1673-713X.2018.05.002

“重大新藥創(chuàng)制”國家科技重大專項（2014ZX09201042-003）；中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)與健康科技創(chuàng)新工程（2016-I2M-3-013）

苗慶芳，Email：miaoqf@sina.com

2018-05-09