低 C／N 馴化生物絮團的自養(yǎng)和異養(yǎng)硝化性能研究

王 濤，劉青松，段亞飛，李 華，董宏標，張家松，3

（1．中國水產(chǎn)科學研究院南海水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部南海漁業(yè)資源開發(fā)利用重點實驗室，廣東廣州 510300；2．水產(chǎn)科學國家級實驗教學示范中心，上海水產(chǎn)養(yǎng)殖工程技術研究中心，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部魚類營養(yǎng)與環(huán)境生態(tài)研究中心（上海海洋大學），上海 201306；3．中國水產(chǎn)科學研究院南海水產(chǎn)研究所深圳試驗基地，廣東深圳 518121）

中國是世界水產(chǎn)養(yǎng)殖大國，養(yǎng)殖過程中殘餌和糞便及其被微生物分解產(chǎn)生的氨氮N）、亞硝酸鹽氮和硝酸鹽氮等無機氮大量排放是造成養(yǎng)殖水質(zhì)惡化、病害頻發(fā)的重要因素［1－4］。為解決這一問題，利用生物絮團技術（biofloc technology）調(diào)控養(yǎng)殖水質(zhì)以減少換水的養(yǎng)殖模式提供了新的思路［5－7］。

生物絮團對養(yǎng)殖水中有害氮的去除，與絮團內(nèi)的微生物菌群結(jié)構密切相關，主要包括同化、自養(yǎng)硝化、異養(yǎng)硝化、反硝化等生化過程［8－9］?，F(xiàn)有的生物絮團培養(yǎng)方式，大多通過調(diào)控C／N大于15來富集培養(yǎng)異養(yǎng)微生物，有害氮素去除以同化作用和異養(yǎng)硝化作用為主［10－11］。近年來，有研究者提出定向馴化自養(yǎng)硝化型生物絮團，以減少外碳源添加和溶解氧（DO）消耗，節(jié)約成本［12］。有研究表明，水產(chǎn)養(yǎng)殖系統(tǒng)中，超過50%的投喂飼料以殘餌、糞便等形式排入水體，經(jīng)微生物分解釋放的化學需氧量（COD）占飼料的39%～44%［13－14］。養(yǎng)殖水體中碳源的含量與飼料組分密切相關，商品魚蝦配合飼料中蛋白質(zhì)含量為35%時，C／N比值為8．9；蛋白質(zhì)含量為30%時，C／N比值為10．4；蛋白質(zhì)含量為25%時，C／N比值為12．5［15］。一般認為，自養(yǎng)硝化細菌的硝化活性比異養(yǎng)菌高103～104倍，而異養(yǎng)硝化菌生長速率快，在環(huán)境中的數(shù)量大，可彌補異養(yǎng)硝化菌活性低的不足［16］。因此，以低 C／N條件馴化的生物絮團，其自養(yǎng)硝化和異養(yǎng)硝化作用對有害氮素的去除效能哪種更高，很值得進一步研究。

本實驗接種羅非魚養(yǎng)殖池的生物絮團，以高蛋白飼料為氮源，赤砂糖為碳源，并通過逐漸降低赤砂糖添加量，調(diào)節(jié)C／N逐步從15降至7．9，以模擬養(yǎng)殖水體中相對較低的C／N環(huán)境，進行馴化培養(yǎng)。在此基礎上，對其自養(yǎng)硝化和異養(yǎng)硝化兩種生化過程的存在情況進行研究，并對其氮去除效能進行綜合評價，以期為生物絮團脫氮功能菌定向培養(yǎng)及其在養(yǎng)殖水處理中的應用提供參考。

1 材料與方法

1．1 實驗裝置與菌種來源

硝化性能實驗于有效容積28 L的圓筒型有機玻璃反應器（圖1－A）中進行，好氧反硝化性能實驗采用3個有效容積3 L的抽濾瓶（圖1－B），硝化反應和好氧反硝化反應過程均采用功率為100 W、曝氣量40 L·min－1的增氧泵（日生LP100）進行曝氣。每個反應設置3組平行，結(jié)果取平均值進行計算統(tǒng)計。

圖1 實驗裝置圖Fig．1 Experimental device diagram

初始所用菌種取自工廠化羅非魚養(yǎng)殖系統(tǒng)的生物絮團，投加飼料（C：43．64%，N：7．81%，粗蛋白含量≥48%）進行培養(yǎng)，添加量以實際養(yǎng)殖情況下生物絮團處理的有機氮負荷進行核算，為0．1 g·g－1（即每克生物絮團添加 0．1 g飼料），以赤砂糖（C：36．28%）為外加碳源，通過調(diào)節(jié)赤砂糖和飼料質(zhì)量比來調(diào)控C／N，進行為期240 d的馴化培養(yǎng)。整個馴化過程分為3個階段：第一階段為0～30 d，C／N維持在15左右（赤砂糖∶飼料≈2∶1）；第二階段為 30～90 d，C／N維持在10．5（赤砂糖∶飼料≈1∶1）；第三階段為 90～240 d，C／N為7．9（赤砂糖∶飼料≈0．5∶1）。水質(zhì)檢測結(jié)果顯示，整個馴化周期內(nèi)NH4＋-N維持在0．50 mg·L－1以下，NO2－-N在 0．10 mg·L－1左右波動，可以滿足養(yǎng)殖水質(zhì)要求［17－19］。

1．2 實驗方法

1．2．1 自養(yǎng)硝化性能實驗

1）取3份20 L經(jīng)富集培養(yǎng)的生物絮團，測定其特性為：絮團懸浮物固體濃度（MLSS）＝2860 mg·L－1，絮團懸浮物揮發(fā)性固體濃度（MLVSS）＝2 077 mg·L－1，污泥體積指數(shù)（SVI）＝43．70 mg·L－1，污泥沉降比（SV）＝12．50%，MLVSS／MLSS＝72．61%。用自來水反復沖洗5次，移入圖1－A所示反應器中，饑餓處理12 h后，以NH4Cl為氮源，調(diào)整 NH4＋-N 約 為 8．00 mg·L－1。定時監(jiān)測反應器中三氮（NH4＋-N、NO2－-N、NO3－-N，下同）及 pH、DO、COD、堿度等變化情況，以測定生物絮團的自養(yǎng)氨氧化（autotrophic ammonia oxidation，AN-AO）性能。

2）取3份20 L經(jīng)富集培養(yǎng)的生物絮團，測定其特性為：MLSS＝2 547 mg·L－1，MLVSS＝1 768 mg·L－1，SVI＝50．38 mL·g－1，SV＝12．83%，MLVSS／MLSS＝69．42%。用自來水反復沖洗5次，移入圖1－A所示反應器中，饑餓處理12 h后，以NaNO2為氮源，調(diào)整NO2－-N約為10．00 mg·L－1。定時監(jiān)測反應器中三氮及pH、DO、COD、堿度等變化情況，以測定生物絮團的自養(yǎng)亞硝酸鹽氧化（autotrophic nitrite oxidation，AN-NO）性能。

1．2．2 異養(yǎng)硝化性能實驗

取3份20 L經(jīng)富集培養(yǎng)的生物絮團，測定其特性為：MLSS＝2 777 mg·L－1，MLVSS＝1 853 mg·L－1，SVI＝44．41 mL·g－1，SV＝12．33%，MLVSS／MLSS＝66．73%。用自來水反復沖洗5次，移入圖1－A所示反應器中，饑餓處理12 h后，以NH4Cl為氮源、赤砂糖為碳源，調(diào)節(jié)C／N至16，NH4＋-N初始濃度 8．00 mg·L－1。定時監(jiān)測反應器中三氮及pH、DO、COD、堿度等變化情況，以測定異養(yǎng)氨氧化（heterotrophic ammonia oxidation，HN-AO）性能。

1．2．3 好氧反硝化

取2 L經(jīng)富集培養(yǎng)的生物絮團，測定其特性為：MLSS＝3 977 mg·L－1，MLVSS＝2 383 mg·L－1，SVI＝46．10 mL·g－1，SV＝18．33%，MLVSS／MLSS＝59．92%。用自來水反復沖洗清洗5次，移入圖1－B所示反應器中，以NaNO3為氮源，赤砂糖為碳源，調(diào)節(jié)C／N至16，-N質(zhì)量濃度約20 mg·L－1。定時監(jiān)測反應器中-N、NO3－-N及pH、DO、COD、堿度等變化情況，以測定生物絮團的好氧反硝化（aerobic denitrification，AD）性能。

1．3 檢測指標及方法

1．3．1 檢測分析NH4＋-N：水楊酸法（哈希氰尿酸-水楊酸試劑粉包）；：N-（1-萘基）-乙二胺光度法；：麝香草芬分光光度法；COD：重鉻酸鉀氧化法；總堿度：微量滴定法；MLSS：恒量稱重法；SV：沉降法；MLVSS：高溫灼燒法；pH、DO、T：哈希HQ40D多參數(shù)溶氧儀［20］。

2）比氨氧化速率（special ammonia oxidizing rate，SAOR）、比亞硝酸鹽氮氧化速率（special nitrite oxidizing rate，SNOR）、比硝酸鹽還原速率（special nitrate reduction rate，SNiRR）依據(jù)下式計算［22－24］：

2 結(jié)果與分析

2．1 自養(yǎng)硝化性能

2．1．1 自養(yǎng)氨氧化性能

生物絮團自養(yǎng)氨氧化性能如圖2所示。從圖2可以看出，NH4＋-N質(zhì)量濃度隨時間延長呈快速降低趨勢，6 h時，質(zhì)量濃度由7．06 mg·L－1降至 0．47 mg·L－1，ARE為 93．42%；至8 h時，濃度維持在 0．21 mg·L－1，ARE達 97．10%。NO2－-N濃度隨時間延長出現(xiàn)輕微升高，至4 h時達到峰值，為 0．44 mg·L－1；隨后開始降解，8 h時降至0．02 mg·L－1。作為硝化反應的最終產(chǎn)物，隨降解而逐漸累積，從0 h的 5．28 mg·L－1升至 8 h的 14．51 mg·L－1。DO、pH變化情況如圖3所示，DO在整個實驗過程中基本穩(wěn)定，均大于 8．00 mg·L－1，處于高DO狀態(tài)；pH從0到8 h出現(xiàn)了一定程度的降低。

圖2 自養(yǎng)氨氧化性能Fig．2 Performance of AN-AO

圖3 自養(yǎng)氨氧化DO和pH變化Fig．3 Dynam ics of DO and pH in the AN-AO

2．1．2 自養(yǎng)亞硝酸鹽氧化性能

圖4 亞硝酸鹽氧化性能Fig．4 Performance of AN-NO

圖5 亞硝酸鹽氧化DO和pH變化Fig．5 Dynam ics of DO and pH in the AN-NO

2．2 異養(yǎng)硝化性能

2．2．1 異養(yǎng)硝化性能實驗

圖6反映了微生物以赤砂糖為外加碳源、氯化銨為氮源時，反應器內(nèi)三氮、ARE和（和的 積 累 量 與的轉(zhuǎn)化量之比）的變化情況?？梢园l(fā)現(xiàn)，生物絮團表現(xiàn)出良好的去除性能。經(jīng)過2．5 h反應，質(zhì)量濃度降至0．03 mg·L－1，ARE接近100．00%。在0．5 h內(nèi)上升至2．62mg·L－1，后又快速降低，在3 h降低至0 mg·L－1。呈現(xiàn)先降低后升高，最后趨于平穩(wěn)，前0．5 h從初始質(zhì)量濃度的4．37 mg·L－1降低到3．03 mg·L－1；0．5 h后開始緩慢上升，至2．5 h濃度增加至 6．08 mg·L－1而趨于平穩(wěn)狀態(tài)。而的變化情況為在0．5 h達到最高值0．71，后逐漸降低，直至8 h，的積累量比轉(zhuǎn)化量為0．23。

由圖7中DO與pH變化情況表示，加入碳源，系統(tǒng)中DO和pH快速降低。隨著反應的進行，DO和pH值曲線出現(xiàn)相吻合的特征凹點（分別標記為C和c），0．5 h后又趨于平穩(wěn)。

2．2．2 好氧反硝化

圖9為pH和DO的變化情況。DO在反應開始階段迅速降低，0．2 h降至最低，從7．93 mg·L－1降至 6．28 mg·L－1，而后開始逐漸升高，至2 h時升至接近初始值。pH出現(xiàn)些微下降，至0．4 h從7．39降至最低值 7．02，0．4 h以后又開始緩慢升高，2 h時升至7．51。

圖6 異養(yǎng)硝化性能Fig．6 Performance of HN-AO

圖7 異養(yǎng)硝化DO和pH變化Fig．7 Dynam ics of DO and pH in the HN-AO

圖8 好氧反硝化性能Fig．8 Performance of AD

圖9 好氧反硝化DO和pH變化Fig．9 Dynam ics of DO and pH in the AD

2．3 自養(yǎng)和異養(yǎng)硝化特性對比

2．3．1 氮降解速率、NiAR和 TIN去除

如圖10所示，以氮化合物滿足養(yǎng)殖水質(zhì)要求時為終止點，各氮化合物濃度與反應時間均呈現(xiàn)線性相關關系，自養(yǎng)氨氧化、自養(yǎng)亞硝酸鹽氧化、異養(yǎng)氨氧化與時間相關性 R2分別為0．99、0．99和0．98（P＜0．05）。

圖11－A為自養(yǎng)硝化與異養(yǎng)硝化過程中NiAR隨時間的變化情況。異養(yǎng)硝化過程中，NO2－-N積累明顯，在0．5 h時NiAR達到峰值，為46．37%，而后開始降低，2．5 h約降為0。自養(yǎng)硝化過程，NO2－-N沒有明顯的積累，4 h時NiAR達到最大值，但僅為3．31%。

圖11－B是不同反應過程中TIN的變化情況，異養(yǎng)硝化過程的TIN去除率遠大于自養(yǎng)氨氧化過程。自養(yǎng)氨氧化過程中，反應結(jié)束時的TIN為14．73 mg·L－1，較初始的 12．82 mg·L－1略高；亞硝酸鹽氧化過程TIN從初始濃度12．94 mg·L－1降至 11．80 mg·L－1，去除率為 8．81%；而異養(yǎng)硝化過程 TIN從 11．10 mg·L－1降至 5．96 mg·L－1，去除率達 53．69%。

圖10 氮素降解速率Fig．10 Nitrogen degradation rate

圖11 亞硝酸鹽氮積累率和總無機氮去除率Fig．11 NiAR accumulation rate and TIN removal rate

2．3．2 堿度和 COD的消耗

圖12－A為自養(yǎng)硝化與異養(yǎng)硝化過程中堿度消耗情況。從圖12－A中可見，自養(yǎng)硝化、亞硝酸鹽氧化及異養(yǎng)硝化堿度初始值分別為128．20 mg·L－1、109．87 mg· L－1及 122．25 mg·L－1（以 CaCO3計），實驗結(jié)束時，分別為98．30 mg·L－1、84．01 mg·L－1及 99．32 mg·L－1。根據(jù) NH4＋-N、NO2－-N降解量及堿度的消耗量，可核算得到每降解1 g NH4＋-N，自養(yǎng)硝化、亞硝酸鹽氧化和異養(yǎng)硝化過程分別消耗4．30 g、2．49 g和3．34 g堿度。

圖12－B反映了不同反應過程中COD消耗情況。自養(yǎng)氨氧化和亞硝酸鹽氧化過程無外加碳源，僅對反應器中殘留的COD進行消耗，COD從初始的 40．14 mg·L－1和 35．14 mg·L－1分別下降到結(jié)束時的 23．95 mg·L－1和 11．57 mg·L－1。而異養(yǎng)硝化過程COD從初始的154．43 mg·L－1降至 24．90 mg·L－1。

圖12 堿度和COD的消耗對比Fig．12 Comparison of alkalinity and COD consumption

3 討論

3．1 自養(yǎng)硝化性能

本實驗研究結(jié)果說明了以低C／N馴化的生物絮團具有較好的全程硝化性能，NO2－-N累積量少，自養(yǎng)氨氧化實驗期間質(zhì)量濃度變化均在羅非魚可承受范圍內(nèi)·L－1）［17－18］，pH降低程度大于自養(yǎng)亞硝酸鹽氧化過程，需進行調(diào)節(jié)，該現(xiàn)象可能是因為絮團微生物細胞合成時，全程硝化的生化反應過程分為兩階段，反應式如下［25］：

式（4）～式（5）中：C5H7NO2代表微生物菌體的化學方程式，硝化反應對堿度的消耗主要發(fā)生在第一階段，即自養(yǎng)氨氧化過程微生物需要消耗更多的堿度，導致該階段pH降低程度多于自養(yǎng)亞硝酸鹽氧化過程。自養(yǎng)硝化性能實驗的氨氮降解情況也表明以低C／N馴化生物絮團可以定向富集出自養(yǎng)硝化菌。

3．2 異養(yǎng)硝化性能

對于異養(yǎng)硝化反應過程中，DO和pH出現(xiàn)相吻合的最低值C和c。主要是由于反應初期，COD充足，生物絮團中的異養(yǎng)微生物呼吸代謝旺盛，消耗了大量的DO，使得水中復氧速率小于DO的消耗速率，導致DO降低，而呼吸作用加劇意味著會釋放出更多的CO2，溶于水體，導致水體pH下降。隨著水中COD的消耗，微生物呼吸作用減緩，DO消耗降低，水中復氧速率大于DO消耗速率，DO濃度上升，直至恢復初始水平，而實驗過程中采用氣泵增氧對微生物呼出CO2存在吹脫作用，系統(tǒng)中CO2的量減少，可能是使得pH再次上升的原因。

另外，為了研究2．2．1所述異養(yǎng)硝化反應前期NO3－-N質(zhì)量濃度下降以及反應過程中降低的問題，開展了在初始DO維持8．00 mg·L－1條件下，以赤砂糖為碳源，NaNO3為氮源進行好氧反硝化實驗驗證。實驗研究得到 NaRE為27．85%，這說明在 COD和存在的情況下，本實驗中馴化的生物絮團存在好氧反硝化作用。因為好氧反硝化過程會補充部分堿度，導致該過程pH波動小于異養(yǎng)硝化過程。劉文暢等［30］以生物絮團反應器作為中試規(guī)模循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)的唯一水處理裝置時，發(fā)現(xiàn)了好氧反硝化優(yōu)勢菌種Hydrogenophaga和Terrimonas，也表明生物絮團中好氧反硝化是有可能存在的。

3．3 自養(yǎng)硝化和異養(yǎng)硝化特性對比

自養(yǎng)硝化和異養(yǎng)硝化對無機氮均有著良好的降解效能。為進一步對比自養(yǎng)和異養(yǎng)過程中氮的去除速率，本實驗對反應過程中各形態(tài)氮濃度隨時間的變化規(guī)律進行線性擬合。在此基礎上計算自養(yǎng) SAOR、SNOR和異養(yǎng)SAOR分別為13．17 mg·（gVSS·d）－1、29．20 mg·（gVSS·d）－1和40．28 mg·（gVSS·d）－1。由此可見，在自養(yǎng)硝化過程中，SAOR＜SNOR，氨氧化過程為自養(yǎng)硝化反應的限速步驟，這解釋了圖2中NO2－-

N基本無累積的現(xiàn)象。異養(yǎng)SAOR為自養(yǎng)SAOR的3．06倍，即異養(yǎng)硝化過程可實現(xiàn)NH4＋-N的快速降解。然而，異養(yǎng)硝化過程中NiAR會出現(xiàn)快速積累現(xiàn)象，而自養(yǎng)硝化不會出現(xiàn)明顯的積累。這說明添加碳源的異養(yǎng)硝化過程中，碳源的存在可能會短暫抑制NO2－-N的氧化，而當碳源被異養(yǎng)硝化菌利用后，NO2－-N才開始被氧化。也有可能加入碳源后，亞硝酸鹽氧化菌代謝通路會受到一定的影響，導致響應時間增長，出現(xiàn)了前期的積累。

對比自養(yǎng)硝化和異養(yǎng)硝化TIN變化情況，發(fā)現(xiàn)自養(yǎng)氨氧化TIN結(jié)束值高于初始值，分析原因可能為反應初始階段為微生物對NH4＋-N的吸附階段，從而使測得的TIN比實際值偏低。隨后微生物對所吸附含氮化合物的釋放，使得后續(xù)測得TIN值較初始值略高［31］。亞硝酸鹽氮氧化過程TIN去除率僅為8．81%，而異養(yǎng)硝化過程TIN去除率為53．69%。這主要是由于在有機碳源存在條件下，異養(yǎng)硝化產(chǎn)生了NO3－-N可能會使好氧反硝化作用繼續(xù)發(fā)生。異養(yǎng)硝化和好氧反硝化的耦合反應，有利于養(yǎng)殖水中無機氮的徹底脫除。自養(yǎng)硝化-好氧反硝化這一反應特性可能也是導致異養(yǎng)硝化堿度消耗低于自養(yǎng)硝化的原因，因為多數(shù)異養(yǎng)硝化菌亦是好氧反硝化菌，反硝化過程產(chǎn)生堿度，在一定程度上補充硝化過程中消耗的堿度［26］。一般來說，生物絮團培養(yǎng)過程中，為了提高氮轉(zhuǎn)化效率，堿度需提高至150 mg·L－1以上［32］。FURTADO等［33－34］研究證實水體堿度低于100 mg·L－1時，不利于生物絮團系統(tǒng)中硝化菌的硝化反應，而150～300 mg·L－1的堿度水平更利于生物絮團的形成及硝化菌落的建立。

綜上，從環(huán)境效益的角度分析，異養(yǎng)硝化對NH4＋-N去除速率快，且和好氧反硝化有耦合反應，有利于養(yǎng)殖水中無機氮素的徹底脫除，降低養(yǎng)殖水的富營養(yǎng)化潛勢。從經(jīng)濟效益的角度分析，異養(yǎng)硝化反應過程DO波動劇烈，意味著原位處理養(yǎng)殖水的情況下，為保證養(yǎng)殖生物安全，需要更多DO供給，電耗更高。此外，異養(yǎng)硝化能節(jié)約一定的堿度添加量，但需要消耗大量外加碳源。鑒于此，如何優(yōu)化現(xiàn)有的生物絮團養(yǎng)殖工藝，調(diào)控自養(yǎng)和異養(yǎng)硝化比例，實現(xiàn)環(huán)境效益和經(jīng)濟效益兼顧，還需進一步研究。

4 小結(jié)

1）低C／N馴化培養(yǎng)的生物絮團具有優(yōu)良的無機氮去除效能。最終AN與HN-AD的ARE分別為97．10%、100．00%，NiRE為100．00%。

2）生物絮團的HN對NH4＋-N的降解速率要快于 AN，自養(yǎng) AOR、NOR和異養(yǎng) AOR分別為1．14 mg·（L·h）－1、2．15 mg·（L·h）－1、3．11 mg·（L·h）－1；HN-AD的耦合作用，有利于養(yǎng)殖水中無機氮的徹底脫除。