飼料過氧化水平對雙齒圍沙蠶生長、體組成及抗氧化指標(biāo)的影響

呂 富，聶 慶，呂林蘭，趙衛(wèi)紅

（鹽城工學(xué)院海洋與生物工程學(xué)院海洋科學(xué)與技術(shù)系，江蘇省海洋灘涂生物化學(xué)與生物技術(shù)重點建設(shè)實驗室，江蘇省灘涂池塘養(yǎng)殖生態(tài)重點實驗室，江蘇鹽城 224051）

脂肪是水產(chǎn)動物飼料中不可缺少的重要營養(yǎng)素之一［1］。飼料中添加適量脂肪可提高飼料的適口性，促進水產(chǎn)動物生長，并可提高飼料轉(zhuǎn)化效率，節(jié)約飼料蛋白［2］。但油脂及含油脂產(chǎn)品中的多不飽和脂肪酸（PUFA）很容易氧化變質(zhì)，產(chǎn)生具有細(xì)胞毒性的脂質(zhì)過氧化物及不良?xì)馕兜娜?、酮等次生產(chǎn)物，對生物體產(chǎn)生危害［3］。一些研究表明，氧化油脂對水產(chǎn)動物的危害，有時會遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于油脂本身的營養(yǎng)作用［4－5］。

雙齒圍沙蠶（Perinereis aibuhitensis）隸屬于沙蠶科，圍沙蠶屬，是我國沿海潮間帶底棲多毛類的主要代表［6］，其在醫(yī)療保?。?］、水產(chǎn)養(yǎng)殖及垂釣等方面具有重要作用。近年來隨著其苗種繁育和養(yǎng)殖技術(shù)的突破，已迅速成為我國重要的海水養(yǎng)殖經(jīng)濟動物。雙齒圍沙蠶飼料的適宜脂肪水平高達(dá)9．8%［8］，在儲存過程中難免會發(fā)生氧化。本實驗研究了不同過氧化水平的飼料對雙齒圍沙蠶生長性能、體組成和抗氧化指標(biāo)的影響，旨在探討飼料過氧化對雙齒圍沙蠶的危害性及其飼料過氧化值的允許范圍。

1 材料與方法

1．1 實驗飼料

以白魚粉、豆粕和花生粕為蛋白源，玉米淀粉為主要糖源，不同氧化程度的魚油為脂肪源，制備6種過氧化水平的等氮等脂沙蠶配合飼料。不同氧化程度魚油系采用新鮮魚油（fresh fish oil，F(xiàn)FO）和氧化魚油（oxidized fish oil，OFO）按照一定比例調(diào)配而成，其中飼料Ⅰ添加8%FFO、飼料Ⅱ添加6．4%FFO＋1．6%OFO、飼料Ⅲ添加4．8%FFO＋3．2%OFO、飼料Ⅳ添加 3．2%FFO＋4．8%OFO、飼料Ⅴ添加 1．6%FFO＋6．4%OFO、飼料Ⅵ添加8%OFO，具體成分及組成見表1。

參照殷永風(fēng)等［9］的方法制備氧化魚油，采用GB5009．227－2016（食品中過氧化值的測定）中的滴定法測定，用1 kg樣品中活性氧的毫克當(dāng)量數(shù)表示過氧化值（peroxide values，POV），經(jīng)測定新鮮魚油和氧化魚油的 POV分別為5．74和230．84 meq·kg－1，6種飼料中抽提油脂的 POV分別為 5．52、42．28、79．04、115．78、152．54和189．28meq·kg－1，通過計算得到 6種飼料的POV分別為 0．56、4．12、7．74、11．38、14．94和18．62 meq·kg－1。

1．2 實驗沙蠶及條件

實驗用雙齒圍沙蠶為本實驗研究團隊參照DB32／T 2450－2013（雙齒圍沙蠶人工育苗技術(shù)規(guī)程）的方法，采用同一批受精卵在鹽度24的海水中孵化培育而成的大規(guī)格沙蠶苗種，從泥土中挖出后置于鹽度24的潔凈海水中，排空腸道，挑選無傷殘，初始體質(zhì)量（initial average weight，IAW）為（48．8±0．6）mg的個體1 800尾用于實驗。

取灘涂潮間帶沉積物用自來水反復(fù)淘洗去除其中的鹽分和雜物，曬干后粉碎過孔徑1．65 mm的篩網(wǎng)，并置于60℃條件下烘烤8 h殺滅蟲卵，分別置于61 cm×41 cm×25 cm的聚乙烯槽中，土層厚10 cm，用鹽度24的潔凈海水充分浸泡，然后排去海水，使土壤含飽和水，共制作18個沙蠶養(yǎng)殖槽。

每個養(yǎng)殖槽中放養(yǎng)100尾沙蠶，隨機分為6組，每組3個重復(fù)，分別投喂上述6種不同過氧化水平的飼料。每天于8∶00和19∶00時各投喂1次，投喂量分別為沙蠶鮮重的1%～2%和2%～3%，同時向各養(yǎng)殖槽中噴灑100～120 mL淡水補充蒸發(fā)的水分，并濕潤軟化顆粒飼料，投餌1．5～2 h后收集殘餌。連續(xù)飼養(yǎng)60 d，期間溫度變化范圍維持在25～28℃。

表1 飼料配方及其過氧化值和主要營養(yǎng)成分（風(fēng)干物質(zhì)）Tab．1 Formulation，peroxide value and nutritional composition of experimental diets（air-dry basis）

1．3 樣品采集及指標(biāo)測定

1．3．1 樣品采集及生產(chǎn)性能計算

飼養(yǎng)實驗結(jié)束后，停止飼喂24 h，挖出各養(yǎng)殖槽中的全部沙蠶，置于鹽度為24的潔凈海水中，排空腸道，吸干體表水分稱重記錄，計算各試驗組沙蠶的末體質(zhì)量（final average weight，F(xiàn)AW）、存活率（survival rate，SR）、特定生長率（specific growth ratio，SGR）、飼料系數(shù) （feed conversion ratio，F(xiàn)CR）、蛋白質(zhì)效率 （protein efficiency ratio，PER）和蛋白沉積率（protein deposition rate，PDR），具體計算公式如下：

式中：Nf為實驗?zāi)┥承Q的數(shù)量，Ni為實驗初沙蠶的數(shù)量；Wf為實驗?zāi)┥承Q體質(zhì)量（g），Wi為實驗初沙蠶體質(zhì)量（g）；D為飼養(yǎng)天數(shù)（d）；F為攝入的飼料干重（g）；P為干飼料蛋白質(zhì)含量（%）；Pp為實驗結(jié)束時新鮮沙蠶粗蛋白含量（%）。

1．3．2 飼料營養(yǎng)和沙蠶體組成測定及計算

根據(jù)AOAC［10］的方法測定飼料營養(yǎng)和沙蠶體成分。將樣品在105℃條件下烘干至恒重，計算干物質(zhì)或水分含量；然后分別取一定量干物質(zhì)樣品采用凱氏定氮法測定樣品含氮量，再乘以6．25得樣品粗蛋白含量；采用索氏抽提法測定粗脂肪含量；采用550℃馬弗爐焚燒法測定灰分含量。

1．3．3 沙蠶抗氧化指標(biāo)測定

每個養(yǎng)殖槽隨機取4尾沙蠶，用0．86%的冷凍生理鹽水按質(zhì)量體積比 1∶9進行勻漿，3 000 r·min－1離心 10 min，取上清液，即為用于測定抗氧化指標(biāo)的酶液。丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量、還原性谷胱甘肽（glutathione，GSH）含量、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）和過氧化氫酶（catalase，CAT）活性及酶蛋白濃度均采用南京建成生物工程研究所提供的專用試劑盒測定，按照試劑盒說明書操作及計算。

1．4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

原始數(shù)據(jù)經(jīng)Excel 2007初步整理后，采用SPSS 17．0軟件（SPSS Inc．USA）中的單因素方差分析（One-Way ANOVA）對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，若達(dá)到顯著差異，則進行Duncan′s多重比較。數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤（Mean±SE，n＝3）形式表示，P＜0．05認(rèn)為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2．1 飼料過氧化水平對雙齒圍沙蠶生長性能和飼料利用的影響

飼料過氧化水平對雙齒圍沙蠶的存活、生長、飼料系數(shù)、蛋白質(zhì)效率和蛋白質(zhì)沉積率均有顯著影響（P＜0．05），具體如表2所示。當(dāng)飼料POV超過7．74 meq·kg－1時，飼料系數(shù)隨 POV升高而顯著上升，蛋白質(zhì)效率和蛋白質(zhì)沉積率則顯著下降；當(dāng)飼料 POV超過11．38 meq·kg－1時，雙齒圍沙蠶的存活率、末體質(zhì)量和特定生長率也開始隨飼料POV升高而顯著下降。

表2 飼料過氧化水平對雙齒圍沙蠶生長性能和飼料利用的影響（平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤）Tab．2 Effects of dietary peroxide value on grow th performance and feed utilization of P．a(chǎn)ibuhitensis（M ean±SE）

2．2 飼料過氧化水平對雙齒圍沙蠶體成分的影響

由表3可知，飼料過氧化水平對雙齒圍沙蠶的體水分、粗蛋白和粗脂肪均具有顯著影響（P＜0．05），但對體灰分無顯著影響（P＞0．05）。雙齒圍沙蠶的體水分隨飼料POV升高而逐漸降低，飼料POV為18．62 meq·kg－1時的沙蠶體水分顯著低于飼料 POV為 0．56 meq·kg－1和 4．12 meq·kg－1時；飼料 POV在0．56～7．74 meq·kg－1范圍內(nèi)，沙蠶粗蛋白無顯著差異，但當(dāng)飼料POV超過7．74 meq·kg－1時，沙蠶粗蛋白顯著降低；沙蠶粗脂肪隨飼料POV升高而逐漸升高，但在0．56～7．74 meq·kg－1范圍內(nèi)無顯著差異，當(dāng)飼料 POV超過11．38 meq·kg－1時，沙蠶粗脂肪含量顯著升高。

2．3 飼料過氧化水平對雙齒圍沙蠶抗氧化的影響

飼料過氧化水平對雙齒圍沙蠶的抗氧化指標(biāo)影響如表4所示。沙蠶的MDA含量始終隨飼料POV升高而升高，但飼料 POV在0．56～7．74 meq·kg－1范圍內(nèi)升高的差異不顯著；沙蠶的GSH含量變化趨勢與MDA相反，隨飼料POV升高而逐漸降低；沙蠶SOD和CAT均表現(xiàn)為先升高后降低，其中SOD在飼料POV為11．38 meq·kg－1時升至最高值，CAT在飼料POV為7．74meq·kg－1時升至最高值。

3 討論

3．1 飼料過氧化水平對雙齒圍沙蠶生長性能的影響

本實驗通過向飼料中添加氧化魚油，提高飼料的過氧化水平，來研究其對雙齒圍沙蠶生長性能的影響。研究結(jié)果顯示，當(dāng)飼料 POV超過11．38 meq·kg－1時，雙齒圍沙蠶的存活率、末體質(zhì)量和特定生長率顯著下降；當(dāng)飼料POV超過7．74 meq·kg－1時，飼料系數(shù)顯著上升，蛋白質(zhì)效率和蛋白質(zhì)沉積率則顯著下降。高淳仁等［11］研究表明，氧化魚油會降低真鯛（Pagrusmajor）幼魚的存活率和增重率，并且其增重率與POV呈現(xiàn)一定的線性關(guān)系。黃凱等［12］研究發(fā)現(xiàn)，飼喂添加氧化油脂的飼料，會導(dǎo)致奧尼羅非魚（Oreochromis niloticus×O．a(chǎn)ureus）的增重率和飼料轉(zhuǎn)化效率下降。彭士明等［13］報道，飼料中添加氧化魚油會顯著降低黑鯛（Acanthopagrus schlegeli）的增重率、飼料效率和蛋白質(zhì)效率。陳科全等［14］研究指出，草魚（Ctenopharyngodon idellus）的生長速度、蛋白質(zhì)沉積率及對飼料的利用效率會隨飼料中氧化油脂POV的升高而下降。上述學(xué)者的報道和本實驗研究結(jié)果均表明，飼料過氧化對水產(chǎn)動物生長性能具有抑制作用。但是，袁瑞敏等［15］用氧化魚油（POV為 128．47 meq·kg－1）完全替代飼料中的新鮮魚油（POV為 7．67meq·kg－1），卻發(fā)現(xiàn)大口黑鱸（Micropterus salmoides）的成活率和增重率反而顯著提升，飼料系數(shù)顯著下降。出現(xiàn)這種差異的原因可能與大口黑鱸對飼料POV的耐受能力強有關(guān)，具體機制還有待進一步研究。

表3 飼料過氧化水平對雙齒圍沙蠶體成分的影響（平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤）Tab．3 Effects of dietary peroxide value on body com position of P．a(chǎn)ibuhitensis（M ean±SE）

表4 飼料過氧化水平對雙齒圍沙蠶抗氧化指標(biāo)的影響（平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤）Tab．4 Effects of dietary peroxide value on antioxidant index of P．a(chǎn)ibuhitensis（M ean±SE）

3．2 飼料過氧化水平對雙齒圍沙蠶體成分的影響

本研究結(jié)果表明，隨飼料POV升高，雙齒圍沙蠶的粗蛋白含量逐漸降低，這與彭士明等［13］和GAO等［16］分別對黑鯛和真鯛的研究結(jié)論相似。這可能與氧化油脂代謝產(chǎn)物導(dǎo)致用于水產(chǎn)動物機體構(gòu)建的必需氨基酸缺乏有關(guān)，汪開毓等［17］認(rèn)為，氧化油脂代謝產(chǎn)物可造成蛋白質(zhì)交聯(lián)聚合，直接破壞必需氨基酸，造成飼料中必需氨基酸缺乏。本研究中，雙齒圍沙蠶的粗脂肪含量隨飼料POV水平的增加呈逐漸上升的趨勢，這與一些水產(chǎn)動物如大口黑鱸［15］和真鯛［16］的研究結(jié)果一致。由此可見，氧化油脂可造成一些水產(chǎn)動物的脂肪代謝障礙，導(dǎo)致體脂沉積增加。這樣相應(yīng)用于供能的脂類就會減少，這些水產(chǎn)動物可能就會消耗更多的蛋白質(zhì)供能，這也是氧化油脂造成生物體粗蛋白下降的可能原因。雙齒圍沙蠶的體水分隨飼料POV升高逐漸降低，這可能主要與氧化油脂造成沙蠶體脂肪上升的影響相關(guān)，筆者在研究雙齒圍沙蠶適宜脂肪水平［8］和適宜蛋白水平［18］時也發(fā)現(xiàn)沙蠶的體水分與體脂肪呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)，其它一些水產(chǎn)動物如石斑魚（Epinephelus coioides）［19］、軍曹魚（Rachycentron canadum）［20］和美國紅魚（Sciaenops ocellatus）［21］的體水分也和體脂肪呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)。

3．3 飼料過氧化水平對雙齒圍沙蠶抗氧化的影響

MDA是生物體內(nèi)脂質(zhì)過氧化的有毒產(chǎn)物，其含量與脂質(zhì)過氧化程度密切相關(guān)［22］。SOD和CAT能清除生物體內(nèi)活性氧，減輕脂質(zhì)過氧化及其危害［23］，因而SOD和CAT的活性可以反映生物機體的抗氧化能力［24］。GSH是生物體內(nèi)的一種非酶抗氧化劑，可以與氧自由基結(jié)合，降低氧自由基的危害［25］。本研究結(jié)果顯示，雙齒圍沙蠶的MDA含量始終隨飼料POV升高而升高，但飼料 POV在 0．56～7．74meq·kg－1范圍內(nèi)升高的差異不顯著；GSH含量變化趨勢與MDA相反，隨飼料POV升高而逐漸降低；SOD和CAT均表現(xiàn)為先升高后降低。這說明飼喂過氧化飼料會導(dǎo)致雙齒圍沙蠶機體的脂質(zhì)過氧化。生物體為了清除氧自由基的危害，會消耗體內(nèi)的GSH，同時誘導(dǎo)生成更多的SOD和CAT，但當(dāng)脂質(zhì)過氧化程度超過機體的調(diào)控能力時，機體無法繼續(xù)產(chǎn)生更多的SOD和CAT，則會表現(xiàn)為SOD和CAT的活性下降［26］。

4 小結(jié)

本研究結(jié)果表明，當(dāng)飼料POV超過7．74 meq·kg－1時，飼料系數(shù)顯著上升，蛋白質(zhì)效率和蛋白質(zhì)沉積率則顯著下降；當(dāng)飼料 POV超過11．38 meq·kg－1時，雙齒圍沙蠶的存活率和特定生長率顯著下降，脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA含量顯著上升。因此，雙齒圍沙蠶飼料的POV不可超過7．74 meq·kg－1，建議最好保持在 4．12 meq·kg－1以下。