基于耳石和角質顎微結構的中國槍烏賊年齡與生長比較

李建華，張鑫浩，金 岳，林方龍，陳新軍

（1．上海海洋大學海洋科學學院，上海 201306；2．大洋漁業(yè)資源可持續(xù)開發(fā)教育部重點實驗室，上海 201306；3．國家遠洋漁業(yè)工程技術研究中心，上海 201306；4．遠洋漁業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心，上海 201306）

中國槍烏賊（Uroteuthis chinensis）又稱本港魷魚、中國魷魚等［1］，隸屬頭足綱槍形目槍烏賊科槍烏賊屬，為暖水性大陸架海域物種［2］。在我國主要分布于南海大陸架、臺灣海峽中南部等海域［3］。中國槍烏賊在我國近海頭足類產量中占較大比重，是我國的主要捕撈對象［3－4］。年齡與生長是研究頭足類生活史最基本的內容之一，也是資源評估工作的基礎［5］。頭足類的耳石和角質顎是重要的硬組織材料，都具有生長紋結構［6－8］，在頭足類的日齡、生長及生活史等［9－10］研究中得到廣泛應用。耳石輪紋清晰規(guī)律，是研究頭足類年齡和生長最為廣泛和有效的硬組織材料，目前耳石制片方法、研究方法已經非常成熟［11－12］。角質顎輪紋位于角質顎內側，隨著越來越多的海洋生物工作者對其產生濃厚的興趣，角質顎已逐漸成為除耳石外另一個研究頭足類年齡的重要硬組織，其優(yōu)點在于穩(wěn)定的形態(tài)特征、良好的信息儲存以及耐腐蝕等特點，學者對其應用前景十分看好［13－14］。因此，本研究根據2016年在南海北部陸架區(qū)采集的中國槍烏賊樣本，分別利用耳石和角質顎微結構比較研究其年齡與生長特點，對耳石和角質顎的微結構及輪紋數進行差異性分析，并建立生長模型，以期為今后槍烏賊年齡與生長研究提供基礎。

1 材料與方法

1．1 樣本采集

中國槍烏賊的樣品采集海域為南海北部陸架區(qū)（108°～118°E、20°～22°N），采集時間為2016年4月，樣品通過拖網捕獲，共隨機采取274尾樣本。

1．2 研究方法

1．2．1 生物學測定與耳石、角質顎的提取

實驗室進行解凍后，對中國槍烏賊進行生物學測定，包括胴長（mantel length，ML）、體質量（body weight，BW）。測量胴長用皮尺進行，精確至1 mm，體質量精確至1 g。用鑷子將左右兩個耳石分別從平衡囊中取出，清洗后存放于2 mL離心管中，并加入75%的乙醇存放。

角質顎位于頭部口球中，口器為幾丁質，下顎包含著上顎，所以提取角質顎時應先取出下顎再取出上顎，角質顎取出后應用清水進行漂洗，去除附著于表面的有機物質，存放于50 mL離心管中，并加入75%的乙醇。

1．2．2 耳石、上角質顎切片制作

中國槍烏賊耳石背區(qū)的生長紋更加清晰［15］，故本研究選擇背區(qū)面進行研磨。根據LIU等［16］對莖柔魚的研究發(fā)現，角質顎微結構的生長紋位于喙部的矢狀切面上，因此本研究取喙部進行研磨。由于中國槍烏賊個體小且角質顎較小，增大了角質顎的研磨難度。故本次研究實驗只成功研磨出33尾中國槍烏賊樣品的上角質顎，耳石研磨成功樣品為173尾。

本次研究實驗均使用Struers LaboPol－6研磨機。

1．2．3 輪紋計數

研磨好的耳石和角質顎切片放置在Olympus雙筒光學顯微鏡（型號為CX21FS1）下，使用40倍物鏡用DP71進行拍照；由于耳石以及角質顎的拍照在顯微鏡下無法一次完成，故采用多次拍照再使用Adobe Photoshop CS6對圖片進行疊加拼合，最終得到完整的耳石與角質顎圖片。每張樣品圖片上的生長紋計數由兩位觀察者分別進行，若計數的均值差異程度不高于10%，則視為該數據有效［17］。

1．2．4 數據的處理

1）處理耳石和角質顎的生物學數據，統(tǒng)計其胴長的頻度分布，再建立胴長和體質量的4種函數關系：線性、指數、冪函數和對數函數，利用最小AIC法選擇最適的生長模型。

2）對胴長體重生長模型、耳石生長紋的生長模型以及角質顎生長紋的生長模型進行差異分析。

本研究均利用SPSS 23．0軟件進行統(tǒng)計分析。

2 結果與分析

2．1 胴長與體重組成及其關系

如表1所示，本研究采集的中國槍烏賊樣本胴長范圍為66～476 mm，體質量范圍14～767 g，胴長平均值為159 mm，體質量平均值為191 g。耳石日齡的范圍為89～324 d，平均值為144 d。角質顎日齡的范圍為70～197 d，平均值為127 d。

如圖1所示，本次采集的中國槍烏賊樣本胴長小于100 mm的占樣品總數9%、100～200 mm占54%，200～300 mm占31%，大于300 mm占6%。其胴長組成符合正態(tài)分布。其中優(yōu)勢胴長組為100～200 mm。

胴長（ML）與體質量（BW）呈明顯的冪函數生長關系，生長方程為：BW＝0．001 1ML2．2261（R2＝0．925 1）（圖2）。

2．2 耳石微結構

觀察發(fā)現，中國槍烏賊耳石的輪紋存在于吻區(qū)、翼區(qū)、背區(qū)和側區(qū)，其中以背區(qū)的生長紋最為清晰。背區(qū)的微結構在顯微鏡下觀察可區(qū)分中心核心、核心區(qū)、后核心區(qū)、暗區(qū)以及外圍區(qū)這5個區(qū)域，且生長紋由明暗相間的環(huán)紋組成（圖3）。核心區(qū)存在初始紋，初始紋較難觀察。核心區(qū)以外的區(qū)域可根據生長紋的間隔寬度來區(qū)分出后核心區(qū)、暗區(qū)、外圍區(qū)。后核心區(qū)的生長紋間隔較大，暗區(qū)的生長紋間隔最大，外圍區(qū)的生長紋間隔最小。外圍區(qū)是最難研磨和觀察到生長紋的區(qū)域。

表1 中國槍烏賊胴長和體質量范圍Tab．1 M antle length and weight range of U．chinensis

圖1 中國槍烏賊胴長頻率分布圖Fig．1 Distribution ofmantle length frequency for U．chinensis

圖2 中國槍烏賊胴長和體質量關系Fig．2 Relationship between mantle length and body weight for U．chinensis

圖3 中國槍烏賊耳石背區(qū)微結構Fig．3 Dorsal dome statolith m icrostructure of U．chinensis

對中國槍烏賊耳石背區(qū)生長紋進行觀察發(fā)現，亞日輪在暗區(qū)較常見 （圖4－a），與日輪近乎重合，但亞日輪不如日輪明顯。同時，還發(fā)現有6種不同的標記輪的存在，在核心區(qū)末端存在明顯不同于其他生長紋的第1類標記輪（圖4－b），出現在后核心區(qū)的第2類標記輪（圖4－b），以及出現在后核心區(qū)和暗區(qū)過渡帶的第3類標記輪（圖4－b），第4類標記輪（圖4－c）則出現在暗區(qū)和外圍區(qū)之間，第5類標記輪在外圍區(qū)（圖4－c），第6類標記輪則出現在半月帶或月帶（圖4－d）。

2．3 上角質顎的微結構

角質顎的生長紋存在于其內部，對中國槍烏賊的上角質顎進行縱面切割研磨，觀察其在顯微鏡下的整體圖（圖5－a），發(fā)現角質顎喙部的頭蓋區(qū)生長紋和側壁區(qū)生長紋以對稱的形式排列在分叉到喙部分界線的兩端。且其生長紋與耳石生長紋相似，以明暗相間的排列方式分布于角質顎喙部。并且明顯觀察到，頭蓋區(qū)的色素沉積相比于側壁區(qū)要深很多。同樣，角質顎的生長紋中也存在有亞日輪（圖5－b）以及標記輪（圖5－c），角質顎標記輪種類較耳石少。值得注意的是，角質顎標記輪附近的生長紋比其它生長紋更加明顯，即暗帶比其它暗帶更暗，反之亮帶更亮。觀察整體的生長紋，發(fā)現從分叉到喙部，生長紋的間隔越來越小，生長紋越來越細。在角質顎喙部發(fā)現有異常結構，一般出現在喙部邊緣（圖5－d）。

2．4 年齡組成

耳石切片日齡范圍為89～324 d，均值為144 d，耳石優(yōu)勢日齡組為 120～150 d，占總數的31．2%；其次是150～180 d和90～120 d，分別占總數的30．6%和26%，耳石日齡組成頻度符合正態(tài)分布（圖6）。角質顎切片日齡范圍為70～197 d，均值為127 d。角質顎優(yōu)勢日齡組為90～120 d，占總數的39．4%；其次是120～150 d，占總數的24．2%，角質顎日齡組成頻度也符合正態(tài)分布（圖7）。

如表2所示，角質顎的生長紋數目明顯小于耳石的生長紋數目，耳石生長紋數目小于200 d，角質顎生長紋數目與耳石生長紋數目較接近，但耳石生長紋數目大于200 d時，角質顎生長紋數目約等于耳石生長紋數目的一半。

2．5 耳石輪紋和角質顎輪紋與胴長的關系

對耳石和角質顎日齡的分析結果表明，耳石輪紋和胴長較為符合線性相關關系：N＝0．374 4ML＋71．326（R2＝0．850 4，P＜0．01）（圖8）；

角質顎和胴長符合線性相關關系：

M＝0．266 4ML＋62．505（R2＝0．845 2，P＜0．01）（圖 9）。

式中：N為耳石輪紋數，M為角質顎輪紋數，ML為胴長。

圖4 中國槍烏賊耳石微結構生長紋Fig．4 Statolith m icrostructure of U．chinensis

圖5 中國槍烏賊上角質顎微結構Fig．5 Upper beak m icrostructure of U．chinensis

圖6 耳石年齡組成頻度分布圖Fig．6 Age frequency distribution of statolith

圖7 角質顎年齡組成頻度分布圖Fig．7 Age frequency distribution of beak

圖8 耳石輪紋與胴長關系Fig．8 Relationship between statolith increments and mantle length

表2 耳石和角質顎生長紋對照表Tab．2 Increment differences table for statolith and beak

圖9 角質顎輪紋與胴長關系Fig．9 Relationship between beak increments and mantle length

3 討論

3．1 耳石微結構

中國槍烏賊耳石微結構的生長紋排列方式和其它頭足類耳石生長紋相似［18－19］，都是由明暗相間的環(huán)紋組成，且核心區(qū)內的初始輪紋不明顯，觀察計數有難度。研究發(fā)現暗區(qū)的條紋間隔寬度最寬，后核區(qū)次之，外圍區(qū)間隔最窄，并且胴長個體越大越為明顯，以此可以推斷耳石微結構的各個區(qū)域的形成與中國槍烏賊的發(fā)育有關，這一結果與ARKHIPKIN［10］的結論相似。

在中國槍烏賊耳石中發(fā)現6類標記輪，這與前人對其它頭足類耳石微結構的研究結果相似［20］，其中1～4類標記輪在各個區(qū)域的過渡帶或者邊緣，本研究認為標記輪代表著中國槍烏賊的生長變化規(guī)律。

3．2 上角質顎微結構

中國槍烏賊上角質顎生長紋與其它頭足類相似［21］，都對稱地分布在喙部截面縱軸的兩側，靠近分叉口附近生長紋間距寬，而靠近喙部生長紋間距窄。與喙部截面相比，側壁區(qū)色素沉著淺，生長紋容易觀察到，然而側壁區(qū)的生長紋交錯重疊現象嚴重，且側壁區(qū)邊緣常出現生長紋缺失，使得輪紋計數不準確，無法顯示完整的生長紋。角質顎喙部生長紋的沉積是由分叉口開始向喙部沉積，靠近分叉口生長紋代表生長早期，生長速率快，靠近喙部生長紋代表成體期，生長速率慢，生長紋的變化趨勢與中國槍烏賊的生長速率變化趨勢一致。從圖6－b可觀察分析，角質顎喙部存在大量的色素沉積，色素過深的區(qū)域生長紋難以觀察到，但是如果沒有色素沉著，無法對生長紋進行觀察，反而是透紅的區(qū)域生長紋最為清晰。因此在研磨時要盡量將角質顎兩面磨薄至色素透紅，這樣生長紋的觀察會最清晰且計數準確。

在上角質顎的輪紋計數中發(fā)現與耳石微結構中相似的標記輪，角質顎標記輪的存在使得其附近的生長紋更為突出，而標記輪的生成與溫度突變、風暴、被捕時逃脫等外界的環(huán)境影響有關［10］。本研究在觀察角質顎生長紋的過程中，發(fā)現5尾中國槍烏賊的角質顎生長紋存在不平整的現象，有些區(qū)域的生長紋會突然出現彎曲不平整，隨后又正常平整的排列，這可能是由于角質顎受到外界環(huán)境改變的刺激，從而使其沉淀作用混亂，待到沉淀作用正常后生長紋又開始規(guī)則的排列。角質顎微結構上出現垂直交叉于生長紋的細微條紋，這是由于角質顎的沉積作用會在不同的方向上進行［19］。角質顎喙部存在一些異常結構，由于角質顎存在于頭足類口腔中，在捕食過程中其喙部易被腐蝕，導致腐蝕的位置無法進行生長紋的計數。因此可以通過觀察其他區(qū)域的生長紋來減少喙部異常結構的影響。LIU等［16］的研究也表明，當出現影響生長紋計數的角質顎異常結構部位時，可以通過觀察角質顎頭蓋背側邊緣的生長紋，從而減少誤差。

3．3 耳石微結構和角質顎微結構比較

中國槍烏賊耳石和角質顎微結構有一定的相似性，兩者都有生長紋的沉積，且在一定程度上可以反映個體年齡生長規(guī)律。標記輪的存在可能與其生存環(huán)境有關［17］。從生長紋的變化波動可以推測個體生存環(huán)境的大致變化，耳石和角質顎都有標記輪的存在，耳石標記輪種類較多，而角質顎標記輪種類較少，故從耳石生長紋上可以獲得更多的生長信息。耳石和角質顎微結構同樣存在日輪和亞日輪，日輪與亞日輪的存在是對其進行生長紋計數時產生誤差的一個主要因素，所以需要仔細分辨亞日輪來減少判讀誤差。生長紋的計數準確度影響了其日齡的估算，對比本次耳石輪紋數和角質顎輪紋數發(fā)現，耳石輪紋數普遍比角質顎輪紋數高，這是由于角質顎微結構上生長紋會出現疊加沉積導致其輪紋數不全面，而且物種越小生長紋疊加現象越嚴重，同時喙部往往因為個體捕食等行為造成邊緣磨損，進而造成輪紋缺失，導致以角質顎輪紋得到的日齡小于實際日齡。中國槍烏賊個體小于其它大多數頭足類，其角質顎的生長紋較其他頭足類難以觀察。

3．4 胴長與體質量、耳石輪紋和角質顎輪紋關系

研究表明，中國槍烏賊的胴長與體質量關系符合冪函數生長模型，由胴長頻率分布圖（圖1）及冪函數相關圖（圖2）可以發(fā)現，胴長為100～200 mm的個體占大多數；胴長為200 mm以下的中國槍烏賊樣品平均體質量增加較慢，而胴長200 mm以上的則增長迅速。由此推斷中國槍烏賊在胴長200 mm左右為快速成長期，隨著性腺的不斷成熟生長速度也變慢，符合大多數頭足類的生長規(guī)律［10］。

胴長在300 mm以下個體的生長紋數較有規(guī)律，基本在參考線兩側；但是300 mm以上的個體則波動較大（圖8，圖9）。這與胴長仍受到體質量、發(fā)育以及捕食等很多因素的影響有關［22－23］。

綜上所述，對于中國槍烏賊樣品的年齡鑒定，建議選擇耳石微結構來估算其日齡。在研究頭足類年齡和生長的時候不能局限于只用一種方法，選擇多種研究方法，對比分析各方法優(yōu)劣，根據多種方法的結果討論其原因，與使用單一的耳石微結構或角質顎微結構方法研究相比，兩種研究方法的對比分析，可以更好的根據該物種的特性來對比研究得出較為準確的結果，從而選擇更適合地材料和方法。因此，在今后的研究中，應不斷改進頭足類的年齡生長研究方法，使用耳石和角質顎微結構進行對比分析，使其研究結果更加準確和可靠。