組蛋白脫乙酰酶抑制劑丁酸鈉對宮頸癌HeLa細(xì)胞增殖與凋亡的影響

羅娟，南祖峰，羅玲，張風(fēng)莉

1解放軍第十五醫(yī)院婦產(chǎn)科，新疆 烏蘇 833000

2解放軍69230部隊(duì)醫(yī)院門診，新疆 烏蘇 833000

3新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)農(nóng)七師125團(tuán)醫(yī)院內(nèi)科，新疆 奎屯 833203

4新疆軍區(qū)總醫(yī)院病理科，烏魯木齊 830000

宮頸癌是一種常見的婦科惡性腫瘤。近年來，隨著宮頸細(xì)胞學(xué)篩查技術(shù)的不斷提高，宮頸癌的發(fā)病率及病死率雖然有所降低，但是發(fā)病年齡卻呈年輕化趨勢[1-3]。與其他腫瘤組織相似，宮頸癌組織呈現(xiàn)較低的組蛋白乙?；剑M蛋白的乙?；饕山M蛋白去乙酰化酶（histone deacetylase，HDAC）與組蛋白乙?；D(zhuǎn)移酶（histone acetyltransferase，HAT）調(diào)控，因此組蛋白脫乙酰酶抑制劑（histone deacetylase inhibitor，HDACi）成為腫瘤治療領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)[4-6]。HDACi包括短鏈脂肪酸類、氧肟酸類、環(huán)形四肽類、苯酸胺類4大類。其中丁酸鈉屬于短鏈脂肪酸，具有高效、低毒等特點(diǎn)，不影響正常細(xì)胞的活性，因此被逐漸用于腫瘤細(xì)胞的治療中[4-6]。相關(guān)研究顯示，丁酸鈉對宮頸癌HeLa細(xì)胞的增殖具有明顯的抑制作用[7]，但其具體的作用機(jī)制尚未明確。因此，本研究將探討丁酸鈉對HeLa細(xì)胞增殖與凋亡的影響及其相關(guān)機(jī)制，旨在為丁酸鈉用于宮頸癌的臨床治療提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株

宮頸癌HeLa細(xì)胞購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫，于含有15%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，在37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)。

1.2 試劑與儀器

DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清均購自美國Gibco公司；兔抗人B淋巴細(xì)胞瘤因子-2（bcl-2）、bcl-2相關(guān)X蛋白（BAX）、細(xì)胞周期蛋白D1（cyclin D1）、p27、磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）、蛋白激酶B（protein kinase B，AKT）及甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）多克隆抗體均購自美國Abcam公司；Annexin V-FITC/PI流式雙染試劑盒、BCA蛋白濃度測定試劑盒、細(xì)胞周期檢測試劑盒均購自南通碧云天生物技術(shù)有限公司；ChemiDocTM XRS凝膠成像系統(tǒng)購自美國伯樂公司；FACSCalibur流式細(xì)胞儀購自美國BD公司；MK3酶標(biāo)儀購自美國Thermo公司。

1.3 噻唑藍(lán)（MTT）法檢測HeLa細(xì)胞活力

取5×103個處于對數(shù)生長期的HeLa細(xì)胞接種至6孔板中，待細(xì)胞貼壁后，加入200 μl終濃度為0、2.5、5.0、10.0 mmol/L的丁酸鈉作用細(xì)胞24、48、72 h，加入MTT孵育4 h后，小心吸取上清液棄掉后加入150 μl的二甲基亞砜，振蕩使結(jié)晶物溶解，在570 nm波長處測定光密度（optical delnsity，OD）值，OD570nm值即代表細(xì)胞活力。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4 Annexin V-FITC/PI法檢測細(xì)胞凋亡

取9×103個處于對數(shù)生長期的HeLa細(xì)胞接種至6孔板中，待細(xì)胞貼壁后，加入1 ml終濃度為0、2.5、5.0、10.0 mmol/L的丁酸鈉作用細(xì)胞48 h，收集1×105/ml細(xì)胞，加入結(jié)合緩沖液混勻后，繼續(xù)加入Annexin V-FITC及PI并混勻，1 h內(nèi)采用流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞凋亡的檢測并分析。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期

將9×103個處于對數(shù)生長期的HeLa細(xì)胞接種至6孔板中，待細(xì)胞貼壁后，加入1 ml終濃度為0、2.5、5.0、10.0 mmol/L的丁酸鈉作用細(xì)胞48 h，收集1×105/ml細(xì)胞，加入RNase混勻并孵育1 h，再加入PI染液孵育30 min，1 h內(nèi)采用流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞周期的檢測并分析。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6 蛋白質(zhì)印跡法（Western blot）檢測細(xì)胞中蛋白的表達(dá)

取9×103個處于對數(shù)生長期的HeLa細(xì)胞接種至6孔板中，待細(xì)胞貼壁后，加入1 ml終濃度為0、2.5、5.0、10.0 mmol/L的丁酸鈉作用細(xì)胞48 h，收集細(xì)胞并裂解得到細(xì)胞總蛋白，測定蛋白濃度。制作濃縮膠和分離膠，蛋白上樣后，進(jìn)行凝膠電泳，濕法轉(zhuǎn)PVDF膜，脫脂奶粉封閉1 h后，一抗4℃過夜孵育，二抗室溫孵育1 h，于凝膠成像系統(tǒng)中曝光。用Quantity One軟件分析蛋白條帶灰度值，以GAPDH為內(nèi)參，計(jì)算bcl-2、BAX、cyclin D1、p27、PI3K蛋白的相對表達(dá)量；以AKT為內(nèi)參，計(jì)算p-AKT蛋白的相對表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 17.0-軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用F檢驗(yàn)，多組間兩兩比較采用q檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 丁酸鈉對HeLa細(xì)胞活力的影響

MTT法檢測結(jié)果顯示：與0 mmol/L丁酸鈉比較，2.5、5.0、10.0 mmol/L丁酸鈉分別作用24、48、72 h后HeLa細(xì)胞的細(xì)胞活力均明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；不同濃度丁酸鈉作用HeLa細(xì)胞48、72 h時的細(xì)胞活力比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），因此本研究后續(xù)選擇48 h作為作用時間。（表1）

表1 不-同濃度丁酸鈉作用后HeLa細(xì)胞的細(xì)胞活力比較（±s）

表1 不-同濃度丁酸鈉作用后HeLa細(xì)胞的細(xì)胞活力比較（±s）

注：*與0 mmol/L的丁酸鈉比較，P＜0.01

丁酸鈉濃度（mmol/L）24 h48 h72 h 0 0.48±0.040.59±0.060.68±0.06 2.50.43±0.04*0.45±0.05*0.43±0.04*5.00.40±0.04*0.38±0.04*0.37±0.03*10.00.38±0.03*0.33±0.03*0.33±0.03*

2.2 丁酸鈉對HeLa細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期的影響

采用流式細(xì)胞術(shù)檢測不同濃度丁酸鈉作用48 h后HeLa細(xì)胞的凋亡及細(xì)胞周期情況，結(jié)果顯示：與0 mmol/L丁酸鈉比較，2.5、5.0、10.0 mmol/L丁酸鈉作用后HeLa細(xì)胞的早期凋亡率和晚期凋亡率均明顯增高，G1期細(xì)胞所占比例均明顯增高，S期和G2期細(xì)胞所占比例均明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。（表2）

2.3 丁酸鈉對HeLa細(xì)胞中BAX、bcl-2、cyclin D1及p27蛋白表達(dá)的影響

Western blot檢測結(jié)果顯示：與0 mmol/L丁酸鈉比較，2.5、5.0、10.0 mmol/L丁酸鈉作用后HeLa細(xì)胞中cyclin D1蛋白的相對表達(dá)量均明顯降低，BAX、p27蛋白的相對表達(dá)量均明顯增高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；與0 mmol/L丁酸鈉比較，5.0、10.0 mmol/L丁酸鈉作用后HeLa細(xì)胞中bcl-2蛋白的相對表達(dá)量均明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。（表3）

表2 不同濃度丁酸鈉作用后HeLa細(xì)胞的凋亡情況及細(xì)胞周期的比較（%，±s）

表2 不同濃度丁酸鈉作用后HeLa細(xì)胞的凋亡情況及細(xì)胞周期的比較（%，±s）

注：*與0 mmol/L丁酸鈉比較，P＜0.01

細(xì)胞周期細(xì)胞凋亡早期凋亡2.31±0.24 7.48±0.75*12.51±1.25*18.38±1.84*晚期凋亡3.55±0.35 8.92±0.89*14.87±1.49*22.29±2.23*G1期45.49±4.49 51.28±5.13*57.29±5.73*64.56±6.45*S期31.28±3.30 28.36±2.84*24.67±2.47*20.59±2.06*G2期23.23±2.32 20.36±2.04*18.04±1.80*14.85±1.49*丁酸鈉濃度（mmol/L）0 2.5 5.0 10.0

表3 不同濃度丁酸鈉作用后HeLa細(xì)胞中BAX-、bcl-2、cyclin D1、p27蛋白相對表達(dá)量的比較（±s）

注：*與0 mmol/L丁酸鈉比較，P＜0.01

丁酸鈉濃度（mmol/L）0 2.5 5.0 10.0 0.58±0.02 0.55±0.02 0.23±0.04*0.10±0.11*0.13±0.01 0.28±0.03*0.72±0.08*1.18±0.12*0.73±0.07 0.42±0.04*0.34±0.03*0.15±0.01*0.13±0.01 0.26±0.02*0.38±0.03*0.40±0.04*bcl-2BAX cyclin D1p27

2.4 丁酸鈉對HeLa細(xì)胞中PI3K/AKT信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

Western blot檢測結(jié)果顯示：與0 mmol/L丁酸鈉比較，2.5、5.0、10.0 mmol/L丁酸鈉作用后HeLa細(xì)胞中PI3K、p-AKT蛋白的相對表達(dá)量均明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。（表4）

表4 不同濃度丁酸鈉處理后HeLa細(xì)胞中-PI3K/AKT信號通路相關(guān)蛋白相對表達(dá)量的比較（±s）

表4 不同濃度丁酸鈉處理后HeLa細(xì)胞中-PI3K/AKT信號通路相關(guān)蛋白相對表達(dá)量的比較（±s）

注：*與0 mmol/L丁酸鈉比較，P＜0.01

PI3K 0.97±0.09 0.51±0.04*0.35±0.03*0.23±0.02*1.08±0.09 0.83±0.08*0.43±0.04*0.25±0.03*0 2.5 5.0 10.0 p-AKT丁酸鈉濃度（mmol/L）

3 討論

組蛋白的乙?；街饕蒆DAC與HAT共同調(diào)控，二者的失衡，激活下游基因的轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生，使腫瘤組織呈現(xiàn)低的乙?；絒4-6]。HDACi是目前公認(rèn)的一類高效、低毒、光譜的抗腫瘤新型藥物，能夠提高染色質(zhì)組蛋白乙?；?，促使腫瘤細(xì)胞分化或凋亡[4-6]。丁酸鈉作為一種HDACi，是食物纖維在結(jié)腸內(nèi)發(fā)酵得到的一種小分子化合物，能夠誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的肺癌細(xì)胞、食管癌細(xì)胞、肝癌細(xì)胞、宮頸癌細(xì)胞等腫瘤細(xì)胞的分化、凋亡，并使腫瘤細(xì)胞生長阻滯[7-10]。目前，關(guān)于丁酸鈉對宮頸癌細(xì)胞誘導(dǎo)作用的報(bào)道相對較少，因此本研究將對此進(jìn)行闡述。

陳萍等[10]研究結(jié)果顯示，丁酸鈉作用于人食管癌KYSE-150細(xì)胞的半抑制濃度（IC50）值為5.6 mmo/L。羅曉華等[7]研究表明，1、2、4、8 mmol/L丁酸鈉作用后，能明顯降低HeLa細(xì)胞的活力。本研究MTT法檢測結(jié)果顯示，與0 mmol/L丁酸鈉比較，2.5、5.0、10.0 mmol/L丁酸鈉作用HeLa細(xì)胞24、48、72 h后，細(xì)胞活力均明顯降低（P＜0.01），但丁酸鈉處理48 h及72 h時，對HeLa細(xì)胞的作用強(qiáng)度一致，因此本研究后續(xù)選擇48 h作為作用時間，且本研究的丁酸鈉濃度范圍與羅曉華等[7]和陳萍等[10]一致，說明在此劑量濃度范圍內(nèi)丁酸鈉能明顯降低HeLa細(xì)胞活力，后續(xù)的Annexin V-FITC/PI流式雙染實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)，丁酸鈉能明顯誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞凋亡。細(xì)胞的凋亡受細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白調(diào)控，bcl-2家族中的抑凋亡蛋白bcl-2與促凋亡蛋白BAX結(jié)合，可以阻斷上游凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，促進(jìn)細(xì)胞存活與生長。而促凋亡蛋白BAX自身還能夠形成二聚體，傳遞上游凋亡信號，最終誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。本研究進(jìn)一步探討丁酸鈉對HeLa細(xì)胞中bcl-2及BAX蛋白表達(dá)的影響，結(jié)果表明丁酸鈉能明顯上調(diào)BAX蛋白表達(dá)，下調(diào)bcl-2蛋白表達(dá)，最終誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡密不可分，細(xì)胞周期調(diào)控點(diǎn)是細(xì)胞增殖與凋亡的雙向開關(guān)。G1/S期是真核細(xì)胞周期重要的檢測點(diǎn)，當(dāng)此調(diào)控點(diǎn)缺陷時，DNA修復(fù)停止，細(xì)胞無法凋亡，同時cyclin D與CDK4/6結(jié)合形成復(fù)合物，促使Rb磷酸化，進(jìn)一步誘導(dǎo)E2F3進(jìn)入細(xì)胞核促進(jìn)增殖相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄，而細(xì)胞周期蛋白抑制子p27無法阻擋細(xì)胞周期蛋白與CDK的結(jié)合，最終促使腫瘤細(xì)胞不斷復(fù)制并惡性化[11-12]。相關(guān)研究顯示，丁酸鈉能夠通過上調(diào)p21表達(dá)并下調(diào)CDK7表達(dá)，促使HeLa細(xì)胞的細(xì)胞周期阻滯于G1期[7]。本研究結(jié)果顯示，丁酸鈉能夠通過上調(diào)p27表達(dá)，下調(diào)cyclin D1表達(dá)，使細(xì)胞周期阻滯于G1期，說明丁酸鈉能夠通過調(diào)控細(xì)胞周期相關(guān)蛋白表達(dá)使HeLa細(xì)胞周期發(fā)生阻滯。

宮頸癌細(xì)胞的增殖、凋亡及細(xì)胞周期與眾多信號通路密切相關(guān)，PI3K/AKT信號通路便是其中一種。該信號通路在宮頸癌的發(fā)生發(fā)展過程中被高度激活，PI3K被激活后，將下游底物二磷酸磷脂酰肌醇的3’羥基磷酸化并使之變成三磷酸磷脂酰肌醇，進(jìn)而使AKT的絲氨酸-蘇氨酸位點(diǎn)磷酸化，活化后的AKT進(jìn)入細(xì)胞核，調(diào)控靶蛋白（bcl-2、cyclin D1、MMP等）的表達(dá)，最終促進(jìn)細(xì)胞的增殖、侵襲等[13-14]。相關(guān)研究顯示，丁酸鈉能夠通過PI3K/AKT信號通路抑制缺血再灌注引起的小鼠神經(jīng)元凋亡，提示丁酸鈉對PI3K/AKT信號通路具有調(diào)控作用[15]。本研究繼續(xù)探討丁酸鈉對HeLa細(xì)胞中PI3K/AKT信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響，結(jié)果表明丁酸鈉能明顯下調(diào)PI3K及p-AKT的表達(dá)。

綜上所述，2.5、5.0、10.0 mmol/L的丁酸鈉均能明顯降低HeLa細(xì)胞活力，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，使細(xì)胞周期阻滯于G1期，下調(diào)bcl-2、cyclin D1蛋白表達(dá)，上調(diào)BAX及p27蛋白表達(dá)，此過程可能是通過阻斷PI3K/AKT信號通路實(shí)現(xiàn)的。