組織蛋白酶V的研究進(jìn)展

侯昕彤，周慧

（1.沈陽醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)專業(yè)2015級19班，遼寧 沈陽 110034；2.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室）

20世紀(jì)20年代，組織蛋白酶一詞首次被提出，并被定義為存在于溶酶體中的蛋白水解酶，在低等到高等生物中均有分布［1］?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)有約50種組織蛋白酶，目前對絲氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶的研究較為深入和廣泛［2］。在溶酶體蛋白酶體系中，半胱氨酸蛋白酶發(fā)揮著相對重要的作用。

半胱氨酸蛋白酶在生物體內(nèi)分布廣泛，目前在人類基因組測序中共發(fā)現(xiàn)了11種相關(guān)酶類［2］，在溶酶體這種具有還原性和微酸性的環(huán)境中，能保持最佳活性狀態(tài)，其功能是使大量非特異性的內(nèi)源性或外源性蛋白質(zhì)發(fā)生水解、降解［3］。但有研究發(fā)現(xiàn)，半胱氨酸蛋白酶可以參與到體內(nèi)某些特異性的生理活動中，當(dāng)該酶系的動態(tài)平衡發(fā)生異常或遭到破壞時，很可能導(dǎo)致某些疾病的發(fā)生和發(fā)展。人組織蛋白酶主要分為兩大亞族，一種是組織蛋白酶L-like家族，包括組織蛋白酶L、V、K、S、H、W和F，它們共同含有GNFD 和ERFNIN兩個保守基序；另一種是組織蛋白酶B-like家族，只包括含有GNFD基序的組織蛋白酶B［4］。

組 織 蛋 白 酶 V（cathepsin V，CTSV），是Santamaría等于1998年首次發(fā)現(xiàn)的，因其與組織蛋白酶L（CTSL）有78%的同源性，所以又稱為組織蛋白酶L2，是由CTSV基因編碼的蛋白質(zhì)，屬于半胱氨酸蛋白酶肽鏈端解酶，在pH值為4時發(fā)揮最佳生理活性［5］。CTSV基因定位于9q22.2染色體，由8個外顯子和7個內(nèi)含子組成，在人角膜上皮、胸腺和睪丸中高表達(dá)［6］，在結(jié)腸癌和乳腺癌中也有表達(dá)，而在正常結(jié)腸和乳腺中卻不表達(dá)［7］。這種具有局限性的特殊作用發(fā)揮，可以證實(shí)其參與人體的一些特異性活動中。

1 CTSV的分子結(jié)構(gòu)特點(diǎn)

人CTSV是由334個氨基酸構(gòu)成的蛋白質(zhì)，分子質(zhì)量37 329 Da，在細(xì)胞內(nèi)以無活性的酶原前體形式存在，由信號肽、前體肽和成熟肽構(gòu)成［5］。前體肽含有α螺旋結(jié)構(gòu)，可防止活化中心被激活和分化，成熟肽N端殘基與α螺旋方向相反，后者可跨越活性中心與底物結(jié)合，通過自我催化或被其他酶活化發(fā)生作用［8］。CTSV由兩個大小相似的R-結(jié)構(gòu)域和L-結(jié)構(gòu)域構(gòu)成，組織蛋白酶的活性位點(diǎn)位于兩結(jié)構(gòu)域交界面的V形活性區(qū)域，分別是 Cys138、His277和 Asn301［5］。CTSV 的結(jié)構(gòu)見圖1［9］。人CTSV包含3個潛在的N-糖基化位點(diǎn)，位于2、221和292，但被證實(shí)能夠發(fā)生N-糖基化的只有Asn221和Asn292，它們對于CTSV運(yùn)輸?shù)饺苊阁w中起重要作用［9］。Asn221和 Asn292兩個 N-糖基化位點(diǎn)的位置并不接近活性位點(diǎn)。因此，在Asn292N-糖基化可能有助于其底物的直接識別，對Asn292位點(diǎn)N-糖基化的抑制可能會間接影響其酶的活性［9］。

圖1 CTSV的結(jié)構(gòu)［9］

2 CTSV的合成

CTSV由前體肽、信號肽、成熟肽三部分組成，通過前體酶原水解而成為有活性的酶。前體的正確剪切，對于新合成的半胱氨酸蛋白酶多肽鏈的正確折疊和蛋白質(zhì)的穩(wěn)定有重要意義。如果剪切地點(diǎn)發(fā)生異常，半胱氨酸蛋白酶在發(fā)揮作用前與蛋白酶抑制劑結(jié)合從而失去活性。另外，不當(dāng)?shù)膒H條件也會導(dǎo)致組織蛋白酶失活。

在高等哺乳動物體內(nèi)，CTSV的一般合成途徑為：首先，前體酶原在核糖體結(jié)合膜上合成，信號肽將在核糖體上表達(dá)的前體酶原轉(zhuǎn)運(yùn)到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上，信號肽和前體肽間的肽鍵發(fā)生斷裂，信號肽從前體酶原上去除，形成只含前體肽和成熟肽的酶原，因?yàn)榍绑w肽占據(jù)酶原活性中心，酶原無法和相應(yīng)受體結(jié)合，因此不具有催化活性；隨后，酶原被轉(zhuǎn)運(yùn)至胞內(nèi)溶酶體，在溶酶體的酸性條件下發(fā)生自動水解，將前體肽去除，產(chǎn)生具有酶活性的成熟的CTSV；在此步驟中，發(fā)現(xiàn)前體肽也可以作為能夠阻止酶原活性的高親和性可逆抑制劑［10］。

3 CTSV參與的信號通路

研究表明，CTSV是E2F1的促凋亡靶點(diǎn)，E2F1可以直接結(jié)合到CTSV的啟動子上，被外源性和內(nèi)源性E2F1所調(diào)控；RNAi介導(dǎo)的CTSV沉默可以有效消除異位E2F1誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，與溶酶體膜通透性（LMP）的減少和線粒體膜的去極化相關(guān)；CTSV敲低也能抑制DNA損傷所激活的內(nèi)源性E2F1介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡［11］。

4 CTSV的功能

4.1 生理作用 在生物體內(nèi)，CTSV作用廣泛，可以參與如抗原提呈、蛋白水解、T細(xì)胞分選、胚胎發(fā)育以及細(xì)胞凋亡等一系列生理活動過程。

人CTSV參與神經(jīng)遞質(zhì)腦啡肽和神經(jīng)肽Y（neuropeptide Y，NPY）的產(chǎn)生，人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞中，通過siRNA干擾CTSV，可使人類神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞產(chǎn)生的腦啡肽減少80%以上［12］。CTSV在角膜上皮中高表達(dá)，其可以水解纖溶酶原，纖溶酶原也在人角膜中高水平表達(dá)，可產(chǎn)生血管抑制素相關(guān)分子，CTSV對纖溶酶原的加工，導(dǎo)致其釋放血管抑制素分子，從而抑制血管生成，在維持角膜無血管性中發(fā)揮重要作用［13］。缺乏CTSL的小鼠顯示出復(fù)雜的皮膚表型，包括周期性脫發(fā)、表皮增生、棘皮癥和角化過度等，CTSV轉(zhuǎn)基因小鼠與CTSL敲除小鼠雜交，子代小鼠顯示表皮增殖，表皮厚度和頭發(fā)表型的正?；砻鰿TSV水解活性在維持表皮和毛囊中的角質(zhì)形成細(xì)胞特異性功能中發(fā)揮重要作用，并且CTSV可在人皮膚中發(fā)揮類似功能［14］。

在人類免疫功能中，CTSV同樣發(fā)揮重要作用。半胱氨酸蛋白酶影響CD4+T細(xì)胞的陽性選擇，在CTSL缺失的小鼠體內(nèi)，胸腺上皮細(xì)胞中CD4+T細(xì)胞的陽性選擇削弱；在這些胸腺上皮細(xì)胞中也發(fā)現(xiàn)了恒定鏈水解中間產(chǎn)物的積累；但在周邊抗原提呈細(xì)胞中，恒定鏈加工并未受到影響，這說明CTSL特異性地在小鼠胸腺中發(fā)揮功能；在人體內(nèi)，發(fā)揮此功能的是CTSV［15］。

4.2 病理作用 CTSV是人胸腺皮質(zhì)上皮細(xì)胞中的優(yōu)勢半胱氨酸蛋白酶，與健康對照組相比，神經(jīng)肌肉系統(tǒng)的自身免疫性疾病重癥肌無力患者的胸腺中CTSV表達(dá)水平顯著更高，提示CTSV可能參與重癥肌無力的免疫發(fā)病機(jī)制［16］。

有研究表明，CTSV與人乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。當(dāng)藥物作用于乳腺癌細(xì)胞使其溶酶體膜受到破壞時，CTSV作為溶酶體蛋白酶，大量彌散于細(xì)胞質(zhì)中引發(fā)自噬［17］。

動脈粥樣硬化是一種慢性炎性病變，以動脈管壁的增厚、彈性喪失和血管壁的細(xì)胞外基質(zhì)大量重塑為主要病理特點(diǎn)，其中膠原蛋白和彈性蛋白起重要作用［18-19］。CTSV在人類單核細(xì)胞源性巨噬細(xì)胞表達(dá)，是迄今為止人類最具彈性蛋白解離活性的組織蛋白酶，CTSV的增加會加速病變動脈的彈性蛋白基質(zhì)的破壞，從而加速動脈粥樣硬化病變的形成［19］。炎性細(xì)胞因子腫瘤壞死因子-α（TNF-α）和單核細(xì)胞的結(jié)合會刺激CTSV的表達(dá)并活化內(nèi)皮細(xì)胞，在心血管疾病中負(fù)責(zé)發(fā)起局部蛋白的水解［20］。

1型糖尿病是自身免疫病，在1型糖尿病患者的血液中可查出多種自身抗體，這些異常的自身抗體可以損傷人體胰島β細(xì)胞［21］，使之不能正常分泌胰島素。Viken等［21］研究發(fā)現(xiàn)，位于CTSV基因下游的rs16919034多態(tài)性與1型糖尿病相關(guān)，并且還發(fā)現(xiàn)位于CTSV基因上游的另一rs4361859多態(tài)性與早發(fā)性重癥肌無力相關(guān)。

綜上所述，CTSV參與多種機(jī)體生理和病理過程，CTSV抑制劑具有較好的應(yīng)用前景，針對其作用特點(diǎn)，尋找其相應(yīng)的選擇性、可逆性抑制劑用于臨床疾病的治療，值得進(jìn)一步研究和探索。

通過對CTSV的深入了解和研究，可以為今后開發(fā)抗腫瘤藥物，如乳腺癌和大腸癌等，治療人重癥肌無力、1型糖尿病等免疫疾病及治療動脈粥樣硬化等疾病提供新思路，有著重要的學(xué)術(shù)價值和社會效益。