天麻素干預(yù)對(duì)甲基苯丙胺染毒大鼠血清及腦海馬組織TNF-α、IL-1β及BDNF含量的影響

陳曉雷，王琳，周天竹，楊秀麗，李新新

（1．沈陽醫(yī)學(xué)院法醫(yī)司法鑒定所，遼寧 沈陽 110034；2．沈陽二四五醫(yī)院內(nèi)科）

天麻素（4-羥甲基苯甲醇-β-D-吡喃葡萄糖苷）為中藥天麻的主要化學(xué)成分之一，具有促智、健腦、抗衰老的作用，臨床用于神經(jīng)衰弱、神經(jīng)衰弱綜合征及血管神經(jīng)性頭痛（如偏頭痛、三叉神經(jīng)痛、枕骨大神經(jīng)痛等），亦可用于腦外傷性綜合征等的治療［1］。有關(guān)天麻素對(duì)依賴性藥物引起腦組織損傷的干預(yù)及保護(hù)作用研究機(jī)制報(bào)道不一。本實(shí)驗(yàn)觀察天麻素對(duì)甲基苯丙胺（methamphetamine，MA）染毒大鼠腦海馬組織炎癥因子、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（BDNF）含量的變化，探討天麻素干預(yù)對(duì)MA染毒引起大鼠血清及腦組織損傷的保護(hù)作用，為天麻素用于依賴性藥物的干預(yù)及治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1．1 動(dòng)物 健康雄性Wistar大鼠50只，體重（200±20）g，沈陽醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)：SCXK（遼）2012－0001。自由進(jìn)食、飲水，適應(yīng)性分籠飼養(yǎng)1周。

1．2 藥品與試劑 MA（純度90%，丹東市公安局提供）；天麻素注射液購自上?，F(xiàn)代哈森（商丘）藥業(yè)有限公司（國藥準(zhǔn)字H20166464）；腫瘤壞死因子（TNF-α）試劑盒、白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）試劑盒及BDNF試劑盒均購自上?；鈱?shí)業(yè)有限公司；其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1．3 方法

1．3．1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及MA慢性依賴動(dòng)物模型制作 將Wistar大鼠隨機(jī)分為空白對(duì)照組、MA模型組、MA+天麻素干預(yù)低劑量組（MA+50 mg/kg）、天麻干預(yù)高劑量組（MA+100 mg/kg）及天麻素藥物對(duì)照組，每組10只。參照文獻(xiàn)方法［2-3］，按照 0．5、1、2、8、10、15和20 mg/kg的劑量逐日遞增腹腔注射MA，每天給藥2次（8：00，20：00），從第8天開始維持20 mg/kg的劑量；在MA造模的同時(shí)，MA+天麻素（50、100 mg/kg）干預(yù)組每天1次腹腔注射天麻素（50 mg/kg、100 mg/kg），用以干預(yù)性治療。連續(xù)染毒及給藥10 d，自由進(jìn)食、飲水。天麻素藥物對(duì)照組每天一次腹腔注射天麻素100 mg/kg；空白對(duì)照組，每日腹腔注射相同體積的生理鹽水。每天大鼠給藥后1 h內(nèi)進(jìn)行行為學(xué)觀察。

1．3．2 造模評(píng)估指標(biāo) 大鼠刻板行為評(píng)分參照GHF-Dodd方法［3-4］進(jìn)行評(píng)價(jià)。腹腔注射MA后每10 min評(píng)分一次。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：0分，靜止不動(dòng)或幾乎沒有活動(dòng)；1分，正常活動(dòng)，偶爾有向前運(yùn)動(dòng)；2分，活動(dòng)伴隨反復(fù)向前探索；3分，繼續(xù)向前探索；4分，重復(fù)抬頭、搖頭或旋轉(zhuǎn)；5分，迅速搖頭，旋轉(zhuǎn)或搖頭的背腹運(yùn)動(dòng)。以刻板行為評(píng)分≥2分以及刻板行為持續(xù)時(shí)間≥15 min，為造模成功。

1．3．3 取材與檢測(cè)方法 于第11天用斷頭器快速斷頭，取血，分離血清；按文獻(xiàn)［5］方法快速冰上分離腦海馬組織，制備10%腦組織勻漿。采用ELISA法檢測(cè)血清及腦海馬組織TNF-α、IL-1β、BDNF含量，每一份樣本進(jìn)行雙孔測(cè)定，嚴(yán)格按說明書進(jìn)行操作。Bio-Rad680型酶標(biāo)儀檢測(cè)酶標(biāo)板各孔OD值，計(jì)算各樣本濃度。

1．4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 13．0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用t檢驗(yàn)進(jìn)行比較，P＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2．1 刻板行為觀察及評(píng)價(jià) 每組選取10只大鼠進(jìn)行行為學(xué)觀察。隨著MA注射劑量逐漸增大，大鼠刻板行為表現(xiàn)增多，給予MA 2 mg/kg起，給藥后約10 min左右，染毒大鼠出現(xiàn)偶爾向前運(yùn)動(dòng)、向前探索；重復(fù)抬頭、搖頭或旋轉(zhuǎn)的背腹運(yùn)動(dòng)。易激惹、豎尾、撕扯腹部皮膚等自殘行為?？贪逍袨榧s持續(xù)20～30 min緩解，而后出現(xiàn)嗜睡、精神萎靡、活動(dòng)量下降，進(jìn)食減少。隨著給藥時(shí)間的延長與給藥次數(shù)的増多，刻板行為逐漸減少。MA+天麻素干預(yù)組（50、100 mg/kg）的大鼠會(huì)隨著天麻素注射的増多而出現(xiàn)明顯的嗜睡。

2．2 ELISA檢測(cè)大鼠腦海馬組織TNF-α、IL-1β、BDNF含量 與對(duì)照組比較，MA染毒模型組TNF-α、IL-1β含量均有顯著增加，BDNF含量降低（P＜0．01）。與MA染毒模型組比較，MA+天麻素干預(yù)組（50 mg/kg）TNF-α含量降低（P＜0．05），BDNF含量增高（P＜0．01）；MA+天麻素干預(yù)組（100 mg/kg）TNF-α、IL-1β 含量均顯著降低，BDNF含量顯著增高（P＜0．01）。天麻素組與對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與MA染毒模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．01）。見表1。

2．3 ELISA 檢測(cè)大鼠血清 TNF-α、IL-1β、BDNF含量變化 與對(duì)照組比較，MA染毒模型組TNF-α、IL-1β含量增高，BDNF含量降低（P＜0．01）。與MA染毒模型組比較，MA+天麻素干預(yù)組（50 mg/kg）IL-1β含量降低（P＜0．05）；MA+天麻素干預(yù)組（100 mg/kg）TNF-α、IL-1β含量均顯著降低，BDNF含量顯著增高（P＜0．01）。天麻素組與對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與MA染毒模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．01）。見表2。

表1 大鼠腦海馬組織TNF-α、IL-1β、BDNF的表達(dá)水平比較（±s，n=10）

表1 大鼠腦海馬組織TNF-α、IL-1β、BDNF的表達(dá)水平比較（±s，n=10）

注：與對(duì)照組比，1）P＜0．01；與 MA模型組比較，2）P＜0．05，3）P＜0．01

組別空白對(duì)照組MA模型組MA+天麻素干預(yù)低劑量組MA+天麻素干預(yù)高劑量組天麻素組BDNF（pg/mg）350.49±32.69 105.30±39.331）299.27±27.133）301.16±35.173）356.31±30.023）劑量（mg/kg）等量鹽水50 100 100 TNF-α（pg/mg）113.52±58.09 231.99±48.411）182.72±37.062）144.46±46.193）109.81±40.273）IL-1β（pg/mg）108.97±51.21 374.06±43.851）333.92±51.72 262.29±81.683）112.38±38.193）

表2 大鼠血清TNF-α、IL-1β、BDNF的含量比較（±s，n=10）

表2 大鼠血清TNF-α、IL-1β、BDNF的含量比較（±s，n=10）

注：與對(duì)照組比較，1）P＜0．01；與MA模型組比較，2）P＜0．05，3）P＜0．01

組別空白對(duì)照組MA模型組MA+天麻素低劑量干預(yù)組MA+天麻素高劑量干預(yù)組天麻素組BDNF（pg/ml）125.26±28.03 82.65±23.221）98.58±32.71 103.91±35.363）120.13±26.013）劑量(mg/kg)等量鹽水50 100 100 TNF-α（pg/ml）146.91±30.29 228.29±44.111）202.94±31.04 196.71±58.763）140.53±31.023）IL-1β（pg/ml）41.74±21.77 95.61±42.631）87.65±37.572）62.99±26.293）50.07±21.183）

3 討論

MA屬于苯丙胺類興奮劑，具有較強(qiáng)的神經(jīng)毒性，長期濫用因慢性中毒而出現(xiàn)體質(zhì)下降，認(rèn)知功能障礙及各種精神障礙，出現(xiàn)幻聽、幻視，甚至是精神分裂癥樣癥狀或嚴(yán)重抑郁癥狀。MA引起的神經(jīng)毒性有多種機(jī)制，主要包括神經(jīng)元凋亡、谷氨酸介導(dǎo)的興奮性毒性、氧化應(yīng)激、細(xì)胞因子的形成、線粒體功能紊亂及神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的活化等［6］。

MA濫用引起的腦神經(jīng)損傷可能與小膠質(zhì)細(xì)胞過度激活有關(guān)。在毒品濫用、外傷和多種神經(jīng)退行性腦病死亡者的尸檢中，發(fā)現(xiàn)腦內(nèi)有激活的小膠質(zhì)細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞及一系列免疫反應(yīng)產(chǎn)物的高表達(dá)，如TNF-α、IL-1、IL-6及補(bǔ)體等，而正常人無此反應(yīng)［7］。在動(dòng)物模型中MA中毒導(dǎo)致的記憶損傷、學(xué)習(xí)障礙，是通過小膠質(zhì)細(xì)胞激活反應(yīng)和腫瘤壞死因子系統(tǒng)作用在海馬神經(jīng)元，導(dǎo)致海馬神經(jīng)元功能障礙引起的［8］。小膠質(zhì)細(xì)胞在中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后是最早發(fā)生反應(yīng)的細(xì)胞，它不停地清除著中樞神經(jīng)系統(tǒng)中損壞的神經(jīng)及感染性物質(zhì)，是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的第一道免疫防線。中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷可激活小膠質(zhì)細(xì)胞，在神經(jīng)系統(tǒng)損害發(fā)生發(fā)展的過程中過多激活或失控的小膠質(zhì)細(xì)胞會(huì)引起神經(jīng)毒性，活化的小膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生大量興奮性神經(jīng)毒性氨基酸，合成、釋放多種細(xì)胞因子（如IL-1、一氧化氮等），介導(dǎo)細(xì)胞炎癥反應(yīng)引起炎癥損傷，通過啟動(dòng)中樞神經(jīng)系統(tǒng)免疫應(yīng)答，過度的免疫反應(yīng)、補(bǔ)體激活、抗體依賴的細(xì)胞毒等殺傷、吞噬作用對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)均具有損害作用［9］。

TNF-α在正常腦組織中水平極低，當(dāng)腦組織損傷時(shí)，由星形細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞及血管內(nèi)皮細(xì)胞等釋放。TNF-α是具有多種生物效應(yīng)的細(xì)胞因子，是中樞神經(jīng)系統(tǒng)參與免疫應(yīng)答和炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)的重要介質(zhì)，發(fā)動(dòng)并且維持中樞神經(jīng)系統(tǒng)的炎性反應(yīng)過程，通過和細(xì)胞膜上的特異性的受體結(jié)合，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞及神經(jīng)細(xì)胞等多種正常細(xì)胞凋亡及炎癥性疾病等病理過程［10］。過度激活的小膠質(zhì)細(xì)胞能大量分泌IL-1β，IL-1β含量的升高會(huì)刺激其他的炎性細(xì)胞因子的表達(dá)，從而對(duì)神經(jīng)組織造成損傷。

BDNF是哺乳動(dòng)物腦組織中濃度最高的神經(jīng)營養(yǎng)因子，在海馬、大腦皮層表達(dá)最為活躍，對(duì)學(xué)習(xí)、記憶和高級(jí)思維有重要作用，對(duì)于神經(jīng)元的生長、分化、存活、可塑性及損傷后的修復(fù)具有重要作用。BDNF與酪氨酸激酶受體結(jié)合后，激活膜受體酪氨酸蛋白激酶信號(hào)傳遞途徑，依次激活胞質(zhì)內(nèi)、核內(nèi)相關(guān)信號(hào)蛋白，激活整個(gè)信號(hào)傳遞系統(tǒng)從而發(fā)揮功能作用。BDNF可調(diào)節(jié)多巴胺與五羥色胺的含量，促使多巴胺能神經(jīng)生長，具有對(duì)抗MA毒性的作用，BDNF通過増強(qiáng)細(xì)胞內(nèi)抗氧化物質(zhì)的活性，使神經(jīng)細(xì)胞產(chǎn)生的自由基被分解，實(shí)現(xiàn)對(duì)損傷神經(jīng)細(xì)胞的修復(fù)［11］。

天麻素（gastrodin）是傳統(tǒng)中草藥天麻的有效活性成分之一，對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)及免疫系統(tǒng)都有著廣泛的藥理作用，能擴(kuò)張腦血管、增加腦血流量、提高腦細(xì)胞的抗缺氧及損傷能力，天麻素可通過抗氧化損傷、抗炎癥損傷、抗細(xì)胞凋亡三個(gè)方面發(fā)揮腦損傷治療作用［12］。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)MA依賴模型大鼠血清及腦海馬組織IL-1β、TNF-α含量明顯升高，MA依賴大鼠表現(xiàn)出明顯的刻板行為，在給予天麻素干預(yù)治療后MA依賴大鼠血清及腦海馬組織IL-1β、TNF-α含量呈明顯降低趨勢(shì)，MA依賴大鼠的刻板行為減少。炎癥細(xì)胞因子作為人體重要的炎癥介質(zhì)，參與腦損傷后多種病理生理過程，炎性反應(yīng)與MA依賴者機(jī)體的神經(jīng)免疫系統(tǒng)功能紊亂有密切關(guān)系。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示天麻素以其抗氧化、抗炎效應(yīng)，降低炎癥因子水平，減少M(fèi)A對(duì)依賴大鼠海馬神經(jīng)元的損傷。

BDNF對(duì)神經(jīng)元有營養(yǎng)和修復(fù)作用，其機(jī)制主要通過激活星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)源性抗氧化系統(tǒng)Nrf2/ARE信號(hào)通路，減少氧化損傷，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用［13］。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，MA依賴模型大鼠血清及腦海馬組織BDNF含量降低，天麻素干預(yù)后使MA依賴大鼠血清及腦組織BDNF含量升高，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明天麻素增強(qiáng)了MA依賴者神經(jīng)元損傷后的修復(fù)作用。

MA對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)的損傷機(jī)制十分復(fù)雜，天麻素對(duì)MA依賴大鼠腦神經(jīng)損傷的干預(yù)和保護(hù)是通過哪些途徑和機(jī)制實(shí)現(xiàn)的還有待于進(jìn)一步系統(tǒng)研究。