應(yīng)用Logistic方程確定巨龍竹葉片低溫半致死溫度

徐 田，畢 瑋,2，陳 劍,2

(1.云南省林業(yè)科學(xué)院，云南 昆明 650201; 2.國(guó)家林業(yè)局重點(diǎn)開(kāi)放性實(shí)驗(yàn)室云南珍稀瀕特森林植物保護(hù)和繁育實(shí)驗(yàn)室；云南省森林植物培育與開(kāi)發(fā)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650201)

巨龍竹(Dendrocalamussinicus)又名歪腳龍竹，禾本科竹亞科牡竹屬竹種，稈高20～30 m，直徑20～30 cm，花期10月至次年5月，果期12月至次年7月[1-3]。巨龍竹是目前所知世界上最高大的竹子，也是生長(zhǎng)最快，稈形最高大，單稈出材率和單位面積產(chǎn)量最高的竹種，單稈重量可達(dá)79～100 kg，每叢平均有15～30株，其生長(zhǎng)速度快、經(jīng)濟(jì)用途廣、生態(tài)效益顯著的特點(diǎn)，使其作為特色明顯的資源之物，有很大的開(kāi)發(fā)潛力和廣泛的應(yīng)用前景。并且巨龍竹地下莖根系統(tǒng)發(fā)達(dá)，有很好的固土保水能力，是優(yōu)良的生態(tài)防護(hù)竹種。巨龍竹是熱性巨大型叢生竹，分布區(qū)域非常狹窄，就目前所知巨龍竹僅分布于我國(guó)云南的西南部邊緣的熱帶和南亞熱帶中山山地，海拔500～1 870 m，年均氣溫15～22.5 ℃，極端低溫不低于-5.4 ℃，最冷月平均氣溫不低于10 ℃，年總光照時(shí)數(shù)在1 800 h以上，年平均有霜日數(shù)不超過(guò)12 d，年平均降雨量1 278 mm以上[4]。以普洱市的西盟、瀾滄、孟連和臨滄市的滄源、耿馬、雙江、鎮(zhèn)康、永德為原產(chǎn)地，在西雙版納的勐海、景洪、勐臘等地的河谷壩區(qū)引種栽培。因巨龍竹分布區(qū)也是佤族、傣族、拉祜族等少數(shù)民族聚集區(qū)，其在種質(zhì)資源、地理分布、人文文化上都具有不可替代性，是非常珍稀、特有的竹種。由于具有較大的推廣價(jià)值和較窄的分布范圍，對(duì)于巨龍竹的抗逆性研究已經(jīng)迫在眉睫。溫度成為巨龍竹擴(kuò)大分布范圍的關(guān)鍵性制約因素，對(duì)于其抗寒性能的研究，已成為推廣巨龍竹需解決的首要問(wèn)題，也是發(fā)展巨龍竹產(chǎn)業(yè)的重中之重[1-3]。

植物抗寒性是植物抵御外界低溫等不良環(huán)境時(shí)表現(xiàn)的自適應(yīng)能力，這種能力包括了植物自身的遺傳變異以及環(huán)境對(duì)植物的自然選擇[5]。自然界中，影響植物生長(zhǎng)的最為重要的環(huán)境因子之一是溫度，它很大程度上決定了植物的一些生長(zhǎng)發(fā)育、生命進(jìn)程等生命重要環(huán)節(jié)[6]。決定植物的分布和引種最重要的因素之一是溫度，低溫會(huì)對(duì)植物生長(zhǎng)、結(jié)果、生產(chǎn)等產(chǎn)生嚴(yán)重危害。低溫脅迫指環(huán)境溫度在植物正常生長(zhǎng)所需最適溫度以下，包括冷害和凍害[7-8]。朱根海等的研究表明應(yīng)用相對(duì)電導(dǎo)率和Logistic 方程求拐點(diǎn)溫度能比較準(zhǔn)確地估計(jì)出植物組織的低溫半致死溫度,此方法適用于多種植物的抗寒性研究[9]。試驗(yàn)通過(guò)對(duì)巨龍竹幼苗葉片進(jìn)行人工低溫脅迫，用相對(duì)電導(dǎo)率和Logistic 方程計(jì)算半致死溫度，為以后巨龍竹引種提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)材料用2年生實(shí)生巨龍竹幼苗，巨龍竹多用2年生幼苗在雨季造林，造林后第1個(gè)冬季是對(duì)巨龍竹幼苗抗寒性考驗(yàn)最為嚴(yán)竣的1個(gè)季節(jié)。實(shí)生種子采集于西盟縣中課鄉(xiāng)，地理位置為22°43′41″ N， 99°32′29″ E，海拔1 295 m；中課鄉(xiāng)屬亞熱帶南亞熱帶濕潤(rùn)季風(fēng)氣候，年降雨量2 235 mm，年日照量達(dá)1 693.6 h，干濕氣候分明，土壤主要以磚紅壤和赤紅壤為主，土壤質(zhì)地偏酸，缺鈣少磷。收集到種子后在云南省林業(yè)科學(xué)院樹(shù)木園大棚內(nèi)實(shí)生育苗，云南省林業(yè)科學(xué)院昆明樹(shù)木園土壤類型為紅壤，海拔1 968 m，年平均氣溫14.7 ℃，最高氣溫31.5 ℃，最低氣溫-7.8 ℃，≥10℃的積溫4 799.3 ℃，平均無(wú)霜期280 d，全年日照時(shí)數(shù)≥2 249.3 h；年降水量1 100 mm，相對(duì)濕度72%。

1.2 方法

1.2.1低溫脅迫試驗(yàn)方法 2014年12月進(jìn)行，在巨龍竹苗中部的部位上采集成熟、完整、無(wú)病蟲(chóng)害的葉片，放入已貼好標(biāo)簽的自封袋中，帶回實(shí)驗(yàn)室后用自來(lái)水清洗葉片，然后用蒸餾水沖洗3次，用濾紙將水分吸干。取自封袋的葉片分為5組，以調(diào)溫冰箱為低溫控制設(shè)備，溫度梯度設(shè)置為： 5、0、-5、-10、-15 ℃，每級(jí)溫度處理24 h。根據(jù)以往觀測(cè)，巨龍竹在溫度達(dá)到2～0 ℃時(shí)，表面即有受傷表現(xiàn)，耐受極端低溫為-5.4 ℃，將測(cè)試溫度定于5～-15 ℃之間。每個(gè)梯度處理完畢后，先對(duì)處理后的材料外觀觀測(cè)，之后迅速測(cè)定其相對(duì)電導(dǎo)率。每個(gè)處理測(cè)試3個(gè)樣品，取平均值。

1.2.2相對(duì)電導(dǎo)率的測(cè)定方法 測(cè)定時(shí)，沿葉柄向葉尖處打孔，孔徑0.6 cm，取15片葉圓片放入試管中加入20 mL蒸餾水，封口后在水平搖床上震蕩1 h后在沸水中加熱20 min，冷卻到室溫，蒸餾水設(shè)為空白對(duì)照，用奧利龍150A型電導(dǎo)率儀分別測(cè)定加熱前電導(dǎo)值C1，及加熱后電導(dǎo)值C2，及對(duì)照電導(dǎo)率C0，3次重復(fù)。并按以下公式計(jì)算相對(duì)電導(dǎo)率：

相對(duì)電導(dǎo)率=(C1-C0)/(C2-C0)×100%

式中：C0—蒸餾水電導(dǎo)率；C1—煮前電導(dǎo)率；C2—煮后電導(dǎo)率。

1.3 數(shù)據(jù)計(jì)算

數(shù)據(jù)整理、計(jì)算、匯總以及半致死低溫計(jì)算用Microsoft Office Excel 2010軟件完成，用SPSS 18.0完成重復(fù)測(cè)量方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 溫度對(duì)相對(duì)電導(dǎo)率的影響

經(jīng)過(guò)24 h的人工低溫處理后，在不同的溫度梯度下，巨龍竹葉片在形態(tài)上無(wú)明顯變化，無(wú)褐變，無(wú)失水卷曲。低溫對(duì)植物組織造成傷害后，細(xì)胞膜透性會(huì)受到損壞，細(xì)胞膜內(nèi)電解質(zhì)滲出會(huì)有所變化，細(xì)胞膜透性越大，胞內(nèi)電解質(zhì)外滲量也相應(yīng)增加。相對(duì)電導(dǎo)率是表現(xiàn)低溫造成的細(xì)胞膜受損前后胞內(nèi)電解質(zhì)滲出率。一般認(rèn)為相對(duì)電導(dǎo)率增加的程度一定程度上反映了植物組織細(xì)胞膜受傷害的程度，同時(shí)也反映了細(xì)胞抗性的大小，很多情況下相對(duì)電導(dǎo)率也可作為植物抗寒性強(qiáng)弱評(píng)價(jià)的一個(gè)可靠指標(biāo)[10-11]。

圖1 巨龍竹葉片在低溫脅迫下相對(duì)電導(dǎo)率變化曲線Fig.1 The relative conductivity of bamboo leaves under low temperature stress

隨著溫度的降低，巨龍竹幼苗葉片電導(dǎo)率呈現(xiàn)出逐漸升高的趨勢(shì)(圖1 )，表明溫度與相對(duì)電導(dǎo)率呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。5 ℃到0 ℃時(shí)，相對(duì)電導(dǎo)率只是少量增加，說(shuō)明葉片細(xì)胞膜受傷害不明顯；從0 ℃到-5 ℃時(shí)，電導(dǎo)率急劇升高，由32%迅速上升到68%，說(shuō)明當(dāng)溫度下降至-5 ℃時(shí)，巨龍竹葉片細(xì)胞膜受傷害嚴(yán)重；之后上升速度又趨于平緩。隨溫度的降低，相對(duì)電導(dǎo)率變化曲線呈“S”型，相對(duì)電導(dǎo)率隨溫度的變化基本遵循Logistic 曲線的變化規(guī)律，即呈緩慢增加、快速增加、平緩增加的趨勢(shì)，因此降溫對(duì)膜透性破壞性效應(yīng)的最大值在S 曲線上為拐點(diǎn)所對(duì)應(yīng)的數(shù)值，在抗寒研究上即為低溫半致死溫度(LT50)[12-13]。

2.2 配合Logistic方程求半致死溫度

Sukumaran 等提出電解質(zhì)外滲率50%時(shí)的溫度為組織的低溫半致死溫度[14],而朱根海等認(rèn)為可以用Logistic 方程中拐點(diǎn)溫度來(lái)表示植物組織的低溫半致死溫度(LT50)[9],羅正榮等認(rèn)為細(xì)胞電解質(zhì)外滲率(REC)配以Logistic 方程兩者具有很好的擬合度[15]。Logistic方程是一個(gè) “S”型曲線方程，其擬合方程為y=k/(1+ae-bx)(k，a，b為常數(shù))，拐點(diǎn)溫度為半致死溫度(LT50)，即(d2y/dx2)=0時(shí)的x值[16]。根據(jù)本實(shí)驗(yàn)巨龍竹幼苗葉片在低溫處理下的電導(dǎo)率，擬合Logistic方程：Y=K/(1+ae-bt)，擬合值R為0.907(P<0.05)，呈顯著水平，說(shuō)明在巨龍竹抗寒研究中，不同低溫處理的電解質(zhì)外滲率遵循Logistic方程的變化規(guī)律，其擬合結(jié)果比較可靠，精確度較高[16]。確定拐點(diǎn)溫度(LT50)，即為其半致死溫度為-2.16 ℃，具體的Logistic方程及參數(shù)、半致死溫度見(jiàn)表1。

表1 巨龍竹低溫半致死溫度Tab.1 The semi-lethal low temperature of Dendrocalamus sinicus

3 結(jié)論

低溫脅迫傷害時(shí)，植物最先受損部位是膜系統(tǒng)，低溫會(huì)引起細(xì)胞膜的不均勻收縮、膜脂相變、膜脂過(guò)氧化以及冰凍造成的機(jī)械脅迫等都會(huì)傷害到細(xì)胞，細(xì)胞膜的半透性喪失，細(xì)胞電解質(zhì)外滲，細(xì)胞膜損傷越嚴(yán)重則離子滲出率越高，因此可通過(guò)測(cè)定電解質(zhì)滲漏情況來(lái)確定植物的受害程度[11]。

試驗(yàn)結(jié)果表明，經(jīng)過(guò)24 h的人工低溫處理后，在不同的溫度梯度下，巨龍竹葉片在形態(tài)上無(wú)明顯變化，無(wú)褐變，無(wú)失水卷曲；巨龍竹葉片經(jīng)過(guò)低溫脅迫后，隨溫度的降低相對(duì)電導(dǎo)率會(huì)增加，呈“S”型變化，應(yīng)用Logistic方程計(jì)算其半致死溫度為-2.16 ℃，相關(guān)系數(shù)0.907，表明低溫脅迫下的相對(duì)電導(dǎo)率遵循Logistic 方程的變化規(guī)律。

4 討論

試驗(yàn)所設(shè)置的低溫脅迫時(shí)間是24 h，對(duì)于48、72 h及更長(zhǎng)時(shí)間的持續(xù)低溫脅迫是否適用還需進(jìn)一步驗(yàn)證。同時(shí)試驗(yàn)僅研究了低溫脅迫下2年生巨龍竹幼苗的離體葉片，對(duì)于多年生以及整株的測(cè)定還需進(jìn)一步研究。

植物生理過(guò)程是極其復(fù)雜的，影響巨龍竹抗寒性能的因素也是多方面的，要進(jìn)一步研究其抗寒機(jī)能，需要綜合其他生理生化指標(biāo)進(jìn)行全面評(píng)價(jià)。

圖2 低溫脅迫后巨龍竹幼苗葉片狀態(tài)Fig.2 Leaf state of Dendrocalamus sinicus seedlings after low temperature stress