高效液相色譜法測(cè)定復(fù)方銀杏通脈口服液中總黃酮醇苷含量*

張 耕，劉 譯，唐 勇，楊躍龍

（湖南省懷化市食品藥品檢驗(yàn)所，湖南 懷化 418000）

復(fù)方銀杏通脈口服液主要由銀杏葉、（制）何首烏、女貞子、丹參、杜仲、川牛膝、鉤藤7種中藥組方，具有滋陰補(bǔ)腎、舒肝通脈功效，臨床主要用于治療中老年人輕度腦動(dòng)脈硬化所致頭暈頭痛、耳鳴耳聾、視物模糊、記憶力減退、腰膝酸軟、肢體麻木等。復(fù)方銀杏通脈口服液現(xiàn)行國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)中，只對(duì)制何首烏有液相含量定量測(cè)定，而銀杏葉檢驗(yàn)只有銀杏葉對(duì)照藥材薄層色譜定性鑒別，沒有銀杏葉相關(guān)液相含量定量測(cè)定?，F(xiàn)有研究表明，銀杏葉主要有效活性成分為總黃酮醇苷（槲皮素、山柰素與異鼠李素）和萜類內(nèi)酯，總黃酮醇苷具有活血化瘀、通絡(luò)止痛、斂肺平喘、化濁調(diào)脂等功效。有關(guān)銀杏總黃酮醇苷的研究報(bào)道［1-16］較多，為了更有效地控制產(chǎn)品質(zhì)量，本研究中參照 2015 年版《中國(guó)藥典（一部）》［17］銀杏葉總黃酮醇苷含量測(cè)定項(xiàng)相關(guān)方法，對(duì)復(fù)方銀杏通脈口服液中總黃酮醇苷采用高效液相色譜（HPLC）法進(jìn)行定量分析，以完善該制劑現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1．1 儀器

LC-20AT型高效液相色譜儀（包括LC-20AT四元泵，SPD-M20A紫外檢測(cè)器，SIL-20A自動(dòng)進(jìn)樣器，LCsolution色譜工作站，日本島津公司）；HH-6型數(shù)顯恒溫水浴鍋（溫度控制范圍0．0～100．0℃，常州智博瑞儀器制造有限公司）；XSE105DU型十萬(wàn)分之一電子分析天平（梅特勒-托利多公司）；Direct-Q3型純水機(jī)（美國(guó)密理博公司）。

1．2 試藥

槲皮素對(duì)照品（純度為98．1%，批號(hào)為100081-201509），山柰素對(duì)照品（純度為 93．2% ，批號(hào)為110861-201310），異鼠李素對(duì)照品（純度為 100．0%，批號(hào)為110860-200608），均由中國(guó)食品藥品檢定研究院提供，供含量測(cè)定用；復(fù)方銀杏通脈口服液（規(guī)格為每瓶 1 mL，批號(hào)分別為 20160305，20160306，20160401，湖南補(bǔ)天藥業(yè)有限公司）；陰性樣品（規(guī)格為每瓶10 mL，批號(hào)為20160127，湖南補(bǔ)天藥業(yè)有限公司）；甲醇（色譜純，批號(hào)為 I0887507 717，Merck KgaA公司）；磷酸（色譜純，批號(hào)為20170801001，天津賽孚瑞科技有限公司）；鹽酸（優(yōu)級(jí)純，批號(hào)為20161128，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；水為Millipore Direct-Q3型純水機(jī)制備的超純水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2．1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

色譜柱：Shimadzu C18柱（250 mm ×4．6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：甲醇-0．4%磷酸溶液（55∶45）；流速：1．0mL／min；柱溫：25 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：360 nm；進(jìn)樣量：10 μL。理論板數(shù)按槲皮素峰計(jì)應(yīng)不低于2 500，分離度按山柰素與異鼠李素峰計(jì)算應(yīng)大于1．5。

2．2 溶液制備

對(duì)照品溶液：分別稱取槲皮素、山柰素與異鼠李素對(duì)照品 20．20，21．41，10．60 mg，精密稱定，置 100 mL容量瓶中，加甲醇使溶解并稀釋至刻度，搖勻，再精密量取15 mL，置200 mL容量瓶中，加甲醇使溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得每1 mL含槲皮素、山柰素與異鼠李素對(duì)照品分別為 14．86，14．96，7．95 μg 的混合對(duì)照品溶液。

供試品溶液：取裝量差異項(xiàng)下的本品，混合均勻，精密量取10 mL，加甲醇 16 mL，18%鹽酸8．0 mL，置沸水浴中加熱回流90 min后，自然冷卻至室溫，移至50 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，混勻，用0．45 μm微孔濾膜濾過，取濾液，作為供試品溶液。

陰性對(duì)照品溶液：取陰性樣品，按供試品溶液制備方法制得陰性對(duì)照品溶液。

2．3 方法學(xué)考察

專屬性試驗(yàn)：分別精密吸取2．2項(xiàng)下3種溶液各10 μL，按擬訂色譜條件注入色譜儀，測(cè)定。結(jié)果陰性對(duì)照品溶液色譜中，在與供試品溶液相同保留時(shí)間處無(wú)色譜峰出現(xiàn)，表明陰性對(duì)照無(wú)干擾。詳見圖1。

圖1 高效液相色譜圖

線性關(guān)系考察：精密吸取含槲皮素、山柰素與異鼠李素的混合對(duì)照品溶液各10 μL，質(zhì)量濃度分別為（1．48，1．49，0．79），（1．98，1．99，1．06），（3．96，3．99，2．12），（5．94，5．98，3．18），（7．92，7．98，4．24），（9．90，9．97，5．30），（14．86，14．96，7．95）μg ／mL，進(jìn)樣 10 μL，以峰面積（Y）為縱坐標(biāo)、質(zhì)量濃度（X）為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程。結(jié)果見表1。

表1 線性關(guān)系考察結(jié)果（n＝7）

精密度試驗(yàn)：精密吸取同一含槲皮素、山柰素與異鼠李素對(duì)照品溶液各10 μL，按擬訂色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次。結(jié)果峰面積平均值槲皮素為207 448．2，山柰素為191 774．5，異鼠李素為 71 797，RSD分別為 0．75% ，0．38%，0．81%（n＝6），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取同一批（批號(hào)為20160401）樣品，依法制備供試品溶液，分別于 0，1，2，4，8，12 h 時(shí)進(jìn)樣10 μL，記錄峰面積。結(jié)果峰面積的平均值槲皮素為221 367．8，山柰素為 205 558，異鼠李素為 78 177，RSD分別為 0．43% ，0．47% ，0．98% （n＝6），表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗(yàn)：取同一批（批號(hào)為20160401）樣品，依法平行制備供試品溶液6份，按擬訂色譜條件分別進(jìn)樣10 μL測(cè)定。結(jié)果峰面積的平均值槲皮素為201 601，山柰素為190 075．5，異鼠李素為71 065，RSD分別為0．76%，1．35%，1．44%（n＝6），表明方法重復(fù)性良好。

定量限檢測(cè)：稱取槲皮素、山柰素、異鼠李素對(duì)照品，精密稱定，配成每 1 mL 各含 0．150，0．150，0．075 μg的混合溶液，取20 μL注入液相色譜儀。結(jié)果表明，信噪比（S／N）≈10時(shí)，槲皮素、山柰素、異鼠李素的定量限分別為 0．003 0，0．003 0，0．001 5 μg。

加樣回收試驗(yàn)：分別精密量取6份已知含量的樣品（批號(hào)為 20160401，質(zhì)量濃度為槲皮素 25．70 μg ／mL、山柰素 22．75 μg ／mL、異鼠李素 9．78 μg ／mL）溶液7 mL，分別精密加入混合對(duì)照品溶液（質(zhì)量濃度為槲皮素 49．54 μg／mL、山 柰 素 49．88 μg ／mL、異 鼠 李 素26．50 μg ／mL）3 mL，按供試品溶液制備方法制備溶液，進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算回收率。結(jié)果見表2至表4。

2．4 樣品含量測(cè)定

按外標(biāo)法以峰面積分別計(jì)算槲皮素、山柰素與異鼠李素的含量，以下列公式換算成總黃酮醇苷的含量：總黃酮醇苷含量＝（槲皮素含量+山柰素含量+異鼠李素含量）×2．51。結(jié)果見表 5。

表2 槲皮素加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n＝6）

表3 山柰素加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n＝6）

表4 異鼠李素加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n＝6）

表5 樣品中總黃酮醇苷的含量測(cè)定結(jié)果（μg／mL，n＝3）

3 討論

3．1 水浴溫度及回流時(shí)間選擇

試驗(yàn)表明，水浴溫度及回流時(shí)間對(duì)酸水解結(jié)果影響較大。取同一批樣品（批號(hào)為20160401）測(cè)定，當(dāng)水浴溫度為85℃、回流時(shí)間為45 min，測(cè)得總黃酮醇苷含量為108．43 μg ／mL；85 ℃ ，60 min，含量為 117．84 μg ／mL；90 ℃，60 min，含量為 135．85 μg／mL；90 ℃，90 min，含量為 141．27μg／mL；100℃，90min，含量為 144．65μg／mL；100 ℃ ，105 min，含量為 142．39 μg ／mL。最終選擇總黃酮測(cè)得含量最高的條件（即100℃水浴中加熱回流90 min）對(duì)樣品進(jìn)行酸水解。

3．2 流動(dòng)相選擇

曾采用2015年版《中國(guó)藥典（一部）》銀杏葉中總黃酮醇苷含量測(cè)定方法中采用的流動(dòng)相條件，即甲醇-0．4%磷酸溶液（50∶50），對(duì)樣品進(jìn)行測(cè)定，但山柰素峰與異鼠李素峰分離效果不理想。采用2．1項(xiàng)下流動(dòng)相條件，即甲醇 -0．4%磷酸溶液（55 ∶45），很好地解決了山柰素峰與異鼠李素峰分離度的問題（＞1．5），符合色譜系統(tǒng)適用性條件要求，可用于本制劑中總黃酮醇苷含量測(cè)定。

3．3 方法適用性

本試驗(yàn)中建立了復(fù)方銀杏通脈口服液中總黃酮醇苷的含量測(cè)定方法，以槲皮素、山柰素和異鼠李素為對(duì)照品，采用HPLC法測(cè)定，方法簡(jiǎn)單、結(jié)果準(zhǔn)確、數(shù)據(jù)重復(fù)性、精密度都良好，方法專屬性較強(qiáng)，適用于復(fù)方銀杏通脈口服液的質(zhì)量控制。