應用微滴式數(shù)字聚合酶鏈式反應定量檢測牛肉制品中的豬源性成分

劉立兵，石蕊寒，項佳林，孫曉霞，付 琦，王金鳳，周 巍，王素華，郭春海，王建昌,*

（1.石家莊海關，河北 石家莊 050051；2.河北省檢驗檢疫科學技術研究院，河北 石家莊 050051；3.河北省食品檢驗研究院，河北 石家莊 050200；4.溫州海關，浙江 溫州 325000）

肉及肉制品摻假事件已是屢見不鮮，也是國內(nèi)外關注的食品安全熱點問題之一。肉類摻假嚴重干擾肉類的市場流通，侵害消費者權益、健康甚至宗教信仰[1-3]。歐盟定量成分聲明（Quantitative Ingredient Declaration，QUID）、美國食品藥品監(jiān)督管理局（Food and Drug Administration，F(xiàn)DA）以及我國食品安全法中關于肉制品成分標識相關內(nèi)容均有明確規(guī)定[4-6]，然而在巨大經(jīng)濟利益的驅使下，不少不法分子仍然鋌而走險，制假售假[7]。

目前，關于肉源性成分的檢驗方法包括近紅外光譜檢測法、色譜分析法、酶聯(lián)免疫分析法和聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）檢測方法，其中PCR檢測法由于具有操作簡便快捷、準確度高、技術成熟且成本相對低廉等優(yōu)點在國內(nèi)外得到了廣泛應用[6,8-9]。肉源性成分PCR檢測法主要分為長度多態(tài)性DNA分析（PCR-restriction fragment length polymorphism，PCRRFLP）、隨機擴增多態(tài)性DNA分析（PCR-random amplified polymorphic DNA，PCR-RAPD）、DNA測序及實時熒光PCR等[10-12]。我國已將實時熒光PCR檢測法作為肉源性成分鑒定的標準方法，關于牛、羊、豬、兔、馬、驢、鹿等動物肉類檢測的國家標準相繼出臺，出入境檢驗檢疫系統(tǒng)也出臺了一系列關于禽類、畜類以及魚類動物的PCR行業(yè)檢測標準，但是相關標準中的方法均是對于DNA的定性檢測[13-14]。

實時熒光PCR技術可以實現(xiàn)對于摻假肉成分的定量分析，但需要建立標準曲線，根據(jù)樣本擴增的循環(huán)閾（cyclic threshold，Ct）值粗略計算DNA含量，操作程序較為復雜，并且實時檢測采集熒光信號在很大程度上會受到PCR擴增效率的影響，從而導致檢測值與真實值存在較大差別，因此在檢測靈敏度和準確度方面均有所欠缺。相對于實時熒光PCR，近年來興起的微滴式數(shù)字PCR（droplet digital PCR，ddPCR）方法通過將PCR體系微滴化，對于每一個微滴進行有無熒光信號的終點檢測，受PCR擴增效率影響較小[15]。此外，ddPCR不需要建立標準曲線，根據(jù)泊松分布能夠精確得出目的基因的起始拷貝數(shù)，實現(xiàn)DNA的絕對定量分析。ddPCR被應用于微生物[16]、轉基因[17]、物種鑒定[18]和醫(yī)學[19]等各個領域，在肉類摻假檢測中也被廣泛應用。王珊[20]、Ren Junan[21]等的研究表明，在肉種成分真?zhèn)舞b定上，ddPCR相較于實時熒光PCR更加科學、準確。目前，應用ddPCR對肉源性成分進行定量檢測主要有2 種方法，一種是建立標準曲線法，另一種是確定固定比值法。蔡一村[14]、苗麗[22-23]等采用建立標準曲線法，通過進行肉制品質量與核酸含量以及核酸含量與基因拷貝數(shù)兩步轉換，將樣本基因拷貝數(shù)換算為肉制品質量，有良好的準確性。任君安等[24]通過計算單位質量羊肉和豬肉中RPA1基因拷貝數(shù)之比這一固定值，無需兩步轉換即可通過樣本基因拷貝數(shù)之比計算相對質量占比，操作簡化、快捷，并且具有更好的定量準確性。面對如今越來越多的對于摻假肉或肉制品中各種肉類真實含量的檢測需求，ddPCR的實際應用價值備受關注。

相對于豬肉，牛肉的蛋白質含量較高，脂肪含量較低，其氨基酸組成相較于其他常見食用肉類更接近人體需求，由于市場供需的影響，其價格也遠高于雞肉、鴨肉、豬肉及其他畜禽肉，因此牛肉中摻雜雞肉[25]、鴨肉[26]、豬肉[27-28]及其他畜禽肉[29]的現(xiàn)象尤為常見。本研究參照GB/T 25165—2010《明膠中牛、羊、豬源性成分的定性檢測方法 實時熒光PCR法》[30]合成豬單拷貝核基因PRNP以及牛單拷貝核基因GH引物探針，通過ddPCR方法檢測單位質量2 種肉樣的基因拷貝數(shù)，并驗證二者比值為一固定值，通過該固定比值來確定2 種肉樣的摻雜質量之比，實現(xiàn)牛肉中摻雜豬肉成分的準確定量檢測，為相關部門的監(jiān)測管理提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

牛肉、豬肉、山羊肉、綿羊肉、雞肉、鴨肉、鵝肉、馬肉、兔肉及狗肉樣品均保存于實驗室，牛肉腸、牛肉卷、牛肉干和牛肉粒樣品均購于超市。

DNA提取試劑盒（Wizard Magnetic DNA Purification System for Food） 美國Promega公司；引物和探針生工生物工程（上海）股份有限公司；擴增預混液（ddPCRTMSupermix for Probes（no dUTP））、微滴生成油、微滴生成卡、膠蓋及熱封膜 美國Bio-Rad公司；96 孔PCR反應板 德國Eppendorf公司。

1.2 儀器與設備

MM400混合型球磨儀 德國萊馳公司；NanoDrop 2000C超微量分光光度計 美國Thermo Scientif i c公司；T-Gradient梯度PCR儀 德國Biometra公司；Bio-Rad QX200 ddPCR微滴生成儀、Droplet Reader和PX1熱封儀美國Bio-Rad公司；SQ2119N料理機 慈溪市西貝樂電器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品處理

將肉樣于料理機中制成肉泥，在65 ℃烘箱中放置16 h烘干，然后置于球磨儀中研磨成粉末，過60 目篩后于4 ℃密封保存，操作過程避免污染。

以精確度為0.1 mg的電子天平稱量豬肉粉和牛肉粉樣本，制備豬肉質量分數(shù)分別為1%、5%、10%、20%、40%、50%、60%、80%、90%、95%和99%的混合肉樣，每份樣本總質量為50 mg。另分別稱取50 mg牛肉、豬肉、山羊肉、綿羊肉、雞肉、鴨肉、鵝肉、馬肉、兔肉、狗肉粉末樣品以及市售牛肉卷、牛肉干、牛肉腸和牛肉粒粉末樣品。

1.3.2 DNA提取和濃度測定

參照Wizard Magnetic DNA Purification System for Food試劑盒操作說明，進行肉粉樣品的DNA提取，提取的DNA樣本用超微量分光光度計測定DNA質量濃度，將各個樣品稀釋至DNA質量濃度10～100 ng/μL，備用。

1.3.3 引物及探針合成

參照GB/T 25165—2010[30]，合成針對豬PRNP基因及牛GH基因的特異性引物和探針。引物及探針序列如表1所示。

表 1 豬PRNP及牛GH基因PCR檢測用引物和探針Table 1 Primer and probe sequences targeting swine PRNP and bovine GH genes

1.3.4 ddPCR檢測體系的建立

ddPCR反應體系如表2所示。20 μL反應體系充分混勻后短暫離心，加入到DG8 Cartridge的8 個樣品孔內(nèi)；在每個油孔中加入70 μL微滴生成油，然后蓋上膠墊置于微滴生成儀中生成油包水微滴；將生成的微滴全部轉移至96 孔PCR反應板中，封膜后進行擴增，反應條件為：95 ℃、 8 min，94 ℃、30 s，60 ℃、1 min，40 個循環(huán)；98 ℃、10 min；4 ℃保存，最后通過微滴讀取儀進行讀數(shù)。

表 2 ddPCR擴增體系Table 2 Amplif i cation system for ddPCR

1.3.5 引物、探針特異性及靈敏性檢測

采用ddPCR方法，分別用牛GH基因和豬PRNP基因引物探針對牛肉、豬肉、山羊肉等10 種常見食用肉類的DNA進行擴增，檢測2 種引物探針的特異性。

將提取的豬和牛的DNA做2 倍或10 倍梯度稀釋，使其質量濃度在50～0.625 ng/μL范圍內(nèi)，通過ddPCR方法分別對各質量濃度牛源和豬源DNA樣本中牛GH基因和豬PRNP基因的拷貝數(shù)進行檢測，確定2 種引物探針的檢測靈敏性。

1.3.6 Kp/Kb的計算

牛G H基因及豬P R N P基因均為單拷貝核基因，因此，理論上單位質量豬肉PRNP基因拷貝數(shù)（Kp，Kp=，Qp為豬PRNP基因拷貝數(shù)，Mp為豬肉質量）和單位質量牛肉GH基因拷貝數(shù)（Kb，Kb=，Qb為牛GH基因拷貝數(shù)，Mb為牛肉質量）應為一個常數(shù)[23]，二者比值（Kp/Kb，）應為一個固定值。根據(jù)這一固定值，可以將通過ddPCR測得的2 種基因拷貝數(shù)Qp和Qb轉化為2 種肉類的相對質量分數(shù)（）。為計算并確定這一固定值，將豬肉質量分數(shù)分別為5%、10%、20%、40%、60%、80%、90%的混合肉樣以磁珠法提取DNA，通過ddPCR方法分別檢測豬PRNP基因和牛GH基因拷貝數(shù)，并計算Kp/Kb。

1.3.7 Kp/Kb的準確性、重復性及檢測限確定

稱取5 份豬肉質量分數(shù)為50%的豬肉、牛肉混合肉樣，提取DNA，通過ddPCR方法檢測豬PRNP基因和牛GH基因的拷貝數(shù)，并根據(jù)1.3.6節(jié)中確定的Kp/Kb比值計算混合肉樣中豬肉的質量分數(shù)，對于豬肉質量分數(shù)的實際值和檢測值進行比較分析。

另取3～6 份豬肉質量分數(shù)分別為1%、5%、10%、20%、50%、60%、80%、90%、95%、99%的豬肉、牛肉混合樣品，根據(jù)1.3.6節(jié)中確定的Kp/Kb比值計算豬肉的質量分數(shù)，并計算各樣品的絕對誤差、相對誤差、變異系數(shù)（coeff i cient of variation，CV）及回收率[24]，對方法的檢測限進行確定。

1.3.8 市售牛肉制品中豬成分的檢測

通過本方法對市售牛肉卷、牛肉干、牛肉腸和牛肉粒等20 份牛肉制品中豬源及牛源性成分進行定量檢測，并計算其中豬源性成分的比例。將市售的3 份牛肉卷、3 份牛肉干、8 份牛肉腸和6 份牛肉粒分別按購買時間進行數(shù)字編號。

2 結果與分析

2.1 牛GH基因及豬PRNP基因引物探針特異性

圖 1 ddPCR方法驗證牛GH基因引物探針的特異性Fig. 1 Specif i city of primers and probe targeting bovine GH gene by ddPCR

圖 2 ddPCR方法驗證豬PRNP基因引物探針的特異性Fig. 2 Specif i city of primers and probe targeting swine PRNP gene by ddPCR

由圖1～2可知：牛GH基因引物探針對于牛肉樣本顯示出特異性擴增，對于豬肉、鴨肉、雞肉及山羊肉等其他9 種肉樣均沒有擴增；豬PRNP基因引物探針對于豬肉樣本有特異性擴增，對于包括牛肉在內(nèi)的其他9 種肉類樣本均沒有擴增，表明2 種引物探針的特異性良好。

2.2 牛GH基因及豬PRNP基因引物探針靈敏性

圖 3 ddPCR方法檢測牛GH基因引物探針的靈敏性Fig. 3 Sensitivity of primers and probe targeting bovine GH gene by ddPCR

圖 4 ddPCR方法檢測豬PRNP基因引物探針的靈敏性Fig. 4 Sensitivity of primers and probe targeting swine PRNP gene by ddPCR

由圖3～4可知，ddPCR方法對牛和豬DNA的檢出限為0.625 ng/μL，陽性拷貝數(shù)分別為（8.4±1.1） copies/μL和（6.7±0.7） copies/μL，CV分別為10.43%和11.36%，均小于25%，表明以該方法檢測牛GH基因及豬PRNP基因具有良好的靈敏性。

2.3 Kp/Kb的計算及驗證

表 3 不同混合肉樣的Kp/Kb測定結果Table 3 Kp/Kb values of different mixed meat samples

對豬肉質量分數(shù)分別為5%、10%、20%、40%、60%、80%、90%的豬肉、牛肉混合樣品中豬PRNP基因拷貝數(shù)（Qp）及牛GH基因拷貝數(shù)（Qb）進行測定，并計算Kp/Kb。由表3可知，混合肉樣中Kp/Kb平均值為1.66，檢測的CV為3.46%。

表 4 豬肉質量分數(shù)為50%的混合肉樣準確度和精密度測定結果Table 4 Accuracy and precision in detection of mixed meat samples with 50% pork

制備5 份豬肉質量分數(shù)為50%的豬肉、牛肉混合肉樣，采用ddPCR方法分別檢測Qp和Qb，以Kp/Kb=1.66作為固定值計算混合肉樣中豬肉質量分數(shù)。由表4可知，5 份混合肉樣中豬肉的回收率在99.16%～100.14%之間，豬肉質量分數(shù)在49.58%～50.07%之間，平均值為49.92%，CV為0.40%。上述結果表明，應用計算所得Kp/Kb測定豬肉質量分數(shù)相同的混合肉樣具有很好的準確度和精密度，可以應用該比值進行豬肉、牛肉混合肉樣中豬肉質量分數(shù)的計算。

2.4 ddPCR方法的檢測限

表 5 以Kp/Kb=1.66計算不同混合肉樣中豬肉的質量分數(shù)Table 5 Calculation of pork proportion in blended meat samples by Kp/Kb ratio (1.66)

提取豬肉質量分數(shù)分別為1%、5%、10%、20%、50%、60%、80%、90%、95%及99%的豬肉、牛肉混合肉樣的DNA，分別測定Qp和Qb，以Kp/Kb=1.66計算豬肉質量分數(shù)。由表5可知，當豬肉質量分數(shù)在5%～99%范圍內(nèi)時，根據(jù)本研究確定的Kp/Kb（1.66）計算混合肉樣中豬肉質量分數(shù)的絕對誤差≤1.28%，相對誤差≤2.84%，CV＜6.50%，回收率在99.09%～102.80%之間，測量值接近于實際值。因此，該方法檢測牛肉中摻雜豬肉的最低檢測限為5%，最高檢測限達99%。

2.5 市售牛肉制品的檢測

以本研究建立的檢測方法對20 份市售牛肉腸、牛肉卷、牛肉干和牛肉粒中的豬肉成分進行定量檢測。結果表明，所有樣品中均檢出牛源性成分，牛肉卷和牛肉干樣品中未檢出豬源性成分，牛肉腸和牛肉粒中檢出豬源性成分。

表 6 市售牛肉制品中豬源性成分的含量檢測結果Table 6 Quantitative detection of pork in commercial beef products by ddPCR

由表6可知，牛肉腸和牛肉粒中檢出的豬源性成分含量在29.19%～98.15%之間，其中6號牛肉腸中豬源性成分的相對含量低于本方法最低檢測限5%。

3 討 論

隨著食品工業(yè)的發(fā)展，肉類制假摻假層出不窮。各國已有相關法規(guī)來約束生產(chǎn)者和經(jīng)營者的行為，然而要對肉源性成分是故意添加或無意沾染進行準確判斷以及對肉制品標簽中相應成分的含量進行鑒定核查，必須要建立科學、快捷的檢測方法，來滿足這些精準定量檢測需求，并保障相關法規(guī)的有效執(zhí)行。

靈敏度的檢測是衡量檢測方法的重要指標之一。本研究采用ddPCR技術對GB/T 25165—2010[30]中檢測牛源性成分的GH基因和豬源性成分的PRNP基因進行檢測，將模板進行不同程度稀釋后檢測基因拷貝數(shù)，分析標準差和CV。結果表明，在模板質量濃度低至0.625 ng/μL時，該方法依然具有良好的檢測靈敏度及準確性。并且，不同于線粒體多拷貝基因，GH基因與PRNP基因均為核基因，其拷貝數(shù)與肌細胞數(shù)量成一定比例，可以很好地反映樣本質量，確保了本研究中將基因拷貝數(shù)之比轉化為肉源性成分相對質量分數(shù)的可行性。

回收率和CV是檢測準確度和精密度的重要評價指標，參照國際食品法典委員會標準CAC/GL 74—2010《檢測、鑒定和量化食品中特定基因序列和蛋白質的執(zhí)行標準和方法確認準則》[31]，回收率應在70%～120%之間，CV應不大于25%。本研究采用固定比值法，確定了單位質量牛肉中GH基因和豬肉中PRNP基因拷貝數(shù)之比這一固定值，通過該值計算牛肉和豬肉的相對質量分數(shù)，當豬肉質量分數(shù)在5%～99%范圍內(nèi)時，回收率在99.09%～102.80%之間，CV均不大于6.50%，表明本方法具有良好的檢測準確度和精密度，可以較好地應用于實際檢測中。對市售樣品進行檢測時，在配料成分標明含有豬肉的牛肉腸類商品中檢出豬源性成分。其中，6號牛肉腸樣品中豬肉的相對質量分數(shù)為0.12%，低于本方法的檢測下限5%，推斷可能是無意沾染導致，或者該商品中添加了微量豬源性調味品。在市售牛肉卷和牛肉干中均未檢出豬源性成分。根據(jù)GB/T 20712—2006《火腿腸》[32]，用單一肉類原料，如牛肉，制成的產(chǎn)品應命名為“牛肉腸”。本研究中，檢出含有一定量豬肉成分的牛肉腸類商品，其標簽為“牛肉風味腸”或“牛肉早餐腸”，其中摻入的豬肉相對含量在30%左右，均符合國家有關標準規(guī)定。但是，3號牛肉粒樣品中檢出的豬肉相對質量分數(shù)達98.15%，表明生產(chǎn)中可能存在使用豬肉制作牛肉粒的情況。

采用固定比值法檢測肉源性成分的質量分數(shù)操作簡便且定量分析準確性高，在對2 種肉類混合樣本進行相對含量檢測時具有一定優(yōu)勢，并且市售商品中摻假肉及肉制品多為2 種肉類的摻雜混合，因此固定比值法具有重要的實際應用意義。然而，該方法僅適用于2 種肉類混合的樣本，并且只能確定樣本中2 種肉源性成分的相對含量。一些市售肉制品中常含有3 種肉類成分，要檢測摻有3 種及3 種以上肉類樣本中各種肉源性成分的絕對含量，采用建立肉類制品質量與核酸含量以及核酸含量與基因拷貝數(shù)2 個標準曲線的方法來進行進一步測算則更為實用。但是由于DNA提取效率在一定程度上會受到環(huán)境的影響，并且對操作要求較高，因此采用標準曲線法來確定肉品質量與核酸含量之間的線性關系的重復性和再現(xiàn)性欠佳。探索一種更為科學、快捷、精準且實用的多重數(shù)字PCR分析方法，實現(xiàn)對摻假肉及肉制品中多種常見肉源性成分的定量檢測，可能是未來研究的主要方向之一。

4 結 論

本研究以單位質量牛肉的生長激素基因和豬肉朊蛋白基因拷貝數(shù)之比為一固定值，建立牛肉中豬源性成分檢測的ddPCR方法，該方法具有良好的準確性和重復性，檢測限可達0.625 ng/μL，牛肉中摻雜豬肉的質量分數(shù)在5%～99%范圍內(nèi)時，檢測結果的絕對誤差小于1.28%，CV小于6.5%，豬肉成分的回收率在99.09%～102.80%之間。本研究所建立的ddPCR方法可以較好地應用于牛肉制品中摻雜豬肉成分的定量檢測，為有關部門打擊摻假等違規(guī)行為提供技術支撐，促進動物源性食品行業(yè)的健康發(fā)展。