沉默纖維介素2基因表達(dá)對(duì)急性壞死性胰腺炎小鼠的治療作用

邵利梅 葉曉華 丁進(jìn)

纖維介素2(fibrinogen-like protein 2, FGL2)為纖維蛋白原超家族成員，在體內(nèi)存在兩種形式，即膜型FGL2(mFGL2)和分泌型FGL2(sFGL2)，mFGL2具有凝血酶原酶活性，可通過(guò)介導(dǎo)各臟器內(nèi)微血栓的形成引起器官損傷，sFGL2是T細(xì)胞的效應(yīng)分子，發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)活性，防止組織損傷[1]。Xi等[2]報(bào)道，沉默MHV-3誘導(dǎo)的暴發(fā)性肝炎小鼠的FGL2基因表達(dá)可減輕肝細(xì)胞的壞死和凋亡。葉曉華[3]報(bào)道，急性壞死性胰腺炎(acute necrotic pancreatitis, ANP)大鼠胰腺組織FGL2 表達(dá)升高，且與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)。故本研究構(gòu)建攜帶靶向FGL2的小干擾RNA(small interfering RNA, siRNA)的腺病毒(Ad-FGL2-siRNA) ，探討FGL2在ANP小鼠胰腺細(xì)胞凋亡中的作用及機(jī)制。

材料與方法

一、材料及試劑

健康SPF級(jí)雄性C57/BL小鼠由上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心提供。飼養(yǎng)在安靜、恒溫恒濕、12 h自然光照與黑暗交替、食水持續(xù)供給的環(huán)境中，所有操作均遵守浙江大學(xué)金華醫(yī)院動(dòng)物保護(hù)條例。牛磺膽酸鈉購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，ELISA試劑盒購(gòu)自北京四正柏生物科技有限公司，SYBR Green Master Mix購(gòu)自美國(guó)Life technologies公司，F(xiàn)GL2抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司，EnVision試劑盒購(gòu)自丹麥Dako公司，TUNEL凋亡試劑盒購(gòu)自瑞士Roche公司。

二、動(dòng)物分組及模型制備

實(shí)驗(yàn)前動(dòng)物禁食12 h，不禁水。采用腹腔內(nèi)注射10%水合氯醛(2 ml/kg體重)麻醉，將小鼠分為對(duì)照組、ANP組、Ad-FGL2-siRNA組，每組6只。對(duì)照組開(kāi)腹輕翻動(dòng)胰腺組織后關(guān)腹；ANP組采用胰膽管逆行注射4%牛磺膽酸鈉溶液(1 ml/kg體重)方法誘導(dǎo)ANP模型；Ad-FGL2-siRNA組在造模前經(jīng)尾靜脈注射0.5 ml 4×108pfu/ml的Ad-FGL2-siRNA。對(duì)照組及ANP組經(jīng)尾靜脈注射等劑量不攜帶Ad-FGL2-siRNA的腺病毒。術(shù)后6 h處死小鼠，抽取下腔靜脈血0.5 ml，分離血清，置-20℃冰箱保存；取胰腺組織標(biāo)本，部分置于4%多聚甲醛保存，部分經(jīng)液氮速凍后置-80C°冰箱保存。

Ad-FGL2-siRNA由上海銳賽生物科技有限公司設(shè)計(jì)并構(gòu)建。靶向FGL2的siRNA正向序列為5′-TGCTGTTCTTTGAGCACCTCCTCCATGTTTTGGCCA-CTGACTGACATGGAGGATGCTCAAAGAA-3′，反向序列為5′-CCTGTTCTTTGAGCATCCTCCATGTCAGTCAGTGGCCAAAACATGGAGGAGGTGCTCAAAGAAC-3′。

三、胰腺組織病理學(xué)檢查

取固定的胰腺組織常規(guī)行病理學(xué)檢查。光鏡下隨機(jī)選取10個(gè)視野，根據(jù)Schmidt等[4]的標(biāo)準(zhǔn)對(duì)胰腺損傷的水腫、出血、腺泡細(xì)胞變性和間質(zhì)炎癥進(jìn)行評(píng)分。

四、血清TNF-α和IL-1β水平檢測(cè)

采用ELISA法測(cè)定血清TNF-α和IL-1β水平，按試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的A450值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，獲取二元方程式，計(jì)算待測(cè)標(biāo)本的TNF-α和IL-1β水平。

五、胰腺組織FGL2 mRNA及蛋白表達(dá)檢測(cè)

應(yīng)用Trizol法提取胰腺組織RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA后應(yīng)用美國(guó)ABI 7500型實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增。FGL2正義引物序列為5′-TGCCTTGCGTTTCAGTCG-3′，反義引物序列為5′-AATCCCATTACGGACACCTTT-3′。內(nèi)參β-actin正義引物序列為5′-CCTGGAGAAACCTGCCAAGTA-3′，反義引物序列為5′-TCATACCAGGAAATGAGCTTGAC-3′。每個(gè)樣本做3個(gè)復(fù)孔，以雙蒸水代替cDNA模板作為空白對(duì)照。應(yīng)用公式2-ΔΔCt計(jì)算FGL2 mRNA表達(dá)量。

應(yīng)用RIPA裂解液提取速凍胰腺組織的總蛋白，使用BCA法定量蛋白后常規(guī)行蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)FGL2蛋白，以β-actin作為內(nèi)參。FGL2一抗工作濃度1∶200，最后ECL發(fā)光，X片曝光、顯影、定影。采用Image J軟件進(jìn)行條帶掃描，以目的條帶與內(nèi)參條帶的灰度值比表示蛋白相對(duì)表達(dá)量。

同時(shí)，取固定的胰腺組織，常規(guī)制備切片，采用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)FGL2蛋白表達(dá)，以BSA代替一抗作為對(duì)照，依據(jù)EnVision試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。FGL2一抗工作濃度1∶50，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗工作濃度1∶1 000，最后DAB 顯色劑顯色，蘇木素復(fù)染。以胞質(zhì)染為淡黃色至棕褐色為陽(yáng)性細(xì)胞標(biāo)志，主要浸潤(rùn)于微血管的內(nèi)皮細(xì)胞和間質(zhì)組織。在200倍光鏡下隨機(jī)選取10個(gè)不同視野，陽(yáng)性細(xì)胞率為陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%，取均值。

六、胰腺組織細(xì)胞凋亡檢測(cè)

采用末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶(terminal deoxynu-cleotidyl transferase，TdT)介導(dǎo)dUTP缺口末端標(biāo)記法檢測(cè)胰腺組織細(xì)胞凋亡，按試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。用標(biāo)準(zhǔn)的熒光過(guò)濾裝置在(520±20)nm的熒光下觀察，綠色熒光為凋亡細(xì)胞，鏡下計(jì)數(shù)凋亡細(xì)胞。

七、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

一、各組小鼠胰腺組織的病理學(xué)改變

對(duì)照組胰腺組織學(xué)形態(tài)保持正常，ANP組的胰腺組織表現(xiàn)為水腫、出血、腺泡欠完整和炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，Ad-FGL2-siRNA組胰腺組織的病理?yè)p傷較ANP組明顯減輕(圖1)。對(duì)照組、ANP組、Ad-FGL2-siRNA組小鼠胰腺組織的病理評(píng)分分別為(1.33±0.21)、(9.17±0.98)、(6.26±0.52)分，ANP組較對(duì)照組顯著升高，Ad-FGL2-siRNA組較ANP組顯著下降，但仍顯著高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.05)。

二、各組小鼠血清 TNF-α、IL-1β水平變化

對(duì)照組、ANP組、Ad-FGL2-siRNA組小鼠血清TNF-α 水平分別為(63.8±4.2)、(240.4±18.6)、(123.0±10.3)ng/L；IL-1β水平分別為(43.6±4.4)、(186.6±18.7)、(92.0±10.9)ng/L。ANP組較對(duì)照組顯著增高，Ad-FGL2-siRNA組較ANP組顯著下降，但仍顯著高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.05)。

圖1 對(duì)照組(1A)、ANP組(1B)、Ad-FGL2-siRNA組(1C)小鼠胰腺組織病理學(xué)改變(HE ×200)

三、各組小鼠胰腺組織FGL2mRNA及蛋白表達(dá)變化

對(duì)照組、ANP組、Ad-FGL2-siRNA組小鼠胰腺組織FGL2 mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為1.20±0.22、4.40±1.21、2.15±0.56，ANP組較對(duì)照組顯著增高，Ad-FGL2-siRNA組較ANP組顯著下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.05)，而Ad-FGL2-siRNA組FGL2 mRNA表達(dá)量雖高于對(duì)照組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

對(duì)照組、ANP組、Ad-FGL2-siRNA組小鼠胰腺組織FGL2蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為0.33±0.08、1.23±0.24、0.68±0.09(圖2)，F(xiàn)GL2陽(yáng)性細(xì)胞率為(2.56±0.31)%、(15.10±3.23)%、(8.68±1.81)%(圖3)，ANP組均較對(duì)照組顯著增加，Ad-FGL2-siRNA組均較ANP組顯著減少，但仍顯著高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.05)。

四、各組小鼠胰腺組織細(xì)胞凋亡數(shù)

對(duì)照組、ANP組、Ad-FGL2-siRNA組小鼠胰腺組織內(nèi)細(xì)胞凋亡數(shù)分別為(4.51±1.21)、(35.81±4.11)、(11.79±3.02)個(gè)/200倍視野，ANP組、Ad-FGL2-siRNA組顯著多于對(duì)照組，Ad-FGL2-siRNA組又較ANP組顯著減少，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.05)。

圖2 對(duì)照組(1)、ANP組(2)、Ad-FGL2-siRNA組(3)FGL2蛋白表達(dá)(蛋白質(zhì)印跡法)

圖3 對(duì)照組(3A)、ANP組(3B)、Ad-FGL2-siRNA組(3C)FGL2蛋白表達(dá)(免疫組織化學(xué)染色 ×200)

討 論

ANP早期很多因素可引起胰腺腺泡細(xì)胞的損傷或死亡，腺泡細(xì)胞壞死會(huì)提高胰腺細(xì)胞內(nèi)的胰蛋白酶活性，釋放多種炎癥因子，激活炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)，而壞死-凋亡轉(zhuǎn)變機(jī)制在病情的嚴(yán)重程度方面起了極大的作用[5-7]。針對(duì)重癥急性胰腺炎(SAP)的免疫細(xì)胞的成熟、凋亡、分化等進(jìn)行調(diào)控，是近幾年來(lái)ANP治療領(lǐng)域的方向之一[8]。FGL2屬于纖維蛋白原家族，由活化的巨噬細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)，能催化凝血酶原轉(zhuǎn)化為凝血酶，啟動(dòng)凝血過(guò)程。FGL2可參與ANP大鼠微血栓形成，促進(jìn)了SAP的發(fā)生與發(fā)展[3,9]。本課題組既往的研究表明，F(xiàn)GL2在ANP動(dòng)物模型及SAP患者外周血高表達(dá)，引起ANP相關(guān)性肝損傷的肝細(xì)胞微血栓形成[10]，并與一些其他疾病的細(xì)胞凋亡密切相關(guān)。腺病毒介導(dǎo)的微小RNA靶向調(diào)節(jié)mfgl2、mFas和mTNFR1，能明顯改善爆發(fā)性肝衰竭的肝細(xì)胞壞死和凋亡[2]；進(jìn)一步研究表明IL-33通過(guò)靶向FGL2保護(hù)重癥病毒性肝炎小鼠[11]；此外，沉默F(xiàn)GL2也可抑制心肌細(xì)胞的凋亡，改善糖尿病大鼠的心功能[12]。但FGL2對(duì)ANP細(xì)胞凋亡及疾病進(jìn)展的作用尚不清楚。

復(fù)制缺陷型腺病毒是最先進(jìn)、研究最好的載體系統(tǒng)之一，可高水平表達(dá)外源基因[13]，既往實(shí)驗(yàn)表明Ad-FGL2-siRNA對(duì)體外靶基因有明確的抑制作用[2]。本研究首次在ANP小鼠模型中通過(guò)Ad-FGL2-siRNA沉默F(xiàn)GL2基因來(lái)研究其作用，結(jié)果表明，F(xiàn)GL2基因沉默可顯著緩解ANP的胰腺病理學(xué)損傷，減少胰腺組織的水腫、出血、腺泡破壞和炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，提示了FGL2基因沉默對(duì)ANP的保護(hù)作用。此外，免疫細(xì)胞， 特別是與先天免疫相關(guān)的炎癥細(xì)胞(包括中性粒細(xì)胞、 巨噬細(xì)胞等)，它們介導(dǎo)并放大了級(jí)聯(lián)樣的促炎反應(yīng)，決定著ANP的嚴(yán)重程度[14]。研究顯示，在ANP病程的不同時(shí)期，通過(guò)促進(jìn)或抑制中性粒細(xì)胞及CD4+T細(xì)胞的凋亡，可減輕早期ANP炎性應(yīng)答，緩解ANP癥狀[15-16]。本研究結(jié)果顯示，Ad-FGL2-siRNA顯著下調(diào)了促炎癥細(xì)胞因子TNF-α和IL-1β水平，這對(duì)阻止局部組織損傷發(fā)展為系統(tǒng)炎癥反應(yīng)起到了關(guān)鍵作用[9]，促炎細(xì)胞因子的下調(diào)也與上述胰腺病理學(xué)損傷的緩解相一致。本研究結(jié)果還顯示，Ad-FGL2-siRNA在ANP早期抑制了腺泡細(xì)胞的凋亡，這與上述沉默F(xiàn)GL2可抑制其他系統(tǒng)疾病的細(xì)胞凋亡結(jié)論相一致[2]。綜上所述，F(xiàn)GL2可能參與了小鼠ANP的發(fā)生發(fā)展，沉默F(xiàn)GL2基因表達(dá)，可抑制炎癥細(xì)胞的聚集和浸潤(rùn)，抑制腺泡細(xì)胞的凋亡，從而對(duì)ANP早期起到一種保護(hù)作用。