Kisspeptin 1基因單核苷酸多態(tài)性與生長(zhǎng)激素缺乏性侏儒癥的相關(guān)性研究

姜書(shū)琴，王 偉，陸文全，羅向陽(yáng)

生長(zhǎng)激素缺乏性侏儒癥（growth hormone deficiency dwarfism，GHDD）是由于腺垂體合成和分泌生長(zhǎng)激素部分或完全缺乏，或由于生長(zhǎng)激素分子結(jié)構(gòu)異常等所致的生長(zhǎng)發(fā)育障礙性疾病。其發(fā)病機(jī)制涉及激素、環(huán)境、遺傳等多方面，其中遺傳約占 75%［1］。 Kisspeptin 1（Kiss－1）基因（腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因），主要依靠Kp/GPR54系統(tǒng)對(duì)機(jī)體起調(diào)控作用［2］，有研究發(fā)現(xiàn) kiss－1 基因可以調(diào)控生長(zhǎng)激素（GH）的分泌，其多態(tài)性改變與身高存在一定的相關(guān)性［3］。迄今為止，全基因組關(guān)聯(lián)研究（genome wide association study，GWAS）已經(jīng)發(fā)現(xiàn)人類(lèi)的身高至少與180個(gè)基因位點(diǎn)有關(guān)，可以解釋10%的身高變異［4］，基于 GWAS 研究結(jié)果，選取 Kiss－1 基因的 C.－89（rs3924587）及 c.－145（rs5780218）共 2 個(gè)單核苷酸多態(tài)性（SNPs）位點(diǎn)，探討河南地區(qū)GHDD患者與Kiss－1基因單核苷酸多態(tài)性的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 一般資料 （1）GHDD組。隨機(jī)選取2017年07月—2017年11月在鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院兒科內(nèi)分泌中心就診的GHDD患者60例 （其中男30例，女 30 例），平均年齡（7.4±1.4）歲。 納入標(biāo)準(zhǔn)：①身高落后于同年齡、同性別正常健康兒童身高的第3 百分位數(shù)｛減 1.88 個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差（－1.88）｝或減 2 個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差 （－2 s以下）（參照2005年中國(guó)兒童身高標(biāo)準(zhǔn)）；②年生長(zhǎng)速率＜5 cm/年；③勻稱(chēng)性矮小，面容幼稚；④無(wú)慢性器質(zhì)性疾病、染色體異常等；⑤骨齡落后于實(shí)際年齡；⑥兩種GH藥物激發(fā)實(shí)驗(yàn)GH峰值均＜10μg/L； ⑦性成熟分級(jí) （sexual maturityrating，SMR），也稱(chēng)為T(mén)anner分期，為1期：女孩乳房為幼兒型，男孩睪丸直徑＜2.5 cm（超聲測(cè)量）及 Prader睪丸計(jì)測(cè)定的睪丸容積1～3 ml，患者均無(wú)陰毛發(fā)育。（2）對(duì)照組。隨機(jī)選取同期在鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院體檢的同年齡同性別青春期前健康兒童60例（其中男 30 例，女 30 例），平均年齡（7.4±1.4）歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：①身高在同年齡同性別正常人的±1SD之間；②無(wú)內(nèi)分泌代謝及慢性器質(zhì)性疾病。該研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有研究對(duì)象及其家屬均簽署知情同意書(shū)。（3）檢測(cè)指標(biāo)。GHDD組患者需定期監(jiān)測(cè)身高、體重、肝腎功能、甲狀腺功能、血糖、血清IGF－1水平及骨齡。（以上操作由經(jīng)過(guò)培訓(xùn)的專(zhuān)業(yè)人員操作，生化指標(biāo)采用化學(xué)發(fā)光方法進(jìn)行）

1.2 實(shí)驗(yàn)方法 （1）采集標(biāo)本。于早晨空腹收集所有研究對(duì)象外周靜脈血2 ml，放入含EDTA的真空采血管中，－80℃冰箱保存?zhèn)溆谩＃?）遺傳分析。使用全血 DNA 提取試劑盒（Kurabo，Osaka，Japan）提取所有研究樣本的基因組DNA，對(duì)DNA濃度及純度進(jìn)行檢測(cè)后－20℃冰箱保存?zhèn)溆?。使用南京金斯瑞生物科技公司設(shè)計(jì)合成的引物進(jìn)行目的片段的PCR擴(kuò)增。引物序列如下：

引物rs3924538

F：GGCCTGTGCTTGGAGACGTCAC

R：GTGTGCCAGTCTTAGATTTCCACCA

引物rs5780218

F：GTGTTGCAAAGCCATCTTTC

R：TCTTTTATTGCCTCGGGTTG

PCR 擴(kuò)增總為 50μl，包括 12μl滅菌水、25μl 2×PCR Buffer for KOD、5μl 2mM dNTPs、2μl 25mM MgSO4、 引物各 1μl （10μM each）、3μl模板、1μl KOD （1 U/μl）。 PCR 設(shè)定的條件為：94℃預(yù)變性2 min，98℃變性 10 s，55℃退火 30 s，68℃延伸 60 s，共35個(gè)循環(huán)，PCR產(chǎn)物4℃保存。

在瓊脂糖凝膠電泳上分離純化PCR產(chǎn)物，隨后采用 3730xl毛細(xì)管測(cè)序儀 （Applied Biosystems，Waltham，MA，USA）進(jìn)行測(cè)序?；蛐头治鍪褂肎enemapper軟件（v.4.0；Applied Biosystems）。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 利用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)數(shù)資料以例數(shù)和%表示，采用χ2檢驗(yàn)比較GHDD組與對(duì)照組基因型分布及等位基因頻率差異；采用擬合優(yōu)度χ2檢驗(yàn)進(jìn)行遺傳平衡檢驗(yàn)，P＞0.05 認(rèn)為基因型分布符合 Hardy－Weinberg 平衡。

2 結(jié)果

2.1 Hardy-Weinberg（HWE）平衡 比較 GHDD組與對(duì)照組rs3924587及rs5780218位點(diǎn)基因型的理論值與實(shí)際值，結(jié)果顯示 P＞0.05，符合 HWE，該研究樣本的群體代表性較好。見(jiàn)表1。

表1 兩組rs3924587及rs5780218位點(diǎn)基因型理論值與實(shí)際值比較

2.2 兩組kiss-1基因SNPs位點(diǎn)基因型及等位基因頻率比較 （1）rs5780218位點(diǎn)基因型分布頻數(shù)：GHDD 組 T/T、C/T、C/C 分布頻數(shù)分別為 17、22、21例；對(duì)照組T/T及C/T、C/C分布頻數(shù)分別為19、20、21 例。 兩組在基因型構(gòu)成比（χ2=2.412，P=0.120）和等位基因頻率（χ2=2.340，P=0.126）上差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。（2）rs3924587位點(diǎn)基因型分布頻數(shù)：ISS組G/G、G/A 及 A/A 分布頻數(shù)分別為 20、22、18例；對(duì)照組 G/G、G/A及 A/A分布頻數(shù)分別為 22、18、20例。 兩組在基因型構(gòu)成比（χ2=1.336，P=0.513）和等位基因頻率（χ2=1.053，P=0.305）上差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)表2及圖1、2。

表2 Kiss-1基因rs5780218及rs3924587位點(diǎn)基因型分布頻數(shù)

圖 1 兩組rs3924587位點(diǎn)基因型條形圖

圖 2 兩組rs5780218位點(diǎn)基因型條形圖

3 討論

GHDD主要是由于下丘腦－垂體功能障礙等造成生長(zhǎng)激素分泌不足，導(dǎo)致生長(zhǎng)遲緩，1996年Lee等首次發(fā)現(xiàn)腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因（Kiss－1基因），該基因在啟動(dòng)青春期生長(zhǎng)發(fā)育、調(diào)控能量平衡及生物節(jié)律等方面具有重要作用。既往研究報(bào)道Kiss－1基因可參與生長(zhǎng)激素（GH）的釋放過(guò)程，用kisspeptin處理體外培養(yǎng)的大鼠和牛垂體細(xì)胞，可以促進(jìn)GH分泌，提高血清中 GH 濃度［5］。 Kiss－1 基因表達(dá)、青春期啟動(dòng)、GH分泌成倍增加，青春期身高突增，生長(zhǎng)發(fā)育加速，其作用機(jī)制是：下丘腦不同核區(qū)分泌的Kisspeptin與其受體結(jié)合，再通過(guò)下丘腦－垂體－性腺軸（hypothalamic－pituitary－gonadal axis，HPGA）的調(diào)控作用，引起性激素分泌增多，再通過(guò)負(fù)反饋調(diào)節(jié)機(jī)制使GH分泌增加，進(jìn)而促進(jìn)機(jī)體縱向生長(zhǎng)［6］。

性早熟 （precocious puberty，PP） 主要是由于HPGA功能過(guò)早啟動(dòng)，促性腺激素釋放激素（gonadotropin hormone，GnRH）脈沖分泌增強(qiáng)，出現(xiàn)第二性征發(fā)育、機(jī)體線(xiàn)性生長(zhǎng)和骨齡迅速增加。生長(zhǎng)發(fā)育是由GH和性激素（sex hormone，SH）協(xié)同作用的結(jié)果，PP也會(huì)導(dǎo)致身材矮小。既往研究發(fā)現(xiàn)矮小癥患者經(jīng)rhGH治療可改善其性腺功能，可通過(guò)延緩誘導(dǎo)其青春發(fā)育年齡的方法，改善其終身高。國(guó)內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)，Kiss－1基因單核苷酸多態(tài)性與性早熟的發(fā)生密切相關(guān)，Kiss－1基因被認(rèn)為是性早熟的保護(hù)性基因［7］。在朝鮮、巴西、伊斯法罕地區(qū)PP患者及喪失青春發(fā)育進(jìn)程的同家族成員中均發(fā)現(xiàn)存在 Kiss－1 基因的單核苷酸多態(tài)性改變［8－10］。 性早熟和單純?nèi)榉吭绨l(fā)育患者血清kisspeptin水平較正常女童顯著增高［11，12］。身高的增長(zhǎng)與骨骼生長(zhǎng)板密切相關(guān)，性早熟患者大多身高增長(zhǎng)加速，骨礦物質(zhì)含量及骨密度明顯增高，基于生長(zhǎng)板功能在GHDD中的重要作用，由此推測(cè)GHDD與性早熟發(fā)病機(jī)制可能存在交叉點(diǎn)。

隨著分子生物學(xué)及檢測(cè)手段的不斷發(fā)展，任何生長(zhǎng)相關(guān)基因的單核苷酸多態(tài)性都可能與GHDD的發(fā)生有關(guān)，筆者推測(cè)，Kiss－1基因單核苷酸多態(tài)性與GHDD存在相關(guān)性，其可能機(jī)制是Kiss－1基因特異性位點(diǎn)的多態(tài)性造成表達(dá)蛋白的氨基酸序列不同，影響青春期的生長(zhǎng)，從而導(dǎo)致終身高具有差異性。 該研究以 Kiss－1 基因 c.－145（rs5780218）和 C.－89（rs3924587）位點(diǎn)為切入點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)對(duì)照組及GHDD組患者中均未檢測(cè)到任何多態(tài)性改變，在GHDD組患者中兩個(gè)SNP位點(diǎn)基因型構(gòu)成比及等位基因頻率與對(duì)照組相比差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）， 結(jié) 果提 示 rs5780218 和 rs3924587 位 點(diǎn) 與GHDD的發(fā)生可能不存在相關(guān)性，等位基因A、G、C、T既不是GHDD的保護(hù)性基因，也不是GHDD的易感基因，在降低GHDD的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)及預(yù)防等方面無(wú)明顯作用，由此推測(cè)Kiss－1基因單核苷酸多態(tài)性可能與GHDD無(wú)相關(guān)性，但由于該研究對(duì)象均為河南地區(qū)GHDD患者，樣本量少，種屬不同，地區(qū)特征明顯，該結(jié)論目前只在河南地區(qū)GHDD患者中成立，對(duì)于其他地區(qū)攜帶相關(guān)等位基因的患者需警惕GHDD的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)，需定期監(jiān)測(cè)身高變化情況，從而可以在最佳治療時(shí)間進(jìn)行針對(duì)性治療，避免延誤病情。矮小癥病因復(fù)雜多樣，種屬不同及地域差異等均可對(duì)研究結(jié)果產(chǎn)生影響，可通過(guò)擴(kuò)大樣本量等方法設(shè)計(jì)進(jìn)一步的研究，或通過(guò)對(duì)Kiss－1基因相關(guān)位點(diǎn)基因編碼的蛋白及其功能做進(jìn)一步的研究，以便更深層次地探討Kiss－1基因單核苷酸多態(tài)性與GHDD的相關(guān)性。

綜上所述，Kiss－1基因rs5780218及rs3924587位點(diǎn)多態(tài)性與GHDD的發(fā)生無(wú)明顯相關(guān)，但此次樣本數(shù)量較少，有地區(qū)特性，該結(jié)論只在河南地區(qū)GHDD患者中成立。