針刺對變應(yīng)性鼻炎模型大鼠血清IL-4、IL-12、GATA-3 mRNA水平的影響

郭清華 王 旭 劉 玉

（南京市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，江蘇南京210014）

變應(yīng)性鼻炎（Allergic Rhinitis，AR）是機(jī)體暴露于變應(yīng)原后由IgE介導(dǎo)的鼻黏膜非感染性慢性炎性疾病，典型癥狀為陣發(fā)性噴嚏、清水樣涕、鼻癢和鼻塞[1]。目前，變應(yīng)性鼻炎流行率有全球逐年增加的趨勢。2015年，美國變應(yīng)性鼻炎臨床指南首次將針刺療法作為可選擇的方案之一進(jìn)行推薦[2]。針刺治療變應(yīng)性鼻炎不但能取得較好的療效，而且有副作用小、復(fù)發(fā)率低、成本較低等優(yōu)點(diǎn)。孫氏等[3]通過分析近10年的臨床報道發(fā)現(xiàn)針刺治療過敏性鼻炎療效可靠，操作簡單，同時也提出應(yīng)加強(qiáng)針刺治療過敏性鼻炎的實驗和作用機(jī)理研究，尤其是從免疫學(xué)角度。本研究制作變應(yīng)性鼻炎大鼠模型，觀察針刺療法對AR模型大鼠的療效及其對大鼠血清白介素-4（IL-4）、IL-12、GATA-3 mRNA水平的影響。

1 實驗材料

1.1 實驗動物 健康wistar大鼠，雌雄各半，清潔級，體重（200±20）g，由揚(yáng)州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心提供，動物合格證號：SCXK2012-004，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。

1.2 主要試劑與藥物 IL-12試劑盒、IL-4試劑盒，上海酶聯(lián)生物科技有限公司；氫氧化鋁干粉，上海凌峰化學(xué)試劑有限公司；卵白蛋白，sigma公司；氯雷他定糖漿，MSD Belgium BVBA/SPRL（比利時）；一次性針灸針，環(huán)球牌，0.18mm×13mm；氯仿（三氯甲烷）、異丙醇、無水乙醇，分析純，南京化學(xué)試劑股份有限公司；焦碳酸二乙酯（DEPC），Sigma公司；Trizol、M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶等逆轉(zhuǎn)錄試劑、DNA marker、Taq DNA聚合酶反應(yīng)體系，TaKaRa公司；引物：生工生物工程（上海）股份有限公司合成。內(nèi)參引物序列見表1。

1.3 主要儀器 全自動熒光PCR分析儀，美國Branchburg公司；臺式高速離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠；核酸蛋白檢測儀，Thermo公司。

表1 內(nèi)參引物序列

2 實驗方法

2.1 造模與分組 將wistar大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，按照安云芳等[4]報道的方法造模。（1）基礎(chǔ)致敏：每只大鼠予用卵清蛋白（OVA）0.3mg+氫氧化鋁30mg+生理鹽水1mL制成的混懸液，腹腔注射，隔日1次，共7次。（2）激發(fā)階段：腹腔注射OVA結(jié)束后第2天即開始激發(fā)，每只大鼠予5%OVA 50μL滴鼻，每日1次，連續(xù)7d。另取10只大鼠為空白組，用生理鹽水代替OVA，其余方法不變。采用疊加量化記分法評價造模是否成功，總分＞5分表示造模成功。記分方法：（1）鼻癢。輕搔鼻1～2次為1分，劇烈搔抓鼻四周2分。（2）噴嚏。1～3個為1分，4～10個2分，11個以上3分。（3）清涕。流至鼻孔為1分，超出前鼻孔2分，涕流滿面3分。將造模成功的大鼠隨機(jī)分為模型組、針刺組、西藥組。

2.2 干預(yù)方法 從實驗第21天開始，用針刺和氯雷他定糖漿對實驗鼠進(jìn)行干預(yù)。

2.2.1 針刺組 選擇大椎、肺俞（雙）、腎俞（雙）。穴位定位參考《常用實驗動物穴位定位》。大椎位于第7頸椎與第1胸椎間，背部正中；肺俞位于第3胸椎下兩旁肋間；腎俞位于第2腰椎下兩旁肋間。安撫大鼠后，左手按壓大鼠，食指和中指置于穴位兩側(cè)，繃緊穴位處皮膚，右手持針，快速垂直進(jìn)針，針身進(jìn)入后約10min捻轉(zhuǎn)1次，采用提插捻轉(zhuǎn)平補(bǔ)平瀉針法，行針1min，共留針30min，每日1次，連用14d。

2.2.2 西藥組 根據(jù)人與動物等效劑量換算方法，按人與各種動物以及各種動物之間用藥劑量換算公式：B種動物的劑量（mg/kg）＝W×A種動物的劑量（mg/kg），W為折算系數(shù)（大鼠折算系數(shù)為0.018），計算大鼠氯雷他定糖漿用藥量，予每次0.9mg/kg灌胃方式給藥，每日灌胃1次，連用14d。

2.2.3 模型組和空白組 模型組予生理鹽水灌胃，2mL/d，每日1次，連用14d。空白組不予任何干預(yù)。

2.3 標(biāo)本采集 （1）血清采集：各組大鼠末次處理后，以10%水合氯酸，3mL/kg進(jìn)行麻醉，采用摘眼球采血方式，將所采血液緩慢置入采血管，搖勻，離心，取血清。分取血清至凍存管中，-80℃冰箱保存?zhèn)溆茫瑴y定前置室溫復(fù)融。（2）鼻黏膜采集：大鼠采血完畢后，行斷頭處死，迅速剝除上頜骨部皮膚，將上頜骨從項骨中分離出來，分離鼻中隔與鼻黏膜，取雙側(cè)鼻黏膜。部分鼻黏膜在10%甲醛溶液中固定，用于鼻黏膜觀察；其余黏膜用液氮速凍后放置于-80℃冰箱保存，用于qPCR檢測。

2.4 指標(biāo)檢測

2.4.1 癥狀比較 根據(jù)癥狀評分法用疊加量化記分法記分比較各組大鼠用藥前后癥狀積分。

2.4.2 鼻黏膜觀察 將10%甲醛溶液中固定的大鼠鼻黏膜，經(jīng)組織脫水、石臘包埋、切片、脫臘、蘇木精-伊紅染色、脫水、透明、封固等操作后，在顯微鏡下觀測實驗大鼠鼻黏膜組織學(xué)改變及嗜酸性粒細(xì)胞計數(shù)。

2.4.3 血清IL-4、IL-12水平檢測 根據(jù)酶標(biāo)儀檢測得到大鼠血清的吸光值，利用標(biāo)準(zhǔn)曲線的方程式計算得出待檢樣品中IL-4、IL-12的濃度（pg/mL）。根據(jù)試劑盒說明書，各試劑在使用前平衡至室溫。對比各組大鼠血清IL-4、IL-12水平。

2.4.4 大鼠鼻黏膜GATA-3 mRNA檢測 將-80℃冰箱中保存的大鼠鼻黏膜采用TRIzol試劑提取總RNA，確定總RNA濃度及純度后進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，進(jìn)行實時熒光定量分析。以每個標(biāo)準(zhǔn)拷貝數(shù)的對數(shù)為橫坐標(biāo)，以熒光信號達(dá)到設(shè)定閉值時所經(jīng)過的循環(huán)數(shù)值（Ct值）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出GATA-3 mRNA的擴(kuò)增曲線良好，融解曲線峰形單一。以精密度和回收率考證方法根據(jù)被檢測樣品的Ct值，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出樣本的模板拷貝數(shù)。同時，引入內(nèi)參基因GAPDH以減少樣品間差異，并記錄兩者Ct值。

2.5 統(tǒng)計學(xué)方法 在SPSS 21.0建庫并進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，數(shù)據(jù)以（±s）表示，符合正態(tài)分布且方差齊的組間資料采用方差分析，非正態(tài)分布或方差不齊的采用多個樣本非參數(shù)檢驗，當(dāng)P＜0.05時為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 實驗結(jié)果

3.1 各組大鼠干預(yù)后變應(yīng)性鼻炎癥狀評分比較 干預(yù)后各組大鼠變應(yīng)性鼻炎癥狀評分分別為：空白組（2.4±1.35）分，模型組（6.7±1.57）分，針刺組（3.0±0.82）分，西藥組（2.9±0.99）分。模型組大鼠評分明顯高于空白組（P＜0.01）；針刺組和西藥組評分明顯低于模型組（P＜0.05）；針刺組與西藥組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＝0.855）。

3.2 各組大鼠鼻黏膜組織學(xué)比較 空白組大鼠鼻黏膜組織幾乎無嗜酸性粒細(xì)胞浸潤；模型組鼻黏膜組織水腫，血管擴(kuò)張，大量嗜酸性粒細(xì)胞浸潤，表明嗜酸性粒細(xì)胞在變應(yīng)性鼻炎致敏中起重要作用；針刺組和西藥組鼻黏膜少量嗜酸性粒細(xì)胞聚集，無明顯充血水腫、血管擴(kuò)張的改變。見圖1。

3.3 各組大鼠血清IL-4、IL-12及鼻黏膜GATA-3 mRNA水平比較 結(jié)果見表2。針刺組與西藥組各指標(biāo)比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。大鼠鼻黏膜GATA-3 mRNA的表達(dá)，通過計算△Ct＝Ct（目的基因）－Ct（內(nèi)參基因），以△Ct進(jìn)行組間差異性比較。△△Ct＝△Ct（治療組）－△Ct（模型組），計算出GATA-3 mRNA的 相 對 表 達(dá) 量2-△△ct，2-△△ct的大小表示各組原始數(shù)值的關(guān)系，值越大表達(dá)量越高，值越小表達(dá)量越小。

4 討論

變應(yīng)性鼻炎屬中醫(yī)學(xué)“鼻鼽”范疇，其發(fā)病機(jī)制主要是由于肺、腎虛損，水濕犯鼻而致病。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為，變應(yīng)性鼻炎是環(huán)境因素作用于機(jī)體導(dǎo)致異常免疫反應(yīng)，大量研究表明Th1和Th2細(xì)胞間免疫反應(yīng)失衡是導(dǎo)致變應(yīng)性鼻炎發(fā)生的免疫學(xué)基礎(chǔ)之一[5]，輔助性T淋巴細(xì)胞亞群可以分為Th1和Th2兩種類型，它們通過所分泌的細(xì)胞因子相互調(diào)節(jié)，以維持機(jī)體免疫功能的平衡。正常情況下，Th按一定比例向Th1、Th2分化，兩者處于相對平衡狀態(tài)，維持著機(jī)體正常的細(xì)胞免疫和體液免疫功能。當(dāng)機(jī)體受到異?？乖碳r，上述平衡被打破，Th1、Th2細(xì)胞中Th2亞群表達(dá)升高，而Th1亞群表達(dá)降低。其中，Th2細(xì)胞起重要的作用，因為它能夠釋放關(guān)鍵的細(xì)胞因子，例如IL-4、IL-5、IL-6、IL-10及IL-13，特別是IL-4能夠促進(jìn)IgE的產(chǎn)生，IL-5能引起嗜酸性粒細(xì)胞的匯聚和活化，由此產(chǎn)生了“變態(tài)反應(yīng)中的Th2假說”。這個假說已得到實驗研究和基礎(chǔ)研究的支持[6]。現(xiàn)已知道，變應(yīng)性鼻炎Th1類細(xì)胞顯著降低，而Th2類細(xì)胞顯著升高，即發(fā)生明顯的Th細(xì)胞向Th2偏移，多條信號通路參與了Th2偏移的發(fā)生，而GATA-3是Th2偏移的核心信號分子[7]。

本研究結(jié)果表明，變應(yīng)性鼻炎模型大鼠血清存在IL-4水平升高、GATA-3 mRNA的高表達(dá)及IL-12水平的降低。針刺能改善大鼠鼻部過敏的癥狀，以及鼻黏膜過敏狀態(tài)；能顯著升高變應(yīng)性鼻炎大鼠血清IL-12含量，同時降低其血清IL-4含量，降低大鼠鼻黏膜GATA-3 mRNA的表達(dá)。GATA-3是Th類細(xì)胞因子的上游基因，因此，降低大鼠鼻黏膜GATA-3 mRNA的表達(dá)，調(diào)節(jié)變應(yīng)性鼻炎大鼠血清中IL-4和IL-12水平，可能是針刺治療變應(yīng)性鼻炎的機(jī)制之一。

圖1 各組大鼠鼻黏膜組織形態(tài)比較（20×10）

表2 各組大鼠血清IL-4、IL-12及鼻黏膜GATA-3 mRNA表達(dá)比較

本研究為中醫(yī)藥治療變應(yīng)性鼻炎提供科學(xué)依據(jù)，然針刺組與西藥組比較無明顯統(tǒng)計學(xué)差異，可能是本實驗樣本量不足，且本實驗?zāi)Ｐ痛笫笮枰虝r期內(nèi)處理，因此無法觀察長期療效，組間長期療效是否存在差異有待于進(jìn)一步研究。