高效液相色譜測(cè)定鯽魚(yú)組織中3-甲基喹噁啉- 2 -羧酸和喹噁啉- 2 -羧酸的殘留

應(yīng)寒松，鐘世歡，裘鈞陶，葉佳明

（浙江公正檢驗(yàn)中心有限公司，贊宇科技集團(tuán)股份有限公司，浙江杭州 310009）

0 引言

卡巴氧和喹乙醇同屬于喹噁啉類(lèi)化合物，是促生長(zhǎng)作用的飼料添加劑，能夠提高飼料轉(zhuǎn)化率和利用率，對(duì)魚(yú)類(lèi)致病菌具有抑制作用，被廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)品的促生長(zhǎng)和疾病防治。毒理學(xué)研究表明，卡巴氧和喹乙醇具有致癌致畸的毒副作用[1]，因此世界上大多數(shù)國(guó)家禁止在水產(chǎn)品養(yǎng)殖和治療中使用卡巴氧和喹乙醇，我國(guó)也明文規(guī)定禁止將喹乙醇和卡巴氧用于水產(chǎn)養(yǎng)殖。喹乙醇和卡巴氧能在動(dòng)物組織內(nèi)迅速代謝產(chǎn)生的相應(yīng)代謝物3 -甲基喹噁啉- 2 -羧酸（MQCA） 和喹噁啉- 2 -羧酸（QCA），是二者監(jiān)控常用的目標(biāo)殘留物。

目前水產(chǎn)品中MQCA和QCA常用的檢測(cè)方法有液相色譜法[2]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[3]和氣相色譜-質(zhì)譜法[4]。液質(zhì)聯(lián)用的方法由于儀器昂貴、檢測(cè)成本高而不易推廣。液相色譜法[5]目前使用酶水解提取，前處理步驟較為復(fù)雜，回收率偏低。研究通過(guò)簡(jiǎn)化前處理過(guò)程，通過(guò)酸水解前處理并使用固相萃取方法進(jìn)行凈化，研究建立適用于鯽魚(yú)組織中MQCA和QCA測(cè)定的高效液相色譜法，為卡巴氧和喹乙醇代謝物檢測(cè)提供靈敏度高、重現(xiàn)性好的定量分析方法。

1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.1.1 試驗(yàn)材料

鯽魚(yú)，用組織研磨儀研磨，混合均勻。

氫氧化鈉（分析純）、鹽酸（分析純）、甲酸（色譜純）、甲醇（色譜純）、乙酸乙酯（色譜純）、3-甲基喹噁啉- 2 -羧酸（純度99.0%）、喹噁啉-2 -羧酸（純度99.8%）、試驗(yàn)用水為超純水，Dr.Ehrenstorfer公司提供；OasisMAX固相萃取柱（60 mg/3 mL），Waters公司提供。

1.1.2 儀器和試劑

Agilent 1260型高效液相色譜儀配備紫外檢測(cè)器、AR2140型電子分析天平、IKA VORTEX GENIU 3型渦旋混合器、TGL-16G型臺(tái)式離心機(jī)、KS-300EI型超聲波清洗器、氮吹儀等。

1.2.1 提取

稱(chēng)取5 g（精確至0.01 g） 樣品置于50 mL離心管中，加入10 mL 1 mol/L的鹽酸溶液，渦旋混勻后超聲提取10 min，以轉(zhuǎn)速4 000 r/min離心10 min，取上清液，重復(fù)操作1次，合并提取液，加入10 mL正己烷，渦旋混勻，以轉(zhuǎn)速4 000 r/min離心5 min，取下層水相，待用。

1.2.2 凈化

將MAX固相萃取柱依次用2 mL甲醇、3 mL水活化，待試劑流至填料上層以下，加入樣品提取液，控制流速在3 mL/min以下。先后用3 mL 0.05 mol/L氫氧化鈉溶液和3 mL甲醇淋洗，抽干，用3 mL 2%含甲酸的乙酸乙酯溶液洗脫，洗脫液在40 ℃下氮吹吹干，用1 mL流動(dòng)相復(fù)溶，渦旋混勻，以轉(zhuǎn)速14 000 r/min冷凍離心5 min，取上清液供液相色譜測(cè)定。

色譜柱：Agilent SB-C18柱（250 mm×4.6 nm，4.6 μm），流動(dòng)相：1%甲酸水溶液和甲醇（甲酸水+甲醇=6+4）， 流速1 mL/min， 柱溫30 ℃， 進(jìn)樣量20 μL，波長(zhǎng)320 nm。

2 結(jié)果與分析

目前MQCA，QCA的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)主要依據(jù)農(nóng)業(yè)部781號(hào)公告-3-2006《動(dòng)物源食品中3 -甲基喹噁啉- 2 -羧酸和喹噁啉- 2 -羧酸殘留量的測(cè)定高效液相色譜法》，該方法前處理步驟較多，采用該法再萃取和反萃取中，目標(biāo)物容易損失，造成回收率偏低。試驗(yàn)優(yōu)化提取步驟，用鹽酸提取。試驗(yàn)分別以HCl濃度和酸解時(shí)間對(duì)水解過(guò)程進(jìn)行研究，用0.5，1.0，2.0，3.0，4.0 mol/L的HCl溶液進(jìn)行水解；水解時(shí)間選擇10，20，30，40 min。試驗(yàn)結(jié)果表明，1 mol/L HCl溶液水解10 min即可將目標(biāo)物從組織中提取出來(lái)。

魚(yú)肉組織樣品經(jīng)鹽酸提取正己烷去脂后，提取液含較多雜質(zhì)，會(huì)對(duì)結(jié)果造成影響，采用固相萃取柱凈化后，能降低基質(zhì)效應(yīng)的影響，提高儀器靈敏度。根據(jù)MQCA，QCA的結(jié)構(gòu)，分別選擇陰離子交換固相萃取柱（Oasis MAX柱）和反相固相萃取柱（Oasis HLB柱）進(jìn)行凈化效果考查。試驗(yàn)結(jié)果顯示，HLB柱凈化回收率為MQCA可達(dá)82.7%±2.5%，QCA可達(dá)79.3%±2.8%，MAX柱凈化回收率為MQCA可達(dá)93.5%±1.6%，QCA可達(dá)94.6%±2.1%，二者均能滿(mǎn)足MQCA，QCA的分析要求。二者比較，MAX柱回收率更高，因此選用MAX柱作為凈化萃取柱。

分別配置標(biāo)準(zhǔn)溶液，質(zhì)量濃度分別為0.05，0.10， 0.20， 0.50， 1.00， 2.00 μg/mL 進(jìn)行分析， 根據(jù)保留時(shí)間定性，使用峰面積為縱坐標(biāo)、質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。

MQCA、QCA的質(zhì)量濃度在0.05～2.00 μg/mL時(shí)呈線(xiàn)性分布，其中QCA線(xiàn)性回歸方程為Y=38.453 29X-0.117 32，相關(guān)系數(shù)為0.999 96；MQCA線(xiàn)性回歸方程為Y=26.435 17X+0.339 17，相關(guān)系數(shù)為0.999 97。采用空白基質(zhì)添加MQCA，QCA標(biāo)準(zhǔn)品的方法，以3倍信噪比計(jì)算檢出限MQCA，QCA為4.0 μg/kg。

0.5 μg/mL的MQCA和QCA標(biāo)準(zhǔn)色譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 0.5 μg/mL的MQCA和QCA標(biāo)準(zhǔn)色譜

選取鯽魚(yú)樣品，添加不同含量的MQCA，QCA標(biāo)準(zhǔn)品，按試驗(yàn)方法進(jìn)行處理，平行測(cè)定6份。

精密度與回收率見(jiàn)表1。

表1 精密度與回收率

由表1可知，QCA回收率為83.3%～88.5%，MQCA回收率為85.6%～90.2%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于5%。結(jié)果表明，此方法具有良好的準(zhǔn)確性和可靠性。

3 結(jié)論

試驗(yàn)使用酸水解提取鯽魚(yú)組織中MQCA，QCA，比較了不同濃度鹽酸提取效果，通過(guò)陰離子固相萃取柱凈化后，降低了基質(zhì)效應(yīng)，空白樣品加標(biāo)回收和重復(fù)性良好。通過(guò)研究，建立了鯽魚(yú)組織中3 -甲基喹噁啉- 2 -羧酸和喹噁啉- 2 -羧酸的高效液相色譜法，可用于鯽魚(yú)樣品中喹乙醇代謝物和卡巴氧代謝物的定量分析和日常檢測(cè)。