-Gx加速度對家兔肺組織基質(zhì)金屬蛋白酶9和基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑1水平的影響

韓 磊，李鳴皋，周家興，陳宇亮，孫海文

近年來,-Gx加速度作用對于人體重要臟器功能的影響機(jī)制及其防護(hù)方面的研究日益受到廣大到醫(yī)學(xué)工作者的重視。有研究顯示,模擬飛船返回過程中的較高G值水平的水平加速度作用可導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)動物重要臟器如腦、心、肺等的損傷性改變[1]。而航母艦載機(jī)飛行員駕機(jī)在航母上阻攔著艦時,由于攔阻索的阻攔作用,飛行員也將受到水平方向的加速度載荷的作用,其對飛行員的心、肺等重要臟器的影響及其作用機(jī)制目前仍不十分清楚,有待于進(jìn)一步研究?；|(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMP)9及其特異性抑制劑基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑(tissue inhibitor of metalloproteinase,TIMP)1作為調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)合成與降解的主要酶類,其與肺組織的炎癥損傷、修復(fù)與重建過程有著密切的關(guān)系[2-4]。然而,既往關(guān)于水平加速度作用與MMP9及其抑制劑TIMP1之間關(guān)系的研究罕見報道。作者將就-Gx加速度作用對MMP9及TIMP1表達(dá)水平的影響進(jìn)行研究,進(jìn)而探索-Gx暴露對肺臟結(jié)構(gòu)和功能的影響機(jī)制,為下一步艦載機(jī)飛行員心、肺功能的評價、訓(xùn)練與防護(hù)技術(shù)和標(biāo)準(zhǔn)的研究提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 1月齡的雄性新西蘭家兔20只,購自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心(2017-0002)。丙酮(滬試10000418),中性樹膠(上海標(biāo)本模型廠),無水乙醇(振興化工 XK13-011-0036),二甲苯(滬試100234192),Na2HPO4?12H2O(滬試 10020318),NaH2PO4?2H2O(滬試 20040718),檸檬酸(滬試10007118),免疫組化兩步法試劑盒(博士德SV0001 SV0002),隔水式恒溫培養(yǎng)箱(上海一恒 GHP-9050),電子天平(舜宇恒平儀器SOPTOP),電動震蕩儀(大龍MX-E),恒溫磁力攪拌器(新瑞儀器85-2),酸度計(雷磁 PHS-25),顯微鏡(奧林巴斯CX43)。

1.2 方法

1.2.1 動物分組 新西蘭家兔購回后,先于動物房中飼養(yǎng)1周,以使其適應(yīng)環(huán)境,然后隨機(jī)分為對照組和實(shí)驗(yàn)組(-Gx加速度暴露組),每組10只。

1.2.2 -Gx加速度暴露 實(shí)驗(yàn)動物呈坐位垂直固定于座椅上,放置于動物艙中固定好,使動物面朝軌道運(yùn)行方向。水平加速度作用條件為：加速度作用方向?yàn)橛尚刂帘?-Gx),加速度作用峰值3.6 G,加速度作用時間為2 s。每只實(shí)驗(yàn)動物每天暴露20次,2次暴露之間間隔5 min,共計暴露30 d。對照組動物所有固定程序同暴露組,不進(jìn)行水平加速度暴露。

1.2.3 標(biāo)本留取 水平加速度暴露結(jié)束后,將實(shí)驗(yàn)組和對照組動物靜脈注射空氣處死,迅速留取肺臟組織標(biāo)本。部分肺組織置于固定液中進(jìn)行固定,部分肺組織置于凍存管中放入液氮罐中保存。

1.2.4 膠原含量的測定 染色液的配制：天狼猩紅0.1 g,加入飽和100 mL的苦味酸溶液中,制成0.1%苦味酸-天狼猩紅染色液?？辔端?天狼猩紅染色：①實(shí)驗(yàn)組和對照組的每個肺組織選取2張石蠟切片；②切片依次浸入二甲苯(Ⅰ)5 min→二甲苯(Ⅱ)5 min；③經(jīng)各級乙醇至水洗：→100%乙醇5 min→95%的乙醇5 min→85%乙醇3 min→75%乙醇2 min→蒸餾水洗1 min；④切片入苦味酸-天狼猩紅染液中,染色1 h以上；⑤蒸餾水沖去多余的染色液,將切片入蘇木精染液中常規(guī)復(fù)染；⑥切片依次入95%乙醇(Ⅰ)5 min→95%乙醇(Ⅱ)5 min→無水乙醇(I)5 min→無水乙醇(Ⅱ)5 min；⑦切片依次入二甲苯(I)1 min→二甲苯(Ⅱ)1 min；⑧中性樹脂封片,晾干備用。

切片于顯微鏡下觀察,采用Motic Images Advanced 3.2圖像分析系統(tǒng)對結(jié)果進(jìn)行分析,經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)灰度校正后,在高倍鏡下隨機(jī)取5個不重疊的視野計算膠原容積分?jǐn)?shù)(collagen volume fraction,CVF),并計算其平均灰度值。其中,CVF＝膠原面積/全視野面積×100%。每個標(biāo)本2張切片的CVF的平均值作為該樣本膠原容積分?jǐn)?shù)值。在偏振光顯微鏡下觀察Ⅰ、Ⅲ型膠原的含量情況,用圖像分析軟件計算各組樣本Ⅰ/Ⅲ膠原比值。

1.2.5 MMP9和TIMP1含量的測定 ①包埋好的肺組織標(biāo)本用切片機(jī)進(jìn)行切片,切片厚度為4 μm；②將切片置于烘箱中,60℃條件下烘片1 h；③將烘好的切片依次置于二甲苯(Ⅰ)和二甲苯(Ⅱ)溶液中脫蠟10 min；④將切片依次置于梯度乙醇中進(jìn)行復(fù)水,具體步驟如下：100%乙醇5 min,100%乙醇5 min,95%乙醇5 min,80%乙醇5 min,蒸餾水沖洗5 min；⑤將切片置于0.1 mol/L且pH＝6.0的枸櫞酸液修復(fù)液中,沸水浴20 min,停止加熱后自然冷卻20～30 min；⑥切片置于磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline,PBS)中,于搖床上清洗切片,每次3 min,共3次；⑦切片于雙氧水中孵育20 min；⑧用PBS溶液清洗切片,每次3 min,共3次；⑨血清中封閉1 h；⑩切片晾干后,分別滴加MMP9(1∶500)和TIMP1(1∶500)一抗,于濕盒中 4 ℃下孵育過夜；○11切片置于PBS溶液中,于搖床上清洗切片,每次3 min,共5次；○12切片晾干后滴加二抗于切片上,在室溫條件下孵育1 h；○13于搖床上用PBS溶液搖動清洗切片,每次3 min,共5次,待切片晾干后,滴加二氨基聯(lián)苯胺溶液進(jìn)行染色,然后用清水沖洗；○14用蘇木素染核5 min,用流水沖洗多余的蘇木素,再置于分化液中分化1 s；○15將切片于流水中沖洗5 min,依次進(jìn)行梯度乙醇脫水,具體步驟如下：80%乙醇5 min,95%乙醇5 min,100%乙醇5 min,100%乙醇5 min；○16將切片依次入二甲苯(Ⅱ)透明5 min,二甲苯(Ⅰ)透明5 min,用中性樹膠封片,晾干后備用。

在顯微鏡下進(jìn)行觀察,并對結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計。統(tǒng)計計數(shù)時,對照組和實(shí)驗(yàn)組每只動物隨機(jī)選取3張切片,每張切片在高倍鏡下隨機(jī)選取10個高倍鏡視野,計數(shù)每個高倍鏡視野內(nèi)的陽性細(xì)胞數(shù),將10個視野內(nèi)的陽性細(xì)胞數(shù)的均數(shù)作為該切片的染色陽性細(xì)胞數(shù),分別計算對照組和實(shí)驗(yàn)組各樣本陽性細(xì)胞數(shù)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件,計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,組間比較用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn),以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 -Gx加速度作用對家兔肺組織MMP9含量的影響 MMP9表達(dá)陽性的細(xì)胞主要表現(xiàn)為細(xì)胞漿呈現(xiàn)出棕色或者黃色的染色結(jié)果(圖1)。與對照組相比,實(shí)驗(yàn)組動物肺組織MMP9蛋白表達(dá)水平顯著增高(P＜0.05,表1),提示水平加速度作用對實(shí)驗(yàn)動物肺組織MMP9的表達(dá)有著顯著的影響。

圖1 2組家兔肺組織MMP9表達(dá)情況

表1 -Gx加速度對2組家兔肺組織MMP9含量的影響(±s)

表1 -Gx加速度對2組家兔肺組織MMP9含量的影響(±s)

注：對照組比較,?P＜0.05

組別 MMP9對照組(n＝10) 13.7±7.2實(shí)驗(yàn)組(n＝10) 28.3±12.5?

2.2 -Gx加速度作用對家兔肺組織TIMP1含量的影響 TIMP1表達(dá)陽性的細(xì)胞主要表現(xiàn)為細(xì)胞漿呈現(xiàn)出棕色或者黃色的染色結(jié)果(圖2)。與對照組相比,實(shí)驗(yàn)組動物肺組織TIMP1蛋白表達(dá)水平顯著降低(P＜0.05,表2),提示水平加速度作用對實(shí)驗(yàn)動物肺組織TIMP1的表達(dá)有著顯著的影響。

圖2 2組家兔肺組織TIMP1表達(dá)情況

表2 -Gx加速度對2組家兔肺組織TIMP1含量的影響(±s)

表2 -Gx加速度對2組家兔肺組織TIMP1含量的影響(±s)

注：對照組比較,?P＜0.05

組別 TIMP1對照組(n＝10) 17.4±10.2實(shí)驗(yàn)組(n＝10) 8.6±5.9?

3 討論

MMPs是細(xì)胞外基質(zhì)降解所必需的、鋅離子依賴性的蛋白酶家族,為細(xì)胞外基質(zhì)的主要調(diào)控因素,在細(xì)胞外基質(zhì)合成與降解的過程中有著非常重要的作用[5-6]。MMP9又稱明膠酶B,可由單核-巨噬細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、纖維母細(xì)胞等合成和分泌,其在調(diào)控炎癥反應(yīng)、維持組織的正常結(jié)構(gòu)、組織損傷后的修復(fù)及促進(jìn)多種細(xì)胞因子的表達(dá)等方面均有著重要意義[7]。對MMP9表達(dá)的調(diào)控主要在轉(zhuǎn)錄、酶原的激活及其抑制物TIMP1等幾個方面進(jìn)行。多種炎性細(xì)胞因子,如白細(xì)胞介素(interleukin,IL)-1β、轉(zhuǎn)化生長因子(transforming growth factor,TGF)-α、TGF-β1、IL-1α、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor,TNF)-α等可促進(jìn)MMP9的表達(dá)。研究表明[8-12],作為MMPs中的重要一員,MMP9在細(xì)胞外基質(zhì)的重塑中有著重要的作用,在肺間質(zhì)纖維化、肺氣腫、心室重構(gòu)、動脈粥樣硬化、缺血-再灌注損傷、心力衰竭等多種疾病的病理過程中扮演著關(guān)鍵的角色。MMP9可降解細(xì)胞外基質(zhì)中的膠原成分,導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)的退行性變,造成組織細(xì)胞排列紊亂、功能障礙。MMP9 還能促進(jìn) TNF-α、TGF-β、IL-1β 等炎性細(xì)胞因子的表達(dá)水平上調(diào),促進(jìn)心、肺、腎等組織中膠原、纖維粘連蛋白等基因的轉(zhuǎn)錄,進(jìn)而使得膠原合成增加和在間質(zhì)的沉積,損害心、肺、腎等臟器功能；而這反過來又會促進(jìn)MMPs的表達(dá)水平上調(diào),形成惡性循環(huán),進(jìn)一步加重心、肺等組織結(jié)構(gòu)重構(gòu)和功能的障礙。本研究發(fā)現(xiàn),實(shí)驗(yàn)組動物心臟和肺組織的MMP9蛋白表達(dá)水平較對照組顯著增加,這一結(jié)果提示一方面水平加速度暴露可導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)動物心、肺等臟器MMP9表達(dá)水平的增高；另一方面水平加速度所導(dǎo)致的MMP9增高可能與其造成心、肺等臟器損傷的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。其機(jī)制可能與MMP9水平增高導(dǎo)致心肌間質(zhì)成分改變、膠原含量和比例變化以及炎性因素等有關(guān)。

TIMPs是MMPs的內(nèi)源性、特異性、天然性抑制劑。TIMPs與已激活的MMPs呈1∶1結(jié)合,與具有生物活性的MMPs非共價結(jié)合,與不具有生物活性的MMPs緊密結(jié)合呈復(fù)合物形式,如此不可逆的結(jié)合抑制了MMPs的活性。TIMPs在體內(nèi)分布廣泛,迄今已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的TIMPs家族有4種：TIMP1、TIMP2、TIMP3、TIMP4。研究表明[13],TIMPs除具有特異性地抑制MMPs外,還具有調(diào)控細(xì)胞增殖、凋亡等功能,從而保持體內(nèi)的動態(tài)平衡。不同TIMPs對MMPs家族成員的抑制作用具有特異性。對MMP9有特異性親和力的是TIMP1,TIMP1主要來自于肺泡巨噬細(xì)胞及上皮細(xì)胞,是所有家族中活性最強(qiáng)的,其主要抑制功能是通過活化MMP9的鋅離子活性中心與氨基酸功能區(qū)的半胱氨酸殘基相結(jié)合,從而阻斷MMP9與基底物的結(jié)合,減少細(xì)胞外基質(zhì)的降解,是體內(nèi)抑制、調(diào)節(jié)MMP9最主要的因素,從而對疾病進(jìn)展也可以發(fā)揮作用。生理情況下,在細(xì)胞基底膜保持完整的前提條件下,MMP9在機(jī)體中處于低活性狀態(tài),與TIMP1保持動態(tài)平衡,當(dāng)受到病理刺激時,導(dǎo)致細(xì)胞基底膜代謝紊亂,平衡被打破,出現(xiàn)一系列病理生理反應(yīng)[14-15]。

本研究中,實(shí)驗(yàn)組動物肺臟TIMP1蛋白的表達(dá)水平較對照組明顯降低,而其MMP9表達(dá)水平則顯著增高。這一結(jié)果提示水平加速度暴露導(dǎo)致的MMP9表達(dá)水平增高可能與其作用下TIMP1的表達(dá)受到抑制有關(guān)。結(jié)合在本研究中發(fā)現(xiàn)的水平加速度暴露導(dǎo)致的實(shí)驗(yàn)組動物心臟膠原含量增高和膠原比例變化,提示水平加速度暴露引起的MMP9/TIMP1平衡破壞,從而使得心、肺等臟器細(xì)胞間質(zhì)含量和成分改變,可能是加速度載荷對心、肺功能影響的作用機(jī)制之一。而關(guān)于水平加速度暴露導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)動物肺臟MMP9和TIMP1蛋白表達(dá)水平改變的具體機(jī)制,目前尚不清楚。在下一步研究中,我們將就此繼續(xù)加以探索。