基于流式細胞術(shù)的15個油茶品種基因組測定研究*

楊曉蘭 佟 巖 雷小林 徐林初 高立志

(1. 中國科學院昆明植物研究所，中國西南野生生物種質(zhì)資源庫，植物種質(zhì)與基因組學中心，云南 昆明 650201；2. 中國科學院大學，北京 100049；3. 江西省林業(yè)科學院，江西 南昌 330032)

基因組大小或稱C值，是指一個物種的配子體細胞核中染色體未進行復制時的DNA含量[1-2]，與物種的分類、進化及遺傳等密切相關(guān)，是研究生物基因組多樣性非常重要的特征參數(shù)[3]。迄今為止，測定基因組大小的方法主要有3種：孚耳根微顯影、基因組測序法以及流式細胞術(shù) (FCM)[4-5]。流式細胞術(shù)樣品制備方便、分析快速、能在短時間內(nèi)計算估測植物基因組C值，是測定C值的首選方法[6]。早在1983年Galbraith應(yīng)用流式細胞術(shù)對17種植物的DNA-C值進行檢測，開創(chuàng)了流式細胞術(shù)在植物中運用的先河[7]。目前應(yīng)用流式細胞術(shù)測定C值的方法在許多植物中均已有相關(guān)報道[8-12]。

油茶 (Camilliaoleifera) 隸屬于山茶屬之油茶組 (Sect.Oleifera)，種子含油量較高，與油棕 (Elaeisguineensis)、油橄欖 (Oleaeuropaea) 與椰子 (Cocusnucifera) 并稱為世界四大木本油料作物[13]。由油茶籽壓榨而獲得的茶油是一種優(yōu)質(zhì)食用油，因其化學成分與橄欖油相似，故有 “東方橄欖油” 之美譽[14]。茶油中富含油酸、亞油酸及亞麻酸等多種不飽和脂肪酸[15]，對降低心血管疾病、增強免疫力、降低膽固醇水平、預防與治療高血壓及預防某些癌癥疾病有顯著作用[16]，其余產(chǎn)物在農(nóng)業(yè)、工業(yè)及醫(yī)藥中也有重要的經(jīng)濟價值[17-20]。迄今，我國油茶栽培面積已達370萬hm2，目前中國正面臨著食用油自給不足的境況，因此提高油茶產(chǎn)量迫在眉睫[21]。2013年，Huang等報道了應(yīng)用流式細胞術(shù)測定約90余種山茶屬植物的基因組大小[22]。目前國內(nèi)關(guān)于流式細胞術(shù)檢測油茶品種C值的研究報道甚少，本研究采用流式細胞術(shù)對15個油茶品種進行2C值的檢測分析及基因組大小估測，為油茶的基因組學、細胞生物學及種質(zhì)資源的研究提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

15份油茶材料均于2018年3月中旬采自江西省林業(yè)科學院，剪取含嫩葉及嫩芽的枝條置于裝有少量水的水桶中帶回實驗室，及時換水，備用。以基因組大小為389 Mb的水稻日本晴 (Oryzasativasubsp.japonicacv. Nipponbare) 為標樣，種子由菲律賓國際水稻研究所提供，將種子置于濕潤培養(yǎng)皿中于20 ℃光照培養(yǎng)箱培養(yǎng)7 d萌發(fā)后種植于溫室備用。實驗材料取自油茶與水稻日本晴植物剛抽出的嫩葉。

1.2 實驗方法

1.2.1解離液篩選與熒光染料配制

流式細胞術(shù)有多種解離液及配制方法，為篩選出適用于油茶C值測定的最佳方法，本實驗應(yīng)用Galbraith′s (Gal)、WPB、Tris-MgCl2、Otto等4種常用解離液配方進行篩選[7,23-25]，經(jīng)過預實驗發(fā)現(xiàn)：Otto與WPB對水稻日本晴能檢測出穩(wěn)定峰形，而Gal與Tris-MgCl2對水稻日本晴細胞核解離效果較差，出峰不穩(wěn)定，峰形較差；由于油茶中含有大量糖類、酚類等活性物質(zhì)[26]，常規(guī)Gal、WPB、Tris-MgCl2、Otto等解離液對其解離效果較差，出峰效果差且雜質(zhì)峰較多，而改良的Otto法對油茶的適用性較好，峰形穩(wěn)定，因此選改良Otto解離液為本實驗的細胞解離液。熒光染料為終濃度1 mg/mL的碘化丙啶 (Propidium iodide, PI) 溶液，避光保存。Otto解離液配方為 (改良)[25]：OttoI—100 mmol/L 檸檬酸，0.5% (體積比) Tween 20, pH 2.0～3.0，4 ℃冰箱保存 (加少量PVP)；Otto II—400 mmol/L Na2HPO4·12H2O，pH 2.0～3.0，常溫下保存 (在使用時加少量PVP)。

1.2.2細胞核懸液制備與DNA特異性染色

取少量 (約40～50 mg) 日本晴標樣與油茶待測樣品嫩葉于培養(yǎng)皿中，將其置于冰上冰浴；加入2 mL冰浴的細胞解離液OttoI；快速切碎；混勻，用300目尼龍網(wǎng)過濾；13 000 r/min離心30 s，棄上清，加100 μL OttoI搖勻，室溫培養(yǎng)0.5～1 h；加1 mL Otto II，搖勻；加10 μL 10 mg/mL的核糖核酸酶A溶液 (RNase A Solution)，80 μL PI熒光染料，避光保存以備上機。

1.2.3上機檢測與數(shù)據(jù)收集

將制備好的細胞核懸液用300目尼龍網(wǎng)過濾至5 mL聚苯乙烯無帽圓底未滅菌流式管，用美國BD公司生產(chǎn)的FACSCalibur流式細胞儀上機檢測，設(shè)置參數(shù)，PI激發(fā)波長為488 nm，上機后收集通道FL2的熒光、檢測PI發(fā)射的熒光強度，每次收集2萬個細胞，每種植物取3次重復。收集數(shù)據(jù)以備分析。

1.3 數(shù)據(jù)分析

使用BD FACSCalibur自帶軟件Cellquest進行分析。變異系數(shù) (CV) 控制在6%以內(nèi)。內(nèi)標日本晴的基因組大小為389 Mbp，根據(jù)公式 (1)：待測樣本的基因組大小=標樣基因組大小 ×(待測樣本G0/G1峰熒光強度/標樣G0/G1峰熒光強度) 計算15個待測樣本的基因組大小值，2C值參照1 pg=978 Mbp計算得到[27-29]。收集數(shù)據(jù)用SPSS 19.0進行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

本實驗采用水稻日本晴作為內(nèi)標，分別測定了15個油茶材料的細胞懸浮液，部分測試結(jié)果如圖1。

括號中的數(shù)字為熒光強度平均值；M1為標出的熒光強度范圍。

圖1水稻日本晴與部分樣品樣品流式細胞儀測定結(jié)果
Fig.1 Results ofO.sativaandC.oleiferausing FMC

內(nèi)標水稻日本晴的DNA含量1C=0.397 5 pg，即其基因組大小為389 Mbp[30]。根據(jù)公式 (1) 計算本研究15份待測樣品的基因組大小，結(jié)果見表1。

山茶屬植物約有280余種[31]，目前僅有90余種的C值已被前人測定[22]。油茶作為山茶屬油茶組中種子含油量較高的一個種，在我國的栽培面積最大且栽培歷史最為悠久，對其進行基因組大小測定對進一步開展基因組學研究具有重要意義。從表1可知：15個油茶品種的2C值范圍在13.11～19.22 pg之間，其中2C值最小的是贛興系列的贛興47 (13.11 pg)，最大的是贛無系列的贛無12 (19.22 pg)，與此前報道的同屬植物2C值波動范圍相近，除贛興47、贛55、贛60及贛190四個品種外，其余品種的2C值均大于15.00 pg。多數(shù)品種的2C值介于15.00～18.00 pg之間，15個品種中只有贛無12的DNA-2C值大于18.00 pg。15個品種的基因組大小范圍為6 411.99～9 398.58 Mbp，其中基因組大小大于7 000 Mbp的品種占總體86%。根據(jù)單因素方差結(jié)果顯示15個油茶品種整體P=0.007 < 0.05，表明樣本之間存在顯著性差異。

表1 15個油茶品種的基因組大小Table 1 The genome size of 15 cultivars of C.oleifera

3 結(jié)論與討論

油茶作為我國栽培歷史悠久及栽培面積較大的重要油料樹種，其營養(yǎng)價值與經(jīng)濟價值早已得到廣泛關(guān)注，油茶研究工作者一直致力于油茶良種的選育，旨在增加油茶產(chǎn)量，提高茶油得率。植物DNA-C值數(shù)據(jù)庫于2012年已更新至6.0版本，目前該數(shù)據(jù)庫記錄了8 510種植物的DNA-C值數(shù)據(jù)，包括7 542種被子植物，355種裸子植物，128種蕨類植物，232種苔蘚植物及253種藻類植物[32]，該數(shù)據(jù)庫中關(guān)于油茶DNA-C值記錄較少。目前，國內(nèi)關(guān)于油茶品種C值的研究報道甚少。本研究所選擇的15個油茶品種中贛石84-8、贛永6、贛190、贛興46、贛無11、贛無12及贛無24七個品種為江西省國審良種，這些品種適宜栽培面積較廣且干仁含油率均大于45%，具有抗性強、結(jié)實早、產(chǎn)量高與豐產(chǎn)性能好等特征[33]。本研究采用基因組大小已知的水稻日本晴作為內(nèi)標，水稻日本晴與待測油茶樣品的DNA含量CV值在線性標尺模式下均控制在6%以內(nèi)，實驗結(jié)果穩(wěn)定可靠。

在應(yīng)用流式細胞術(shù)估測植物基因組大小的過程中，材料組織、解離液及染色試劑的選擇尤為重要[6]。關(guān)于解離液的適用性，經(jīng)過4種解離液的反復篩選，最終發(fā)現(xiàn)改良的Otto法對油茶品種的細胞解離效果更佳，能檢測出較穩(wěn)定的峰形。關(guān)于供試材料的選擇，經(jīng)嫩葉與成熟葉片對比發(fā)現(xiàn)嫩葉組織解離效果更佳，因此采用水稻種子萌發(fā)種植于溫室7 d后的嫩葉，油茶均采用剛抽出的頭3片嫩葉，每個樣本剪取質(zhì)量不超過50 mg。標樣與待測樣品的懸浮液在加入PI熒光染料避光染色10 min后再進行上機檢測。

本研究采用的內(nèi)標水稻日本晴的基因組大小為389 Mbp，根據(jù)公式計算得到贛55、贛60、贛71、贛190、贛833、贛無11、贛無12、贛無23、贛無24、贛石83-2、贛石83-3、贛石84-8、贛永6、贛興46與贛興47的基因組大小分別為7 268.70、6 970.13、7 446.85/7 085.32、8 458.23、7 705.29、9 398.58、8 193.28、7 435.63、8 596.78、8 296.73、7 920.70、8 009.80、8 682.67和6 411.99 Mbp，與前人報道的同屬90余種植物的基因組大小范圍相近[26]。方差分析結(jié)果表明，15個油茶品種的基因組大小存在顯著性差異。油茶作為我國南方的重要木本油料樹種，迄今為止國內(nèi)關(guān)于油茶的C值報道甚少，在本研究中改良的油茶細胞核懸液制備為今后測定山茶屬其它植物的C值提供了一定參考。

本研究以水稻日本晴為內(nèi)標，應(yīng)用流式細胞術(shù)測定了15個油茶品種的基因組大小，這些數(shù)據(jù)不僅可以豐富山茶屬植物的C值庫，而且將為油茶的基因組測序、品種改良、種質(zhì)資源研究及細胞生物學研究提供參考依據(jù)。