強直性脊柱炎患者外周血miR-146a、miR-155、miR-181a、miR-223的表達分析

姜芳，許敏，鄭錫銘

(駐馬店市中心醫(yī)院檢驗科，駐馬店 463000)

強直性脊柱炎(AS)是一種慢性進行性、炎癥性自身免疫疾病，發(fā)病多有家族聚集性，炎癥多影響全身外周大關(guān)節(jié)，可累積滑膜關(guān)節(jié)、軟骨關(guān)節(jié)、肌腱以及韌帶附著于骨的部位，使關(guān)節(jié)融合，導致不可逆性的僵直，具有較高的致畸性和致殘性[1，2]。目前，其診斷主要依賴于臨床癥狀及影像學資料；而一些病程短、病情較輕的患者由于缺乏特異性的指標而不能及時地早期診斷[2]。文獻報道，基質(zhì)金屬蛋白酶家族(MMP-1、2、3、9)，TNF-α、白細胞介素因子（IL-1、IL-6、IL-15、IL-17）、可溶性血管細胞黏附分子-1(VCAM-1)、高遷移率族蛋白1(HMGB-1)、骨橋蛋白(OPN)、HLA-B27 在 AS 的發(fā)病機制中起重要作用[3-8]。我們通過生物信息學分析 發(fā) 現(xiàn) miR-146a、miR-155、miR-181a、miR-223可靶向調(diào)控 MMPs、TNF-α、IL、VCAM-1、HMGB-1、OPN、HLA-B27 等蛋白的合成（圖 1），已有相關(guān)研究認為AS患者外周血中miRNA存在差異表達[9-11]，因此有人提出miRNA也可作為AS的一種新型的特異性分子診斷標志物[14]。本研究旨在通過檢測AS患者外周血血漿和PBMC中 miR-146a、miR-155、miR-181a、miR-223 表達是否有差異性，為AS發(fā)病機制的研究和臨床診斷提供新思維。

1 材料及方法

圖1 各指標診斷丙型肝炎肝硬化的ROC曲線對比圖1 利用生物信息學軟件預(yù)測與AS相關(guān)的miRNAs

1.1 研究對象 AS患者為我院2015年1月至2016年1月住院病人60例，臨床診斷均符合美國風濕病學會1987年修改的AS紐約標準，其中男性33例，女性27例。年齡14～62歲，平均（28.6±9.4）歲。同時，隨機選取30例同時期本院健康體檢者作為對照組，男女各15例，年齡為18歲～65歲，平均（32.1±10.1）歲；另外選取類風濕關(guān)節(jié)炎、骨關(guān)節(jié)炎及反應(yīng)性關(guān)節(jié)炎患者30例作為疾病對照組，其中男性18例，女性12例，年齡為17歲～60歲，平均（30.6±11.3）歲。選取的研究對象均排除其它自身免疫性疾病和重要器官系統(tǒng)疾病。以上樣本的收集均獲得患者同意及醫(yī)院倫理委員會批準。

1.2 方法

1.2.1 血漿、PBMC分離和small RNA提取 取EDTA抗凝血5ml，3000r/min離心5min分離血漿。采用Ficoll分離液分離PBMC。按試劑盒操作說明書提取血漿及PBMC中Small RNA，置無RNA酶水中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 引物的設(shè)計與合成 設(shè)計莖環(huán)引物、Realtime PCR上游引物；根據(jù)miRBase數(shù)據(jù)庫miR-146a、miR-155、miR-181a、miR-223 成熟序列并參考文獻設(shè)計其莖環(huán)引物、特異檢引物；通用下游引物：5’-3’：CTCAACTGGTGTCGTGGA。 引物合成及測序由上海生工公司完成。

1.2.3 cDNA合成及RT-PCR檢測 使用莖環(huán)特異性引物，以 small RNA 為模板，按 42℃，60min，70℃5min條件反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，4℃保存。采用Top Green qPCR SuperMix反應(yīng)體系：Top Green qPCR SuperMix 10μl，上、下游引物各 1.0μl，模板 2.0μl，加水至 20.0μl。 反應(yīng)條件為：95℃ 30s 1cycle；95℃5s，62℃ 30s，72℃ 30s 40 cycles；設(shè)置平行復孔，檢測結(jié)果取平均值，以雙標準曲線法進行qPCR定量分析。

1.3 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)采用（±s）表示，所有數(shù)據(jù)采用單因素方差分析；Pearson相關(guān)系數(shù)分析miRNA表達量與臨床參數(shù)之間的相關(guān)性；P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 AS 患者血 漿中 miR-146a、miR-155、miR-181a、miR-223表達 AS患者血漿中 miR-146a、miR-155、miR-181a和miR-223表達水平上調(diào)，顯著高于其在對照組中的表達（P＜0.05），詳見表1。

表 1 血漿 miR-146a、miR-155、miR-181a、miR-223 表達

2.2 AS 患者 PBMC 中 miR-146a、miR-155、miR-181a、miR-223表達 AS患者PBMC中 miR-146a、miR-155、miR-181a和miR-223表達水平上調(diào)，顯著高于其在對照組中的表達；同時，除miR-223外，miR-146a、miR-155和 miR-181a在 PBMC 中表達水平也高于其在血漿中的表達（P＜0.05），詳見表2。

表 2 PBMC miR-146a、miR-155、miR-181a、miR-223 表達

2.3 AS患者血漿及PBMC中miR-146a、miR-155、miR-181a、miR-223的相關(guān)性分析 Pearsion相關(guān)分析顯示，AS組血漿與PBMC中miR-146a、miR-155、miR-181a、miR-223 存在顯著正相關(guān)（r依次為0.845、0.781、0.899、0.807，P＜0.05）；詳見表 3。

表3 血漿PBMC中miRNA相關(guān)性分析

2.4 AS患者血漿、PBMC中miRNA與HLA-B27、CRP、ESR的相關(guān)性分析 Pearsion相關(guān)分析顯示，血漿與 PBMC中 miRNA 與 HLA-B27、CRP、ESR存在一定的相關(guān)性；血漿中miR-146a、miR-155、miR-181a、miR-223 與HLA-B27、ESR、CRP 正相關(guān) （r 依 次 為 0.372*、0.462、0.576、0.373*、0.516、0.603、0.483、0.560、0.635、0.478、0.544、0.324）。PBMC 中 miR-146a、miR-155、miR-181a、miR-223與 HLA-B27、ESR、CRP 正相關(guān) （r依次為 0.482、0.622、0.535、0.431、0.636、0.565、0.493、0.578、0.555、0.439、0.504、0.412）；詳見表 4。

2.5 AS患者血漿及 PBMC中 miR-146a、miR-155、miR-181a、miR-223 ROC曲線分析 為評估血漿及PBMC中miRNA對AS的診斷價值，對AS患者血漿和 PBMC 中 miR-146a、miR-155、miR-181a、miR-223的表達量進行ROC分析，結(jié)果見表5。對miR-146a來說，其血漿診斷臨界值為8.18×109(copies/μl)時，敏感度為85.00%，特異度為93.33%；其血 PBMC診斷臨界值為 5.15×1011(copies/μl)時，敏感度為 73.33%，特異度為76.67%。。對miR-155來說，其血漿診斷臨界值為3.95×103(copies/μl)時，敏感度為 80.00%，特異度為83.33%；其血 PBMC診斷臨界值為 6.05×103(copies/μl)時，敏感度為75.00%，特異度為80.00%。對miR-181a來說，其血漿診斷臨界值為4.86×102(copies/μl)時，敏感度為85.00%，特異度為86.67%；其血 PBMC診斷臨界值為 5.90×103(copies/μl)時，敏感度為75.00%，特異度為80.00%。對miR-223來說，其血漿診斷臨界值為 6.25×109(copies/μl)時，敏感度為61.67%，特異度為56.67%；其血PBMC診斷臨界值為1.51×108(copies/μl)時，敏感度為75.00%，特異度為80.00%。詳見圖2。

表4 血漿、PBMC中miRNA與HLA-B27、CRP、ESR的相關(guān)性分析

圖2 血漿及PBMC 中miR-146a、miR-155、miR-181a、miR-223 ROC曲線

2.6 AS患者血漿及 PBMC中 miR-146a、miR-155、miR-181a、miR-223的 Logistic回歸分析 為探究 AS患者血漿和 PBMC中 miR-146a、miR-155、miR-181a、miR-223在AS發(fā)病過程中發(fā)揮的作用，對其在患者中表達量的進行多因素Logistic回歸分析，結(jié)果見表6。

表5 AS患者血漿及PBMC中miR-146a、miR-155、miR-181a、miR-223的ROC曲線分析

表6 患者血漿及PBMC中miR-146a、miR-155、miR-181a、miR-223的Logistic回歸分析

3 討論

強直性脊柱炎（AS）作為一種原因復雜的炎性自身免疫性疾病，引起骶髂關(guān)節(jié)及脊柱附著點炎癥，累及腰椎、胸椎等關(guān)節(jié)，進而導致骨性強直。目前研究認為該病與機體免疫功能異常密切相關(guān)。miRNA作為一類小片段內(nèi)源性非編碼RNA，在多種炎性和自身免疫功能調(diào)節(jié)過程中發(fā)揮著重要作用。。miR-146a在類風濕關(guān)節(jié)炎患者表達明顯增加[12]，而在系統(tǒng)性紅斑狠瘡患者體內(nèi)的表達明顯減少[13]，有研究報道，在AS患者過表達的miR-146a能有效抑制腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6（TRAF6）和白細胞介素一1受體相關(guān)激酶1（IRAK1）的表達，促進破骨細胞的產(chǎn)生過多，進而導致骨破壞[14]。miR-155能夠通過激活核因子κB(NF-κB)信號通路，介導炎癥因子的合成，促進炎性因子的表達，同時刺激抗原特異性輔助性T細胞17(Thl7)及自身抗體的生成，加劇機體炎癥損傷；另外，miR-155可通過下調(diào)其靶標IKBKE的表達來抑制MMP-3的分泌，在AS患者骨質(zhì)破壞過程中發(fā)揮一定的保護作用[11，15]。miR-181在T細胞免疫發(fā)揮作用過程中起到重要作用，miR-181表達水平的改變可能引起自身免疫性疾病的發(fā)生[16]。在系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者外周血PBMC中miR-181的表達水平較對照組表達下調(diào)，引起其靶基因PCAF(P300PCBP associated factor)的表達量增高，介導基質(zhì)金屬蛋白酶的活性[17]。過量破骨活動導致一系列的骨代謝紊亂miRNAs是破骨細胞分化的一個關(guān)鍵因素，miR-223對破骨細胞分化起著關(guān)鍵作用。Sugatani T的研究發(fā)現(xiàn)，miR-223高表達能抑制破骨細胞分化，因此miR-223可能作為AS一個治療的靶點[18]。早期的研究表明，血清miR-223在AS患者呈高表達，并且在疾病活動期表達更高，表明其表達水平不僅可以體現(xiàn)疾病的存在，且可以反應(yīng)疾病嚴重程度。本組研究結(jié)果表明，AS患者血漿及PBMC中 miR-146a、miR-155、miR-181a 和 miR-223 表達水平上調(diào)，顯著高于其在對照組中的表達，并且具有顯著的相關(guān)性。

HLA-B27、ESR、CRP作為臨床常用的 AS診斷及疾病活動監(jiān)測指標，Pearsion相關(guān)分析顯示，血漿及 PBMC中 miRNA 與 HLA-B27、CRP、ESR存在一定的正相關(guān)性。這提示miR-146a、miR-155、miR-181a、miR-223的表達上調(diào)與AS的病情活動性相關(guān)。對血漿及PBMC中miR-146a、miR-155、miR-181a、miR-223的表達量進行 ROC分析發(fā)現(xiàn)，其對AS具有很強的臨床診斷能力。多因素Logistic 回歸分析發(fā)現(xiàn)，miR-146a、miR-155、miR-181a及miR-223對AS均具有一定的致病作用，其中miR-146a的作用尤為顯著。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)miR-146a、miR-155、miR-181a、miR-223在 AS患者血漿、PBMC中表達上調(diào)，其表達水平可作為AS潛在的診斷指標。miR-146a、miR-155、miR-181a、miR-223 可通過靶向相關(guān)的致病基因在AS的發(fā)病過程中發(fā)揮重要作用，但其在AS發(fā)病機制中可能發(fā)揮的具體作用目前尚不清楚，有待進一步研究，以便為AS的治療提供新的方向。