替加環(huán)素不敏感肺炎克雷伯菌臨床分離株的耐藥性分析及檢測方法評價

鐘希 ，鐘橋石 ，程楓 ，丁慧 ，杭亞平

(1、萍鄉(xiāng)市第二人民醫(yī)院檢驗科，江西 萍鄉(xiāng)337000；2、南昌大學第二附屬醫(yī)院檢驗科，江西 南昌 330006；3、江西省胸科醫(yī)院檢驗科，江西 南昌330006)

肺炎克雷伯菌為院內(nèi)感染常見重要致病菌， 對臨床常用抗菌藥物多呈高度耐藥，多重耐藥和廣泛耐藥菌株檢出率近年來有所上升[1]。臨床亟需一種能克服現(xiàn)有耐藥機制的全新藥物。替加環(huán)素是用于臨床的新型甘氨酰四環(huán)素類廣譜抗生素，能有效抑制碳青霉烯酶類耐藥細菌引起的感染[2]。然而，近幾年替加環(huán)素的耐藥株不斷出現(xiàn)[1，3-5]，使得替加環(huán)素的耐藥問題也越來越受到關(guān)注，但研究主要集中于鮑曼不動桿菌。有關(guān)肺炎克雷伯菌替加環(huán)素耐藥情況國內(nèi)報道較少。與此同時，我國采用的美國臨床實驗室標準協(xié)會(CLSI)標準并未推薦適合臨床微生物實驗室常規(guī)使用的檢測替加環(huán)素敏感性的方法。然而，臨床需要依據(jù)體外藥敏試驗來確定用藥方案。因此，我們探討肺炎克雷伯菌對替加環(huán)素藥敏試驗的常用檢測方法及其耐藥情況，以期為臨床合理應用替加環(huán)素提供實驗室依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來源 從2016年1月17日至2016年4月15日南昌大學第二附屬醫(yī)院臨床分離的108株肺炎克雷伯菌中，收集非重復的替加環(huán)素不敏感的肺炎克雷伯菌共34株。

1.1.2 儀器與試劑 VITEK2-Compact全自動細菌分析儀及配套鑒定卡和藥敏卡，法國生物梅里埃公司產(chǎn)品；水解酪蛋白(MH)瓊脂購于Oxoid公司；替加環(huán)素的E-test條 (0.016-256ug/ml)，瑞典AB Biomerieux公司提供。

1.2 方法

1.2.1 菌株鑒定及藥敏試驗 經(jīng)VITEK2-Compact對所有菌株進行鑒定及藥敏檢測，篩選出替加環(huán)素不敏感菌株，再進行E-test條檢測，操作步驟同K-B藥敏紙片法。質(zhì)控菌株肺炎克雷伯菌ATCC700603、霍氏腸桿菌ATCC700323和金黃色葡萄球菌ATCC29213對MH培養(yǎng)基及E-test條進行質(zhì)控。藥敏結(jié)果參照美國食品藥品監(jiān)督局(FDA)判斷標準進行判讀，即MIC≤2ug/ml為敏感(S)、4ug/ml為中介(I)、≥8ug/ml為耐藥(R)。

1.2.2 統(tǒng)計學分析 SPSS 20.0進行統(tǒng)計學分析，采用χ2檢驗比較相同判讀標準的兩種方法得到的敏感、中介及耐藥率。

2 結(jié)果

2.1 替加環(huán)素不敏感菌株對14種常見抗菌藥物的耐藥特性 分析顯示，16株肺炎克雷伯菌對常見抗菌藥物的耐藥性嚴重，其中對環(huán)丙沙星和左旋氧氟沙星耐藥率100%；對頭孢曲松、頭孢唑啉、頭孢吡肟、頭孢西丁、慶大霉素、亞胺培南、磺胺甲基異噁唑、哌拉西林/他唑巴坦、阿莫西林/克拉維酸和氨曲南耐藥率高達80%以上；對阿米卡星和妥布霉素耐藥率大于65%，詳見表1。

2.2 兩種方法檢測結(jié)果一致性比較 據(jù)CLSI標準分類一致性(CA)定義為被評估方法與E-test法藥敏結(jié)果判斷為一致的菌株百分比。VITEK2法與E-test法藥敏結(jié)果判讀為一致的菌株百分比為17.6%(6株)，不敏感判讀一致性的菌株百分比為47.1%（16株）兩種方法的藥敏結(jié)果一致性偏低。

2.3 兩種方法測定不同菌株對替加環(huán)素的藥敏結(jié)果 34株肺炎克雷伯菌經(jīng)VITEK2法檢測，得到18株耐藥株(61.8%)，經(jīng)E-test法確認后，顯示7株敏感、10株中介、1株耐藥。而 16株中介株(38.2%)，經(jīng)E-test法確認后，顯示 11株敏感、5株中介。兩種檢測方法對替加環(huán)素藥敏結(jié)果的差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.01，χ2值 36.33)，詳見表 2。

2.4 E-test法確認后替加環(huán)素不敏感菌株的產(chǎn)酶特性 產(chǎn)ESBLs的肺炎克雷伯菌與非產(chǎn)ESBLs的肺炎克雷伯菌對替加環(huán)素的敏感性結(jié)果顯示，存在統(tǒng)計學差異 (P＜0.01，χ2值 8.54)，ESBLs+肺炎克雷伯菌對替加環(huán)素的耐藥性比ESBLs-肺炎克雷伯菌更嚴重。碳青霉烯類不敏感肺炎克雷伯菌(CRKP)和敏感肺炎克雷伯菌(CSKP)對替加環(huán)素的敏感性比較得到存在統(tǒng)計學顯著差異 (P＜0.01，χ2值9.62)，后者對替加環(huán)素耐藥更嚴重，詳見表3。

表2 兩種檢測方法對替加環(huán)素耐藥率的檢測結(jié)果比較（%）

表3 不同產(chǎn)酶情況下肺炎克雷伯菌對替加環(huán)素耐藥率及其耐藥率的比較（%）

3 討論

替加環(huán)素抗菌譜廣，抗菌活性強，無論對G+菌還是對G-菌以及需氧菌和厭氧菌均有非常強的抗菌活性。作為首個被批準用于臨床的靜脈內(nèi)給藥的甘氨酰環(huán)素類抗生素，替加環(huán)素主要是通過限制細菌對藥物的外排作用和核糖體保護這兩種耐藥機制產(chǎn)生超強的抗菌活性效應，為多重耐藥菌甚至“超級細菌”的抗感染治療提供了新手段。近年來，多重耐藥菌對替加環(huán)素的耐藥也越來越嚴重。在美國，多重耐藥肺炎克雷伯菌對替加環(huán)素的耐藥率為9.2%(MIC28mg/L，F(xiàn)DA[6])，而在西班牙產(chǎn)ESBLs的肺炎克雷伯菌的替加環(huán)素耐藥率為33.3%(MIC＞2mg/L，EUCAST[7])。 顯然與碳青霉烯類耐藥肺炎克雷伯菌的日益增多和替加環(huán)素使用的增加[8]密切相關(guān)。我院在2015年之前還未見肺炎克雷伯菌對替加環(huán)素耐藥情況的報道[9]，肺炎克雷伯菌短時間內(nèi)出現(xiàn)較多對替加環(huán)素不敏感菌株，應引起感染控制部門的高度重視，是否存在同源性菌株播散，有待進一步研究。

有研究報道，AcrAB外排泵基因的高表達可同時引起腸桿菌科細菌對替加環(huán)素、四環(huán)素和喹諾酮類抗生素MIC值的升高[2]。此外，越來越多的證據(jù)表明耐藥株可以通過質(zhì)粒介導的外排泵基因使得耐藥基因在不同種屬菌株之間進行水平傳播[10]。因此，替加環(huán)素耐藥菌株的不斷出現(xiàn)，可能與外排泵基因密切相關(guān)。表1顯示出我們篩選的16株替加環(huán)素不敏感肺炎克雷伯菌耐藥性普遍嚴重，很難為臨床用藥提供經(jīng)驗參考，同時表明細菌共同攜帶的耐藥表型和耐藥機制日趨多樣化、復雜化。外膜蛋白缺失僅僅使碳青霉烯類藥物的MIC升高并不能達到耐藥折點，合并產(chǎn)ESBLs可產(chǎn)生高水平耐藥，因此ESBLs高產(chǎn)率菌株會導致更多的對碳青霉烯類藥物耐藥[11]。本研究結(jié)果顯示ESBLs+肺炎克雷伯菌和CSKP對替加環(huán)素的耐藥性更嚴重，可推測ESBLs+菌株會表現(xiàn)出對替加環(huán)素的交叉耐藥，也支持了替加環(huán)素可用于治療CRKP感染的可行性。

臨床上檢測替加環(huán)素的體外活性的方法很多，但常常因各種客觀條件而影響結(jié)果的準確性[12]?，F(xiàn)在臨床上檢測替加環(huán)素的體外活性的方法以微量肉湯稀釋法（BMD）為參考標準；在鮑曼不動桿菌中，經(jīng)E-test法和BMD獲得的替加環(huán)素MIC結(jié)果可能不一致[13]；在肺炎克雷伯菌中，兩種方法檢測的替加環(huán)素MIC結(jié)果一致性較好。本實驗結(jié)果表明VITEK2法檢測肺炎克雷伯菌對替加環(huán)素的耐藥率假性偏高，與國內(nèi)外報道一致[13]。因此，進一步證實VITEK2法不能作為檢測肺炎克雷伯菌對替加環(huán)素敏感性的常規(guī)方法，尤其是對于產(chǎn)ESBLs肺炎克雷伯菌和碳青霉烯類敏感肺炎克雷伯菌，宜采用E-test法對替加環(huán)素不敏感菌株進行復核，避免誤差，為臨床合理用藥提供可靠的依據(jù)。