黑曲霉內(nèi)切葡聚糖酶系的基本酶學(xué)特征解析

佟新新，金 鵬，李偉國(guó)，劉曉光，路福平，Suren Singh，王正祥

(1. 天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津 300457；2. 天津科技大學(xué)化工與材料學(xué)院，天津 300457；3. 德班理工大學(xué)食品生物工程系，德班 4001，南非)

β-葡聚糖是由右旋葡萄糖通過(guò) β-1，3-(1，4)-糖苷鍵聚合而成的多糖，是植物細(xì)胞壁的主要組成成分之一[1]，在谷物、海藻和海帶等生物質(zhì)中含量豐富[2]．β-葡聚糖酶是一類能降解β-葡聚糖的水解酶類的總稱．除了作為水解纖維素的重要酶系，β-葡聚糖酶在食品加工、動(dòng)物飼料、發(fā)酵和紡織等工業(yè)領(lǐng)域有廣泛應(yīng)用[2-3]．按照其水解 β-葡聚糖的特異性，可將β-葡聚糖酶分為 4類，即特異性的 β-1，3-1，4-葡聚糖酶(地衣多糖酶，EC 3.2.1.73)、非特異性的 β-1，3(4)-葡聚糖酶(EC 3.2.1.6)、β-1，3-葡聚糖酶(昆布多糖酶，EC 3.2.1.39)和 β-1，4-葡聚糖酶(纖維素酶E1，EC 3.2.1.4)[4-5]．

目前，微生物是β-葡聚糖酶的主要來(lái)源．工業(yè)上使用的 β-葡聚糖酶主要來(lái)源于曲霉和木霉等絲狀真菌[6-7]．盡管研究者們已經(jīng)對(duì)許多不同來(lái)源(細(xì)菌、酵母和絲狀真菌)的內(nèi)切葡聚糖酶進(jìn)行了基因克隆表達(dá)和酶學(xué)性質(zhì)研究，但基本上都是單個(gè)酶的研究報(bào)道．石潤(rùn)潤(rùn)[8]采用構(gòu)建酶庫(kù)的方式成功將 22個(gè)不同來(lái)源的內(nèi)切葡聚糖酶基因在大腸桿菌(Escherichia coli)中進(jìn)行了克隆表達(dá)，但只對(duì)其中3個(gè)酶進(jìn)行了酶學(xué)性質(zhì)研究．迄今為止，還沒(méi)有系統(tǒng)研究某一微生物體內(nèi)全部β-葡聚糖酶生化特征的報(bào)道．

已知黑曲霉是自然環(huán)境中 β-葡聚糖酶系極為完整與豐富的生物物種，前人從黑曲霉中克隆表達(dá)和分離鑒定了多種內(nèi)切葡聚糖酶，包括 En4gB[9-15]、En4gG[16-19]、EglC[20]、XengA[21]等．隨著黑曲霉基因組的解析完成[22]，從基因組水平再認(rèn)識(shí)這一物種的內(nèi)切葡聚糖酶系成為可能．本課題組前期將黑曲霉來(lái)源的 3個(gè) β-1，3(4)-葡聚糖酶(En3gA、En3gB 和En3gC)進(jìn)行了基因克隆表達(dá)和酶學(xué)性質(zhì)的初步解析[23]．在此基礎(chǔ)上，本研究進(jìn)一步通過(guò)基因克隆與異源表達(dá)，對(duì)黑曲霉基因組中全部可能的內(nèi)切葡聚糖酶進(jìn)行系統(tǒng)研究與比較分析，解析了其基本組成與酶學(xué)特征．由于此菌同時(shí)具有蔗糖酶和內(nèi)切菊粉酶等果糖基水解酶系[24]，本研究將為全面認(rèn)知黑曲霉 β-葡聚糖酶系及其可能的工業(yè)應(yīng)用奠定基礎(chǔ)．

1 材料與方法

1.1 菌株、質(zhì)粒及培養(yǎng)條件

菌株黑曲霉(A．niger)CICIM F0510是從自然樣本分離保藏的野生菌株，由江南大學(xué)中國(guó)高校工業(yè)微生物資源與信息中心提供[23]．大腸桿菌(E．coli)JM109由本實(shí)驗(yàn)室保藏．畢赤酵母(P．pastoris)GS115以及質(zhì)粒pPIC9k購(gòu)自Invitrogen公司．

黑曲霉通常采用 PDA培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，為了獲得 eglA基因的 mRNA，培養(yǎng)該菌的培養(yǎng)基(g/L)：NaNO33，K2HPO41，MgSO4·7H2O 0.5，KCl 0.5，F(xiàn)eSO40.01，酵母膏 5，蛋白胨 10，乳糖 20，菊粉 10，果糖10．大腸桿菌采用LB培養(yǎng)基培養(yǎng)；畢赤酵母及其重組菌的培養(yǎng)基及其培養(yǎng)方法按照 Invitrogen公司的畢赤酵母操作手冊(cè)進(jìn)行．

1.2 主要試劑

PyrobestTMDNA Polymerase、限制性內(nèi)切酶和T4 DNA連接酶，大連寶生物工程有限公司；小量DNA產(chǎn)物純化回收試劑盒、質(zhì)粒小量提取試劑盒，Omega Bio-Tek公司；酵母基本氮源培養(yǎng)基(YNB)、G418，Sigma Aldrich公司；RNA抽提試劑盒、cDNA合成試劑盒，Roche公司；氨芐青霉素、3，5-二硝基水楊酸和羧甲基纖維素鈉(CMC-Na，聚合度 800～1200)，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；茯苓多糖(含量為 50%)，西安森冉生物工程有限公司；胰蛋白胨和酵母提取物，英國(guó) Oxiod公司；其他生化試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純．

1.3 黑曲霉內(nèi)切葡聚糖酶系的基因克隆與表達(dá)

1.3.1 畢赤酵母工程菌的構(gòu)建

黑曲霉總 RNA的提取以及 cDNA的制備按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行．PCR產(chǎn)物、質(zhì)粒的純化、酶切、連接、電轉(zhuǎn)化以及轉(zhuǎn)化子的篩選等參考文獻(xiàn)[24]方法進(jìn)行．此外，基因克隆過(guò)程中所采用的 17對(duì)寡核苷酸引物均由上海生工生物工程有限公司合成，其核苷酸序列見(jiàn)表1，下劃線部分為限制性酶切位點(diǎn)．

表1 引物序列Tab. 1 Sequence of primers

續(xù) 表

1.3.2 重組酶的誘導(dǎo)表達(dá)與制備

采用前期建立的 MMH-CMC平板篩選法[23]篩選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，并通過(guò)透明圈大小初步判斷轉(zhuǎn)化子的酶活力．選取酶活力較大的轉(zhuǎn)化子接種到 25mL BMGY 培養(yǎng)基中培養(yǎng)至 A600＝2～6(約 16～18h)．5000r/min離心 5min后，將酵母細(xì)胞重懸于50mL BMMY 培養(yǎng)基中使得 A600＝1.0，30℃、200r/min搖床培養(yǎng)，每隔24h補(bǔ)加100%甲醇至終體積分?jǐn)?shù)為 0.5%以維持誘導(dǎo)，同時(shí)進(jìn)行取樣測(cè)定酶活力．發(fā)酵結(jié)束后，12000r/min離心 10min收集發(fā)酵上清液(即為粗酶液)，-20℃保藏備用．

1.4 內(nèi)切葡聚糖酶的酶活力測(cè)定

以1% CMC-Na(溶于0.2mol/L磷酸緩沖液，pH 6.0)為底物，采用黏度法[23]對(duì)內(nèi)切葡聚糖酶的酶活力進(jìn)行測(cè)定．1個(gè)單位的內(nèi)切葡聚糖酶的酶活力定義：在50℃、pH 6.0的條件下，每分鐘從1%的CMC-Na溶液中降解釋放1mg CMC所需的酶量．

1.5 重組內(nèi)切葡聚糖酶的酶學(xué)特征分析

1.5.1 最適作用溫度的測(cè)定

取500μL經(jīng)過(guò)適當(dāng)稀釋的酶液，加入30mL 1%CMC-Na溶液(溶于0.2mol/L磷酸緩沖液，pH 6.0)，分別在 30、40、45、50、55、60、70、80℃水浴反應(yīng)30min后，煮沸 10min滅酶．待樣品冷卻至室溫后，用黏度法進(jìn)行酶活力測(cè)定．以酶活力最高者為100%，并計(jì)算所處溫度下的相對(duì)酶活力．

1.5.2 最適作用pH的測(cè)定

分別將重組酶的酶液用pH為3.0、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、7.0、8.0的 Na2HPO4-檸檬酸緩沖液進(jìn)行適當(dāng)稀釋后，取 500μL加入到 30mL用相應(yīng) pH的Na2HPO4-檸檬酸緩沖液配制的1%CMC-Na溶液中，于每種酶的最適反應(yīng)溫度下準(zhǔn)確反應(yīng) 30min后，煮沸處理10min進(jìn)行滅酶．冷卻至室溫后，用黏度法進(jìn)行酶活力測(cè)定，并計(jì)算重組酶的相對(duì)酶活力．

1.5.3 熱穩(wěn)定性的測(cè)定

分別取 500μL經(jīng)過(guò)適當(dāng)稀釋的酶液置于 30、40、45、50、55、60、70、80℃的水浴條件下孵育2h．每隔30min取出樣品，在冰上放置10min后，加入30mL 1% CMC-Na溶液．于各種酶的最適反應(yīng)溫度條件下反應(yīng) 30min，采用黏度法測(cè)定殘余酶活力，以未進(jìn)行熱處理酶液的酶活力為 100%，計(jì)算相對(duì)酶活力．

1.5.4 pH穩(wěn)定性的測(cè)定

分別將重組酶的酶液用pH為3.0、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、7.0和8.0的Na2HPO4-檸檬酸緩沖液適當(dāng)稀釋后，取 500μL加入到 3mL相應(yīng) pH的 Na2HPO4-檸檬酸緩沖液中，室溫(25℃)孵育 1h．分別加入12mL 0.2mol/LNa2HPO4-檸檬酸緩沖液(pH 6.0)，最后加入 15mL 2% CMC-Na溶液(溶于 0.2mol/L的Na2HPO4-檸檬酸緩沖液，pH 6.0)，于各種酶的最適反應(yīng)溫度下反應(yīng) 30min，滅酶并冷卻至室溫，然后進(jìn)行酶活力測(cè)定．以酶活力最高者為 100%計(jì)算殘余酶活力，確定內(nèi)切葡聚糖酶的pH穩(wěn)定性．

1.5.5 重組內(nèi)切葡聚糖酶的底物水解特征

按照1.4節(jié)的酶活力測(cè)定方法，研究?jī)?nèi)切葡聚糖酶對(duì) CMC-Na的水解特征．以 2mL 1%茯苓多糖溶液(溶于 0.2mol/L的 Na2HPO4-檸檬酸緩沖液，pH 5.0)為底物，加入經(jīng)過(guò)適當(dāng)稀釋的 200μL粗酶液，對(duì)照組為200μL畢赤酵母GS115的發(fā)酵液．50℃水浴反應(yīng) 30min后，采用 3，5-二硝基水楊酸法(DNS法)[25]進(jìn)行酶活力測(cè)定，以確定內(nèi)切葡聚糖酶對(duì)茯苓多糖的水解特征．

1.6 黑曲霉內(nèi)切葡聚糖酶的生物信息學(xué)分析

將黑曲霉 CICIM F0510的 17種內(nèi)切葡聚糖酶進(jìn)行測(cè)序后，獲得新的氨基酸序列．利用 Clustal X2軟件對(duì)序列進(jìn)行多序列比對(duì)，并通過(guò)軟件 MEGA 4.0以鄰近法(Neighbour-joining)構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)[26]．采用在線軟件MUSCLE(http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/muscle/)進(jìn)行氨基酸序列比對(duì)．

2 結(jié)果與分析

2.1 基因的克隆、表達(dá)與重組酶的制備

依據(jù) A．niger CBS 513.88基因組序列信息(EMBL AM270980—AM270998)，采用BLAST等分析方法獲得了確定或疑似內(nèi)切葡聚糖酶編碼基因信息(共 17個(gè)基因)．以 A．niger CICIM F0510的cDNA為模板，對(duì)上述 17個(gè)目標(biāo)基因進(jìn)行 PCR擴(kuò)增．PCR產(chǎn)物經(jīng)純化、XbaⅠ酶切后，將其克隆入pPIC9K 的 SnaBⅠ和 AvrⅡ位點(diǎn)．經(jīng) PstⅠ酶切驗(yàn)證和 DNA測(cè)序，確認(rèn)重組質(zhì)粒構(gòu)建成功．由測(cè)序結(jié)果可知，所克隆的 17個(gè)基因均具有完整的開(kāi)放閱讀框(表 2)．其中，除了 en4gC、en4gD、en4gF、en3gC、eglC和eglD的序列與A．niger CBS 513.88基因組公布序列有較大差異之外，其他基因的序列與公布序列基本一致．此外，除了 en3gB和 englA不含信號(hào)肽，其他基因均含有信號(hào)肽．

表2 黑曲霉CICIM F0510內(nèi)切葡聚糖酶的基本特征Tab. 2 Basic properties of endoglucanases from A. niger CICIM F0510

將構(gòu)建獲得的重組質(zhì)粒用限制性酶線性化后，電轉(zhuǎn)化入畢赤酵母中，獲得重組菌．在50mL搖瓶中進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，這17個(gè)重組酶的酶活力測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表3.

表3 17種內(nèi)切葡聚糖酶酶活力Tab. 3 Enzyme activity of 17 endoglucanases

其中，En4gA和 En4gG的酶活力遠(yuǎn)高于其他重組酶的．以分泌表達(dá)的重組酶液為樣本，進(jìn)行相關(guān)酶學(xué)性質(zhì)的研究與分析．

2.2 黑曲霉內(nèi)切葡聚糖酶的基本酶學(xué)性質(zhì)

2.2.1 最適反應(yīng)溫度和最適反應(yīng)pH

對(duì)全部17種黑曲霉內(nèi)切葡聚糖酶進(jìn)行最適作用pH、最適作用溫度的測(cè)定，結(jié)果如圖1所示．

圖1 重組內(nèi)切葡聚糖酶的最適反應(yīng)pH和最適反應(yīng)溫度Fig. 1 pH and temperature optima of recombinant endoglucanases

來(lái)源于黑曲霉的17種內(nèi)切葡聚糖酶具有一定的差異性．除了少數(shù)重組酶的最適反應(yīng)溫度為 45℃(En4gA)和 65℃(EglC、En3gA 和 XengA)外，大部分重組酶的最適反應(yīng)溫度均為50～60℃．這17種重組酶的最適反應(yīng)pH都在酸性范圍內(nèi)(pH 3.5～6.0)，而且大部分重組酶的最適作用pH均為3.5或5.0．

溫度和pH對(duì)17種重組內(nèi)切葡聚糖酶酶活力的影響見(jiàn)表4．所有重組酶的酶活力高于80%的溫度范圍和 pH范圍分別為40～75℃、pH 2.0～8.0．其中，在65℃以上和pH 5.0～5.6范圍內(nèi)具有80%以上酶活力的重組酶有 En4gC、En4gD、En4gE、En4gF、En3gA、EglA和EnglA．

表4 溫度和pH對(duì)重組內(nèi)切葡聚糖酶酶活力的影響Tab. 4 Effects of temperature and pH on the activities of recombinant endoglucanases

2.2.2 熱穩(wěn)定性和pH穩(wěn)定性

熱穩(wěn)定性和 pH穩(wěn)定性的研究表明，這 17種內(nèi)切葡聚糖酶的殘留酶活力60%以上的熱穩(wěn)定性和pH穩(wěn)定性也存在較大的差異性(表5)．

表5 重組內(nèi)切葡聚糖酶的熱穩(wěn)定性和pH穩(wěn)定性Tab. 5 Thermo-stability and pH stability of recombinant endoglucanases

所有的重組酶內(nèi)切葡聚糖酶在 40～80℃范圍內(nèi)均具有較好的熱穩(wěn)定性．其中，En4gG、EglC和XengA的熱穩(wěn)定性最好，在 80℃孵育 1h后仍能保留 60%以上的酶活力．大部分重組酶均在中性偏酸的pH范圍內(nèi)具有較好穩(wěn)定性(25℃孵育1h，殘留酶活力大于 60%)，XengB是個(gè)例外．而且，除了En3gC和EglC，其他重組酶在65～80℃和pH 5.0～5.5內(nèi)都具有較好的穩(wěn)定性．

2.2.3 底物水解特征分析

17種內(nèi)切葡聚糖酶對(duì)不同底物的水解特征見(jiàn)表6．由表6可知：這17種內(nèi)切葡聚糖酶對(duì)CMC-Na都具有水解作用，說(shuō)明它們均具有水解 β-1，4糖苷鍵的能力．其中，En4gA和 En4gG的水解能力較強(qiáng).3gA、En3gB、En3gC、En4gA和En4gB對(duì)茯苓多糖也有水解作用，表明它們具有水解 β-1，3糖苷鍵的活性，與文獻(xiàn)報(bào)道一致[10,23]．

表6 黑曲霉內(nèi)切葡聚糖酶的底物水解特征Tab. 6 Substrate specificities of endoglucanases from A．niger

2.2.4 內(nèi)切葡聚糖酶的分類

采用Clustal X2和MEGA 4.0等生物信息學(xué)的軟件對(duì)這 17種重組酶的親緣關(guān)系進(jìn)行分析，結(jié)果如圖2所示．

圖2 進(jìn)化樹(shù)描述黑曲霉 CICIM F0510內(nèi)切葡聚糖酶的遺傳距離Fig. 2 Phylogenetic tree describing the genetic distances among endoglucanases from A.nigerCICIM F0510

有文獻(xiàn)報(bào)道且功能已經(jīng)確認(rèn)的內(nèi)切葡聚糖酶用粗體表示；線段的長(zhǎng)度表示的是MEGA 4.0計(jì)算的距離；分支節(jié)點(diǎn)上的數(shù)字代表的是bootstrap百分比．結(jié)合底物水解特征、進(jìn)化樹(shù)以及碳水化合物活性酶(CAZy)分類系統(tǒng)(http://www.cazy.org/)，可以將這17種內(nèi)切葡聚糖酶分為 4類：(1)XengA、XengB、En4gG和 En4gE是木葡聚糖特異性(xyloglucan-specific)的內(nèi)切 β-1，4-葡聚糖酶(EC 3.2.1.151)[18-19,21]，它們屬于糖苷水解酶第5家族(GH5)，而Rawat等[19]和Master等[21]認(rèn)為XengA和En4gG屬于糖苷水解酶12家族(GH12)．(2)En3gA、En3gB、En3gC[23]、En4gA 和En4gB[10]是內(nèi)切 β-1，3(4)-葡聚糖酶(EC 3.2.1.6)，可以水解葡聚糖中的 β-1，3和 β-1，4糖苷鍵，屬于糖苷水解酶16家族(GH16)．但這5種重組酶分別屬于2個(gè)不同的亞類(圖 2)，它們之間的區(qū)別還有待進(jìn)一步研究．(3)EglA、EglB、EglC、EglD 和 En4gF 只具有水解 β-1，4糖苷鍵的能力，是內(nèi)切 β-1，4葡聚糖酶(EC 3.2.1.4)，屬于糖苷水解酶第 5家族(GH5)．(4)En4gC和 EnglA屬于一類，其中 En4gC是內(nèi)切 β-1，4葡聚糖酶[27]，但它們的具體功能還有待進(jìn)一步的研究確認(rèn)．

3 討 論

本研究成功將黑曲霉CICIM F0510來(lái)源的全部17種內(nèi)切 β-葡聚糖酶基因在畢赤酵母 GS115中進(jìn)行了克隆表達(dá)，獲得的17種重組酶均對(duì)CMC-Na具有水解作用．測(cè)序的結(jié)果表明，它們的核苷酸和氨基酸序列與菌株 CBS 513.88來(lái)源的相應(yīng)序列的相似度，從完全一致到有較大差異不等(表 2)．其中，基因 en4gC、en3gC、eglC和 eglD 的氨基酸序列與NCBI上公布的序列差異很大，這可能是由于來(lái)源菌株不同造成的．由氨基酸序列比對(duì)可知，這 17種內(nèi)切葡聚糖酶之間的氨基酸序列差異性較大，序列相似度為7.49%～62.5%．其中，en4gC和en4gG的氨基酸序列相似度為7.49%，而en4gA和en4gB的氨基酸序列相似度為 62.5%．根據(jù)底物水解特征、進(jìn)化樹(shù)以及CAZy分類系統(tǒng)，重新將這17種內(nèi)切葡聚糖酶分為4類(圖 2)：(1)木葡聚糖特異性的內(nèi)切 β-1，4-葡聚糖酶(GH5，EC 3.2.1.151)；(2)非特異性的內(nèi)切 β-1，3(4)-葡聚糖酶(GH16，EC 3.2.1.6)；(3)內(nèi)切 β-1，4-葡聚糖酶(GH5，EC 3.2.1.4)；(4)En4gC和EnglA，它們的具體功能還有待進(jìn)一步確認(rèn)．

內(nèi)切葡聚糖酶是一種重要的工業(yè)酶制劑，在啤酒釀造和飼料等工業(yè)應(yīng)用廣泛．在啤酒釀造過(guò)程中，麥芽糖化的溫度和 pH 分別為 65～70℃、pH 5.0～5.6[4]．因此，啤酒釀造行業(yè)所用的內(nèi)切葡聚糖酶需同時(shí)具有良好的耐熱性和耐酸性．本研究中的 En4gC、En4gD、En4gE、En4gF、En3gA、EglA 和 EnglA 的最適反應(yīng)溫度、熱穩(wěn)定性、最適反應(yīng) pH和 pH穩(wěn)定性分別在此溫度和 pH范圍內(nèi)，可用于啤酒釀造工程．在飼料微丸包衣過(guò)程中，也需要較高的溫度(65～90℃，90s)，而且飼料的消化是在畜禽胃腸酸性環(huán)境中(pH 2.6～6.5)進(jìn)行的[28]．除了上述 7種重組酶，En3gC、EglC和 XengA 也適用于飼料顆?；^(guò)程．本研究獲得的EglA、EglB、EglC、EglD、En4gD和En4gF等內(nèi)切β-1，4-葡聚糖酶在纖維素乙醇的生產(chǎn)工藝中(50℃、pH 4.8)[29]具有潛在的應(yīng)用價(jià)值．4種木葡聚糖特異性的內(nèi)切 β-1，4-葡聚糖酶(En4gE、En4gG、XengA 和 XengB)不僅可以對(duì)植物纖維進(jìn)行改性[30]，還可以將經(jīng)過(guò)化學(xué)修飾的低聚木糖與木葡聚糖進(jìn)行連接，從而賦予纖維素微纖絲(cellulose microfibrils)新的功能[31]．此外，該酶在食品、紡織和醫(yī)藥行業(yè)也有廣泛應(yīng)用[32]．

綜上所述，本研究將黑曲霉來(lái)源的 17種內(nèi)切葡聚糖酶在畢赤酵母中進(jìn)行了克隆表達(dá)，并系統(tǒng)解析了它們生化特征的異同點(diǎn)，為同一來(lái)源的同類酶(同工酶)超家族的相關(guān)研究以及相關(guān)酶在實(shí)際應(yīng)用中協(xié)同作用的研究提供了研究基礎(chǔ)．同時(shí)，良好的生化特征使得這些內(nèi)切葡聚糖酶在麥芽糖化、飼料顆粒化、纖維素乙醇、食品、紡織以及醫(yī)藥等行業(yè)有著潛在的應(yīng)用價(jià)值．