重組大豆鐵蛋白受食源活性小分子誘導(dǎo)的還原釋放性質(zhì)

劉玉茜，楊 瑞, ，張志平，吳丹丹，唐禹馨，徐晶晶，周中凱,

(1. 食品營養(yǎng)與安全教育部重點實驗室，天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院，天津 300457；2. 天津科技大學(xué)新農(nóng)村發(fā)展研究院，天津 300457；3. 廣東環(huán)境保護工程職業(yè)學(xué)院，佛山 528216)

鐵蛋白是廣泛存在于生命體內(nèi)的一種貯鐵關(guān)鍵蛋白質(zhì)[1]．典型的鐵蛋白分子是由 24個亞基組成的中空球狀分子[2]，每兩個亞基反向平行形成一組，再由這 12組亞基對構(gòu)成一個近似正八面體，成 4-3-2重軸對稱的球狀分子[3]．一分子鐵蛋白包括 12個二重軸通道、8個三重軸通道和 6 個四重軸通道[4](圖1)．這些通道負責(zé)鐵蛋白與外界環(huán)境的物質(zhì)交換，是鐵蛋白內(nèi)部與外部離子進出鐵蛋白的必經(jīng)之路，起著溝通鐵蛋白內(nèi)部空腔與外部環(huán)境的作用[5]．

鐵蛋白的鐵還原釋放現(xiàn)象是指當(dāng)細胞需要鐵時(Fe2+濃度低)，鐵蛋白在還原劑的幫助下將儲存于鐵蛋白內(nèi)部空腔內(nèi)的Fe3+還原為Fe2+，使鐵釋放出來并轉(zhuǎn)移到鐵蛋白外部供機體利用的過程，釋放的快慢與還原劑的濃度、蛋白的種類以及溶液 pH有很大關(guān)系[6]．研究鐵蛋白的鐵還原釋放是了解鐵蛋白鐵代謝途徑及其機理的重要手段之一，同時也為了進一步闡明鐵蛋白的性質(zhì)，為開發(fā)新型天然補鐵功能產(chǎn)品提供良好的基礎(chǔ)資料．目前，對于鐵蛋白的鐵吸收途徑研究比較清楚，由于鐵蛋白的鐵釋放過程比較復(fù)雜，無法采用簡單動力學(xué)公式闡明鐵還原釋放全過程及其規(guī)律[7]，因而相關(guān)的研究進展報道并不多．

圖1 鐵蛋白殼狀結(jié)構(gòu)圖Fig. 1 Ferritin structure

本實驗中利用食源活性小分子表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)、維生素 C(VC)、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)3種還原成分，研究食品多組分分子對鐵的還原釋放的影響．其中：EGCG是從綠茶中提取出的一種抗氧化極強的多酚類物質(zhì)．VC是食品工業(yè)中非常常用的活性組分，是一種高活性物質(zhì)和抗氧化劑，能使難以吸收的三價鐵還原為易吸收的二價鐵，促進了鐵的吸收．實驗中另一種原料 NADH為還原態(tài)，具有將三價鐵還原為二價鐵的性質(zhì)[8]．這 3種成分均為還原性分子，但是其相對分子質(zhì)量大小和性質(zhì)各不相同，它們對鐵還原釋放的影響非常值得研究．

1 材料與方法

1.1 材料

重組 H-2亞基鐵蛋白(rH-2)大腸桿菌(Escherichia coli)BL21(DE3)表達菌株(菌液，實驗室保存)；胰蛋白胨、酵母抽提物，上海富雪生物科技有限公司；NaCl、NaOH，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；HCl、乙二胺四乙酸(EDTA)、NaN3，天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司；過硫酸銨，天津市北方天醫(yī)化學(xué)試劑廠；丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、十二烷基硫酸鈉(SDS)、三羥甲基氨基甲烷(Tris)、考馬斯亮藍 R-250、硫酸亞鐵(FeSO4)、金屬螯合劑菲洛嗪(Ferrozine)、表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)、維生素 C(VC)、NADH、氨卡青霉素(AMP)、異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)(分析純)、蛋白 marker(分析純)、牛血清白蛋白(BSA)(分析純)、福林酚，北京索萊寶科技有限公司；溴酚藍、四甲基乙二胺(TEMED)，上海北諾生物科技有限公司；β-巰基乙醇，美國 Amresco公司；丙烯葡聚糖凝膠 Sephacryl S-300(分析純)，江西豐臨醫(yī)用器械有限公司；硫酸銨(分析純)，天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司；其他試劑為國產(chǎn)分析純．

TGL-16A型醫(yī)用離心機，長沙平凡儀器儀表有限公司；K36616D型微量移液器，德國 Eppendorf公司；DYY-2C型電泳槽，北京市六一儀器廠；EMS-19型磁力攪拌器，天津市歐諾儀器儀表有限公司；SCIENTZ-D型超聲波細胞粉碎機，寧波新芝生物科技股份有限公司；GZX-9146MBE型電熱鼓風(fēng)干燥箱、DV-908型立式壓力蒸汽滅菌器，上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；SIM-F140AY65-PC型制冰機，松下電器產(chǎn)業(yè)株式會社；BS-100A型自動部分收集器，上海青浦滬西儀器廠；89090A型紫外分光光度計，Agilent公司．

1.2 重組H-2亞基鐵蛋白(rH-2)的制備與純化

1.2.1 rH-2的制備

rH-2的制備在 Masuda等[9]的方法上稍作修改.將含有 rH-2目的基因表達載體的大腸桿菌(E．coli)接種至含50μg/mL AMP的 LB培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)．當(dāng)細菌細胞濃度達到 A600＝0.6時，加入工作濃度為100μmol/L的IPTG誘導(dǎo)目的蛋白表達，37℃搖床培養(yǎng)12～14 h；4℃、10 278 r/min離心15 min，取沉淀.將收集得到的沉淀菌體懸浮于純凈水中，將菌體進行超聲破碎20 min，超聲時間為2 s，工作間隔為 2.5 s．超聲后菌液4℃、10000g離心15min，收集上清液于50℃水浴加熱10 min，4℃、10 278 r/min再次離心15min，取上清液．在上清液中加入 40%硫酸銨鹽析沉淀，在4℃層析柜中靜置過夜．4℃、10278r/min離心15 min，收集沉淀，將沉淀用緩沖液(20 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0，100mmol/L NaCl)進行復(fù)溶即可得到 rH-2粗蛋白．使用 Tris-HCl緩沖液(pH 7.5，20mmol/L)透析 rH-2粗蛋白，每隔 6h 換一次緩沖液，透析 3次除去硫酸銨．最后將透析后得到的蛋白溶液用0.22μm水系膜過濾．

1.2.2 rH-2的純化與表征

將粗蛋白進行凝膠柱層析，上樣前均需過0.22μm 濾膜．用含 0.15mol/L NaCl的 50mmol/L Tris-HCl緩沖液(pH 7.5)平衡Sephacryl S-300柱，待凝膠柱平衡后，取樣品上樣后再洗脫，流量為0.5mL/min，每管5mL收集樣品，并用聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測蛋白純度．蛋白純化過程均在4℃下低溫操作．最后將純化的 rH-2蛋白超濾濃縮后置于 4℃?zhèn)溆茫?/p>

參照 Laemmli[10]方法，采用 SDS-PAGE電泳測定分離純化后的rH-2的純度．其中SDS-PAGE 電泳蛋白質(zhì) marker相對分子質(zhì)量：磷酸化酶 B 9.74×104，牛血清清蛋白 6.62×104，兔肌動蛋白 4.30×104，牛碳酸酐酶 3.10×104，胰酶抑制劑 2.01×104，溶菌酶 1.44×104．凝膠為 4%～20%梯度膠，膠板大小為 80mm(W)×73mm(H)×0.75mm(T)．每孔點樣 10μL，marker 6μL．電泳在 17mA 恒流下進行，電泳完成后用考馬斯亮藍R-250進行染色．

1.2.3 rH-2鐵蛋白濃度的測定

蛋白濃度測定參照 Lowry法[11]，以牛血清蛋白(BSA)作標準曲線．

標準曲線的繪制：取6支1.5mL離心管，編號后分別加入 0、20、40、60、80、100μL 0.5mg/mL BSA，用蒸餾水補足 400μL，使每管蛋白含量分別為 0、10、20、30、40、50μg，每支離心管中加入 400μL 標準蛋白工作液，劇烈震蕩后靜置10min．繼續(xù)加入20%福林酚 200μL，立即混勻，室溫下靜置 30min．用石英比色皿測定 750nm 處吸光度 A750，以蛋白濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制標準曲線，其方程為y＝0.009x+0.0958，R2＝0.9787．

樣品測定：根據(jù)溶液蛋白濃度的高低，選擇合適的加樣量，每樣作 3個平行．用超純水補足 400μL．后續(xù)處理同上述標準曲線的繪制．根據(jù)吸光度對照標準曲線，得出比色液中蛋白質(zhì)含量．

1.3 rH-2鐵蛋白還原釋放動力學(xué)測定

菲洛嗪是一種螯合劑，當(dāng)其遇到 Fe2+時，相互結(jié)合形成螯合物[Fe(ferrozine)3]2+，這種螯合物在562nm波長處有紫外吸收，其紫外吸收強度可以間接判斷 Fe2+的釋放量[12]．反應(yīng)在 25℃下進行，以不加還原劑的體系作為空白對照．

FeSO4溶液的配制：用濃硫酸配制50mL pH 2.0的酸化水．稱取 0.0834g FeSO4溶于酸化水中，定容，配制成 50mL濃度為 6mmol/L的 FeSO4母液，搖勻后避光保存．

螯合劑溶液的配制：稱取 0.04924g菲洛嗪溶于1mL的蒸餾水中，配制成 0.1mol/L的菲洛嗪母液，搖勻后避光保存．

在 rH-2的提取過程中，從大腸桿菌生長和表達的培養(yǎng)基至蛋白的提取純化過程都沒有鐵離子的加入，所以制備出來的鐵蛋白是不含鐵的空蛋白[9]．因此，參照文獻[13]報道的方法先將純化得到的 rH-2制備成含鐵的鐵蛋白，然后再對制備的 rH-2含鐵鐵蛋白進行還原釋放動力學(xué)測定[14]．

1.3.1 EGCG對鐵蛋白還原釋放的影響

取 4支 1.5mL的離心管，分別加入 1mL濃度為 1μmol/L 的鐵蛋白溶液，再分別加入不同體積的濃度為 6mmol/L的 FeSO4溶液，使 Fe2+與鐵蛋白的終濃度比分別為 600∶1、400∶1、200∶1、100∶1，避光搖勻，靜置10min后加入濃度為0.1mol/L的菲洛嗪溶液 10μL，充分搖勻后，加入比色皿中．再加入相同體積的濃度為 1.0mmol/L的 EGCG溶液，使得EGCG 與鐵蛋白濃度比均為 220∶1，在 25℃、562nm下進行測定，觀察紫外強度隨時間的變化，每個樣本運行1800s，循環(huán)時間0.5s．

分別固定 Fe2+與鐵蛋白的濃度比為 600∶1，加入濃度為0.1 mol/L的菲洛嗪溶液10μL，充分搖勻后，加入比色皿中．再加入不同體積的濃度為1.0mmol/L的EGCG溶液，使得EGCG與鐵蛋白的終濃度比分別為 20∶1、60∶1、100∶1、140∶1、180∶1、220∶1、260∶1．在 25℃、562nm 處進行測定，觀察紫外強度隨時間的變化，每個樣本運行1800s，循環(huán)時間 0.5s．

1.3.2 VC對鐵蛋白還原釋放的影響

依照1.3.1節(jié)相同的操作方法進行實驗，觀察VC對鐵蛋白還原釋放的影響．

1.3.3 NADH對鐵蛋白還原釋放的影響

實驗操作方法同1.3.1節(jié)，觀察NADH對鐵蛋白還原釋放的影響．

2 結(jié)果與討論

2.1 rH-2的制備與表征

將純化后的蛋白通過 SDS-PAGE進行純度鑒定和亞基相對分子質(zhì)量確定，結(jié)果如圖 2所示．SDSPAGE電泳圖表明純化后的rH-2在2.8×104處呈現(xiàn)單一條帶，與文獻[15]報道相符．雖然純化后的 rH-2有少量的雜帶，但其純度符合實驗要求．

圖2 rH-2的SDS-PAGE電泳圖Fig. 2 SDS-PAGE of rH-2

2.2 EGCG誘導(dǎo)鐵蛋白還原釋放

鐵蛋白的三重軸通道具有亞鐵氧化酶活性位點，外源添加的 Fe2+在氧氣存在的情況下會被該活性位點中心氧化成 Fe3+并儲藏在鐵蛋白內(nèi)部[1,4]，該結(jié)論已被廣泛報道．在還原劑(如 VC、EGCG)的存在下，在植物鐵蛋白內(nèi)儲存在鐵蛋白內(nèi)部的 Fe3+能通過四重軸通道被還原釋放出鐵蛋白[16]．EGCG誘導(dǎo)鐵蛋白還原釋放變化曲線如圖3所示．

當(dāng)還原劑 EGCG與鐵蛋白濃度比為 220∶1時(圖 3(a))，且 Fe2+與鐵蛋白濃度比為 100∶1時，隨著時間的推移，吸光度逐漸增加，但是相同的時間范圍內(nèi)，其增加程度逐漸降低，表明 Fe2+釋放速率降低．同時，隨著 Fe2+與鐵蛋白濃度比的遞增，吸光度增加速率也呈遞增趨勢，其原因可能是 EGCG具有很強的還原性，且可以直接進入鐵蛋白內(nèi)腔，使鐵核中Fe3+還原成Fe2+并釋放出來[16]，而且隨著Fe2+與鐵蛋白濃度比的增加，在相同濃度的還原劑 EGCG存在條件下，有更多的 Fe3+被還原成 Fe2+，因此吸光度值越來越大．

當(dāng) Fe2+與鐵蛋白濃度比為 600∶1時(圖 3(b))，隨著 EGCG與鐵蛋白濃度比的增加，吸光度在相同的時間范圍內(nèi)，增加程度呈上升趨勢，表明 Fe2+釋放速率升高．其原因可能是由于 EGCG分子質(zhì)量相對較小，可以通過四重軸通道直接進入鐵蛋白內(nèi)腔[17-18]，加之具有很強的還原性，所以隨著EGCG濃度的增加，被還原釋放出的 Fe2+也增加，從而導(dǎo)致吸光度越來越大，F(xiàn)e2+釋放的速率也遞增．EGCG 誘導(dǎo)鐵蛋白還原釋放的研究表明，鐵蛋白中鐵的釋放速率同時受 Fe2+裝載量和還原劑 EGCG 濃度的影響，并且與這兩種影響因素成正比關(guān)系．

圖3 EGCG誘導(dǎo)鐵蛋白還原釋放變化曲線圖Fig. 3 EGCG induced changes in the reduction and release of ferritin

2.3 VC誘導(dǎo)鐵蛋白還原釋放

VC誘導(dǎo)鐵蛋白還原釋放變化曲線如圖 4所示．圖 4(a)表明：當(dāng)還原劑 VC與鐵蛋白濃度比為220∶1、Fe2+與鐵蛋白濃度比為 100∶1時，吸光度隨時間的增加而逐漸增加，但在相同的時間范圍內(nèi)，增加程度逐漸降低，表明 Fe2+釋放速率降低．同時，隨著Fe2+與鐵蛋白濃度比的遞增，吸光度增加速率也呈遞增趨勢．其原因可能是 VC具有很強的還原性，能進入鐵蛋白內(nèi)腔[19]，將鐵核中Fe3+還原成Fe2+并釋放出來，且在相同濃度的還原劑 VC存在條件下，隨著Fe2+濃度的增加，有更多的 Fe3+被還原成 Fe2+，從而吸光度越來越大．圖4(b)表明：當(dāng)Fe2+與鐵蛋白濃度比為 600∶1、VC與鐵蛋白濃度比為 20∶1時，隨著時間的推移，吸光度逐漸增加，但是相同的時間范圍內(nèi)，其增加程度逐漸降低，表明 Fe2+釋放速率降低．同時，隨著VC與鐵蛋白濃度比的增加，相同的時間范圍內(nèi)，其增加程度逐漸上升，表明 Fe2+釋放速率升高．其原因可能是由于 VC相對分子質(zhì)量相對較小，可以通過四重軸通道直接進入鐵蛋白內(nèi)腔，加之具有很強的還原性，所以隨著 VC濃度的增加，被還原釋放出的 Fe2+也增加，從而導(dǎo)致吸光度越來越大，F(xiàn)e2+釋放的速率也遞增[19]．因此，得出與 2.2節(jié)類似的結(jié)論，除 Fe2+裝載量外，還原劑 VC濃度也影響鐵的釋放速率，且與這種影響因素也成正比關(guān)系．

圖4 VC誘導(dǎo)鐵蛋白還原釋放變化曲線圖Fig. 4 VC induced changes in the reduction and release of ferritin

2.4 NADH誘導(dǎo)鐵蛋白還原釋放

Fe2+與鐵蛋白濃度比為600∶1時，鐵蛋白受不同濃度的NADH誘導(dǎo)還原釋放變化曲線如圖5所示．

圖5 Fe2+與鐵蛋白濃度比為 600∶1時，鐵蛋白受不同濃度的NADH誘導(dǎo)還原釋放變化曲線圖Fig. 5 Reduction and release curves of ferritin induced by different concentrations of NADH when Fe2+/ferritin＝600∶1

當(dāng) Fe2+與鐵蛋白濃度比為 600∶1、NADH 與鐵蛋白濃度比為 20∶1時，隨著時間的推移，吸光度逐漸增加，但是相同的時間范圍內(nèi)，其增加程度逐漸降低，表明 Fe2+釋放速率降低．同時，隨著 NADH與鐵蛋白濃度比的增加，相同的時間范圍內(nèi)，其增加程度逐漸上升，表明 Fe2+釋放速率升高．其可能的原因是由于 NADH具有很強的還原性，本身的分子質(zhì)量相對比較大，不能直接進入鐵蛋白內(nèi)腔，但能在鐵蛋白表面進行相互作用，從而產(chǎn)生能量振動轉(zhuǎn)移，使鐵核中 Fe3+還原成 Fe2+并釋放出來，所以隨著時間的增加，吸光度逐漸增大．隨著 NADH濃度的增加，被還原釋放出的 Fe2+也增加，從而導(dǎo)致吸光度越來越大，F(xiàn)e2+釋放的速率也遞增[19]．

2.5 VC、EGCG和NADH誘導(dǎo)鐵蛋白還原釋放的比較分析

鐵蛋白受VC、EGCG、NADH誘導(dǎo)還原釋放變化曲線對比結(jié)果如圖 6所示．當(dāng) Fe2+與鐵蛋白濃度比為 600∶1，VC、EGCG、NADH 與鐵蛋白濃度比均為220∶1時，隨著時間的增加，吸光度均逐漸增加，吸光度上升斜率逐漸降低，但是 EGCG、VC和 NADH還原釋放 Fe2+的速率并不相同．VC誘導(dǎo)的還原釋放整體吸光度上升最快，持續(xù)時間最長，NADH誘導(dǎo)的還原釋放整體吸光度上升最慢，持續(xù)時間最短．其可能原因是：由于EGCG和VC都是相對分子質(zhì)量較小并且還原性很強的活性物質(zhì)，均可以進入鐵蛋白內(nèi)腔；但不同的是，由于 EGCG 的還原性比 VC更大，所以在反應(yīng)初期，EGCG誘導(dǎo)的還原釋放速率比 VC高．但是，因為 VC的相對分子質(zhì)量比 EGCG 更小，VC比 EGCG更容易進入鐵蛋白內(nèi)腔，隨著反應(yīng)時間增加，鐵蛋白空腔內(nèi)的 VC濃度增加比 EGCG大，從而導(dǎo)致 VC誘導(dǎo)的還原釋放速率持續(xù)增加時間比EGCG長．

圖6 鐵蛋白受 VC、EGCG、NADH誘導(dǎo)還原釋放變化曲線對比圖Fig. 6 Contrast of reduction and release of ferritin induced by VC，EGCG and NADH

然而，NADH相對分子質(zhì)量相對比較大，不可以直接進入鐵蛋白內(nèi)腔，只能與鐵蛋白表面進行相互作用并結(jié)合為復(fù)合物，從而產(chǎn)生能量振動轉(zhuǎn)移，使鐵核中 Fe3+還原成 Fe2+并釋放出來．這說明 NADH 誘導(dǎo)的鐵還原釋放是通過蛋白殼上的電子傳遞鏈進行的，并推斷該電子傳遞鏈存在于四重軸通道上[19]．由于能量振動轉(zhuǎn)移過程需要時間，所以使得 Fe3+還原成Fe2+的速率相對EGCG和VC減?。?/p>

3 結(jié) 論

EGCG、VC和 NADH這 3種食源還原成分都能誘導(dǎo)重組鐵蛋白 rH-2中鐵的還原釋放．其中：隨著Fe2+與鐵蛋白濃度比的遞增，VC和 EGCG 對鐵的還原釋放呈遞增趨勢，并且 VC和 EGCG在裝載相同F(xiàn)e2+濃度的情況下，隨著還原劑濃度的升高，其誘導(dǎo)的還原釋放速率也上升，VC相對于 EGCG誘導(dǎo)的還原釋放速率更大，持續(xù)時間更長．NADH誘導(dǎo)的還原釋放整體吸光度上升速率最慢，持續(xù)時間最短．該研究對于提高鐵蛋白-食源組分相互作用的認識具有重要意義，同時也可為開發(fā)基于鐵蛋白的產(chǎn)品提供理論參考．