集約化蔬菜種植區(qū)蔬菜中喹諾酮類抗生素殘留及其健康風(fēng)險(xiǎn)

鄒慧云 趙凌 李玉波 荊楠楠 劉蕓斐 夏慧禹 李學(xué)文

摘要：利用高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（HPLC-MS）的方法檢測(cè)山東省集約化蔬菜種植區(qū)不同蔬菜中3種喹諾酮類抗生素（諾氟沙星、環(huán)丙沙星和恩諾沙星）的含量，探討蔬菜中抗生素殘留出現(xiàn)空間差異的原因，并采用每日估計(jì)攝入量（EDI）/每日允許攝入量（ADI）評(píng)價(jià)蔬菜中喹諾酮類抗生素對(duì)人體健康的風(fēng)險(xiǎn)。結(jié)果表明，該地區(qū)蔬菜中喹諾酮類抗生素的殘留較為嚴(yán)重，總含量為18～661 μg/kg，平均值為161.07 μg/kg，諾氟沙星的檢出率為100%，環(huán)丙沙星和恩諾沙星的檢出率分別為26.15%、33.85%。蔬菜中的喹諾酮類抗生素濃度出現(xiàn)空間差異性，即南部地區(qū)的蔬菜中抗生素濃度普遍高于北部地區(qū)。蔬菜種類和大棚類型是蔬菜中喹諾酮類濃度空間差異的主要影響因素；菠菜和香菜中的抗生素暴露對(duì)兒童存在潛在的健康風(fēng)險(xiǎn)，需引起種植業(yè)和養(yǎng)殖業(yè)相關(guān)部門的高度重視。

關(guān)鍵詞：蔬菜； 集約化種植；喹諾酮類； 抗生素殘留； 健康風(fēng)險(xiǎn)

中圖分類號(hào)：S859.79+6文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A文章編號(hào)：1001-4942（2018）07-0032-06

Abstract Three quinolone antibiotics （norfloxacin， ciprofloxacin and enrofloxacin） in vegetables from intensive vegetable cultivation areas of Shandong Province were determined by high performance liquid chromatography-mass spectrometry （HPLC-MS）. The reasons causing spatial difference of antibiotic residues in vegetables were analyzed and their potential risk to human health was evaluated by comparing daily estimated intake （EDI）/acceptable daily intake （ADI）. The results showed that the residues of quinolones in vegetables were very serious， and the total content was 18～661 μg/kg with the average value of 161.07 μg/kg. The detection rate of norfloxacin， ciprofloxacin and enrofloxacin were 100%， 26.15% and 33.85%， respectively. The concentration of quinolone antibiotics in vegetables showed spatial differences， and that in the southern region was generally higher than that in the northern region. Vegetable and greenhouse types were the main factors influencing the spatial differences of quinolone concentration in vegetables. Antibiotic exposure in spinach and parsley had potential health risk for children， which should attach great importance of relevant departments of the planting and breeding industry.

Keywords Vegetable； Quinolones； Antibiotic residue； Health risk

抗生素耐藥是全球關(guān)注的公共衛(wèi)生問題，抗生素濫用是造成耐藥菌在環(huán)境中傳播的主要原因之一[1]?？股爻擞糜谂R床治療，也廣泛用于動(dòng)物、農(nóng)業(yè)及食品等領(lǐng)域。中國(guó)是世界上最大的抗生素生產(chǎn)和使用國(guó)，2013年中國(guó)消耗約92 700噸抗生素，其中超過(guò)46%的抗生素用于動(dòng)物養(yǎng)殖業(yè)[2]。進(jìn)入動(dòng)物體內(nèi)的抗生素不能被完全代謝吸收，約60%～90%[3，4]以原形通過(guò)糞便和尿液排出體外進(jìn)入環(huán)境，因此，動(dòng)物糞便可殘留多種抗生素[5，6]。

有機(jī)蔬菜的生產(chǎn)需要施用有機(jī)肥，畜禽糞便常作為重要有機(jī)肥源被大量施入大棚土壤。抗生素隨畜禽糞便進(jìn)入土壤后，向下遷移滲入地下水，或被蔬菜吸收富集[7]。大量研究表明蔬菜中也存在多種抗生素[8-10]，畜禽糞肥是唯一的抗生素來(lái)源，因此糞肥施用導(dǎo)致蔬菜中抗生素殘留的種類差異及其空間差異的深層次原因值得探究。

另外，蔬菜殘留的抗生素通過(guò)食物鏈進(jìn)入人體，可能引起胃腸道菌群結(jié)構(gòu)失調(diào)和功能紊亂，也可能對(duì)人體中的微生物耐藥性進(jìn)行選擇和誘導(dǎo)，促進(jìn)耐藥菌和耐藥基因的發(fā)展和傳播[11，12]。喹諾酮類抗生素在土壤、蔬菜中檢出的含量和種類較多[13]，土壤對(duì)其吸附能力也大于磺胺類和大環(huán)內(nèi)酯類抗生素。此外，某些喹諾酮類抗生素進(jìn)入環(huán)境后，其代謝物毒性比抗生素母體更強(qiáng)，甚至轉(zhuǎn)化成抗生素原藥[14]。因此，集約化種植區(qū)蔬菜中喹諾酮類抗生素的殘留對(duì)人體的健康風(fēng)險(xiǎn)需要明確。

綜上，本研究在檢測(cè)集約化種植區(qū)不同種類蔬菜中喹諾酮類抗生素殘留情況的基礎(chǔ)上，探討蔬菜中抗生素殘留出現(xiàn)空間差異的原因，并評(píng)估蔬菜中的抗生素殘留對(duì)人體潛在的健康風(fēng)險(xiǎn)，以期為降低蔬菜中抗生素殘留提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)試劑

環(huán)丙沙星、恩諾沙星和諾氟沙星購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，純度均在98.0%以上；乙腈和甲醇（HPLC級(jí)）購(gòu)自美國(guó)Fisher公司；通過(guò)Milli-Q系統(tǒng)制備超純水；親水親脂平衡萃取柱（Oasis HLB）（200 mg，6 mL）；其他試劑均為分析純。

1.2 樣品采集

根據(jù)隨機(jī)抽樣原則，從山東省集約化蔬菜種植基地共采集65個(gè)蔬菜樣本（圖1），包括辣椒、菠菜、黃瓜、茄子、茼蒿、油菜、番茄、香菜和生菜。蔬菜種植在面積約500～1 000 m2的大棚內(nèi)，一年種植兩至三季，使用雞糞（包括鮮雞糞、稻殼雞糞、發(fā)酵雞糞）作為有機(jī)肥料。本研究采集蔬菜可食用部分于塑料袋中，保存于-4℃冰盒內(nèi)，待樣本全部收集完畢（1～3 h）后立即送到實(shí)驗(yàn)室凍干保存。

1.3 抗生素殘留分析

樣品處理：將凍干的蔬菜1.0 g均質(zhì)化后置于離心管中，加入10 mL乙腈和鹽酸萃取劑（V∶V=125∶1），超聲輔助萃取15 min，待自然冷卻后，4 000 r/min離心10 min，將萃取后的上清液置于棕色瓶中，再重復(fù)提取3次后，合并上清液于棕色瓶，之后加入20 mL正己烷，利用液-液萃取技術(shù)去除脂類物質(zhì)。連接HLB 小柱，依次用5 mL甲醇與5 mL超純水活化小柱。將除去脂類物質(zhì)的上清液以3 mL/min的速度過(guò)HLB柱后，用10 mL超純水淋洗HLB柱，洗除雜質(zhì)。將HLB小柱凍干，除去多余水分，用6 mL甲醇洗脫HLB柱，流出液收集于10 mL棕色瓶中。氮?dú)獯蹈桑瑥?fù)溶于1 mL甲醇-水溶液（V∶V=1∶1），充分振蕩1 min，過(guò)直徑為0.22 μm的有機(jī)濾膜，通過(guò)HPLC-MS方法檢測(cè)目標(biāo)抗生素諾氟沙星、環(huán)丙沙星和恩諾沙星的濃度。

檢測(cè)條件：色譜柱為XDB-C18（4.6 mm×50 mm，1.8 μm）；流動(dòng)相為0.1%甲酸溶液和乙腈；柱溫為20℃；進(jìn)樣量10 μL。離子源為電噴霧電離（ESI）；掃描方式為正離子掃描；監(jiān)測(cè)模式為多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式（MRM）；毛細(xì)管電脈壓為3 000 V；霧化器壓力為30 206.85 kPa；干燥氣體為氮?dú)?；干燥氣體的流量和溫度為10 L/min和350℃。

1.4 蔬菜消耗導(dǎo)致的健康風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估

蔬菜消耗導(dǎo)致的健康風(fēng)險(xiǎn)是根據(jù)EDI與ADI的比值來(lái)計(jì)算的，ADI是指人或動(dòng)物每日攝入某種化學(xué)物質(zhì)對(duì)健康無(wú)任何已知不良效應(yīng)的劑量；EDI是指從蔬菜消耗中每人（包括成人和兒童）的抗生素估計(jì)攝入量，其計(jì)算公式具體如下：

式中：Cfood代表某種抗生素在蔬菜中的平均濃度（干重），ng/g；IRveg代表中國(guó)成年人每人每天3.45杯的蔬菜，兒童每人每天2.86杯的蔬菜[8，15]；βg/cup表示一杯新鮮蔬菜的質(zhì)量，將蔬菜的可食部分切成體積≤0.5 cm3的顆粒后置于杯中，待填滿后稱取蔬菜的重量（濕重），g；βww/dw代表美國(guó)環(huán)保局在開發(fā)土壤篩選值時(shí)使用的植物組織平均干濕轉(zhuǎn)換因子（0.085）[8]；BW是指兒童或成人的體重，kg。

通過(guò)EDI與ADI的比值（即危害值）評(píng)估由蔬菜消耗而導(dǎo)致的抗生素暴露對(duì)人體的潛在健康風(fēng)險(xiǎn)[16，17]。當(dāng)EDI/ADI>0.1時(shí)，可認(rèn)為因蔬菜消耗而導(dǎo)致的抗生素暴露對(duì)人體健康存在潛在風(fēng)險(xiǎn)。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

利用IBM SPSS 23.0軟件對(duì)抗生素殘留相關(guān)的可疑因素進(jìn)行描述性分析，通過(guò)K-S檢驗(yàn)來(lái)獲知樣本的分布進(jìn)而探討蔬菜中抗生素含量空間差異的影響因素分析，利用克里金插值法通過(guò)ArcGIS軟件對(duì)蔬菜中喹諾酮類抗生素含量的空間分布進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 喹諾酮類抗生素的檢出情況

表1表明，諾氟沙星的檢出率為100%，含量均值為147.09 μg/kg；恩諾沙星和環(huán)丙沙星含量的均值分別為8.11、5.87 μg/kg，檢出率分別為33.85%和26.15%。從蔬菜種類來(lái)看，菠菜、香菜、辣椒和茄子中諾氟沙星含量較高，其均值分別為410.76、368.66、210.51、204.67 μg/kg；香菜中檢出的環(huán)丙沙星和恩諾沙星含量最高，分別為38.41 μg/kg和35.93 μg/kg，而生菜中未檢測(cè)到環(huán)丙沙星和恩諾沙星，油菜中未檢測(cè)到環(huán)丙沙星（低于檢出限）。另外，環(huán)丙沙星和恩諾沙星的變異系數(shù)分別為1.89、1.48，表明不同種類的蔬菜中環(huán)丙沙星和恩諾沙星含量差別較大。

2.2 喹諾酮類抗生素的空間分布

蔬菜中喹諾酮類抗生素總量表現(xiàn)出一定程度的空間差異性，即喹諾酮類抗生素在南部地區(qū)的濃度要高于北部地區(qū)，且大于150 μg/kg。諾氟沙星與喹諾酮類抗生素總量的空間分布趨勢(shì)基本一致，表現(xiàn)為在南部地區(qū)蔬菜中檢出的濃度最高，在西北地區(qū)濃度最低（< 100 μg/kg）。環(huán)丙沙星和恩諾沙星在蔬菜中的濃度遠(yuǎn)低于諾氟沙星，兩者均在東南方向較高（圖2）。

2.3 喹諾酮類抗生素濃度空間差異的影響因素分析

將喹諾酮類抗生素濃度作為研究的結(jié)局變量，經(jīng)過(guò)K-S正態(tài)性檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)喹諾酮類抗生素濃度分布為非正態(tài)分布，將蔬菜中抗生素殘留的可疑因素，包括雞糞類型（鮮雞糞/干雞糞/混合雞糞）、雞糞單位用量、蔬菜大棚面積、蔬菜大棚類型（日光/拱棚）和蔬菜種類等，依次進(jìn)行Kruskal-Wallis檢驗(yàn)，其統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，不同種類的蔬菜以及不同類型的蔬菜大棚中喹諾酮類抗生素濃度差異顯著（P<0.05），即蔬菜種類和大棚類型是蔬菜中喹諾酮類抗生素濃度空間差異的影響因素，其中菠菜、香菜、茄子和辣椒中喹諾酮類抗生素的含量較高，生菜與番茄含量較低；使用拱棚種植蔬菜的喹諾酮類抗生素濃度比日光溫室中高。

2.4 蔬菜消耗導(dǎo)致的健康風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估

表2所示，當(dāng)消耗同種類的蔬菜時(shí)，兒童暴露于某種抗生素導(dǎo)致的健康風(fēng)險(xiǎn)約是成人的3倍；當(dāng)消耗不同種類的蔬菜時(shí)，人群暴露于某種抗生素所導(dǎo)致的健康風(fēng)險(xiǎn)不同。另外，消耗同種蔬菜時(shí)，由諾氟沙星暴露所導(dǎo)致的健康風(fēng)險(xiǎn)是環(huán)丙沙星和恩諾沙星的10倍之多，菠菜和香菜中諾氟沙星的殘留對(duì)兒童可能造成健康風(fēng)險(xiǎn)（EDI/ADI>0.1）；蔬菜中環(huán)丙沙星和恩諾沙星的殘留對(duì)人群無(wú)健康風(fēng)險(xiǎn)（EDI/ADI<0.1）。

3 討論

本研究蔬菜中喹諾酮類抗生素殘留較嚴(yán)重，高于在上海市崇明島養(yǎng)殖場(chǎng)周邊蔬菜中檢出的量（總含量<110 μg/kg，平均值為21.9 μg/kg）[18]。本研究中諾氟沙星的檢出率為100%，平均含量為147.09 μg/kg，高于東莞市蔬菜基地的蔬菜中諾氟沙星檢出情況（檢出率為80%，平均含量為19.85 μg/kg），但環(huán)丙沙星和恩諾沙星的檢出情況均低于東莞基地蔬菜中的檢出情況[19]。不同地區(qū)蔬菜中喹諾酮類含量與糞肥類型、灌溉條件、施肥量、施肥頻率和產(chǎn)地環(huán)境質(zhì)量等有關(guān)，陳志宇等[20]發(fā)現(xiàn)雞糞中抗生素含量高于豬糞和牛糞，趙晶等[18]發(fā)現(xiàn)豬糞、雞糞中的喹諾酮含量高于牛糞；此外，灌溉水對(duì)蔬菜中喹諾酮類抗生素的含量影響也較大，本研究的蔬菜種植區(qū)主要以井水灌溉，區(qū)別于其他蔬菜種植區(qū)的養(yǎng)殖廢水、水庫(kù)水和河流水等。

不同種類蔬菜中喹諾酮類抗生素含量存在顯著差異（P<0.05）。菠菜、香菜、辣椒、茄子中諾氟沙星的平均含量均大于200 μg/kg，分別為410.76、368.66、210.51、 204.67 μg/kg，茼蒿、油菜和黃瓜中的平均含量在100～200 μg/kg之間，而番茄和生菜中的平均含量均小于100 μg/kg。不同種類蔬菜中抗生素含量差異可能由諸多因素造成，Li等[21]研究發(fā)現(xiàn)不同類型蔬菜的抗生素富集系數(shù)不同，茄果類蔬菜抗生素富集系數(shù)大于葉菜類，從而導(dǎo)致茄果類抗生素含量高于葉菜類，這與本研究結(jié)果基本一致。另外，蔬菜對(duì)抗生素的積累能力，主要取決于蔬菜生長(zhǎng)期、土壤性質(zhì)和土壤肥力等因素。

近期，一項(xiàng)監(jiān)測(cè)江浙滬地區(qū)1 000名兒童的抗生素暴露研究發(fā)現(xiàn)，至少有58%的兒童尿液能檢出1種抗生素，甚至有的尿樣可檢出6 種抗生素。兒童體內(nèi)的獸用抗生素來(lái)源除了水、牛奶、食用肉等[22]，蔬菜也是來(lái)源之一。通過(guò)對(duì)不同種類的蔬菜進(jìn)行健康風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估發(fā)現(xiàn)，菠菜和香菜對(duì)兒童可能造成健康風(fēng)險(xiǎn)。兒童早期暴露抗生素可能導(dǎo)致體重增加，誘發(fā)濕疹、哮喘等[23]。另外，嬰幼兒和低齡兒童暴露于抗生素環(huán)境誘導(dǎo)的耐藥菌風(fēng)險(xiǎn)顯著高于一般人群。

如何降低蔬菜中抗生素的殘留是當(dāng)前食品安全領(lǐng)域面臨的重要挑戰(zhàn)。需要從源頭進(jìn)行控制，一方面，養(yǎng)殖業(yè)需合理使用抗生素，以減少畜禽糞便中的抗生素殘留；另一方面，種植業(yè)需合理施用畜禽糞肥，減少畜禽糞肥施用量，且盡量施用發(fā)酵過(guò)的糞肥，以減少抗生素殘留對(duì)溫室土壤的污染。

4 結(jié)論

山東省集約化蔬菜種植區(qū)蔬菜中殘留的喹諾酮類抗生素以諾氟沙星為主，其殘留的平均含量是環(huán)丙沙星的18倍，恩諾沙星的24倍，且不同種植區(qū)的蔬菜及同一種植區(qū)不同種類的蔬菜中喹諾酮類含量存在差異；蔬菜中的喹諾酮類抗生素濃度表現(xiàn)出一定程度的空間差異性，蔬菜種類和大棚類型是空間差異產(chǎn)生的主要原因。菠菜、香菜中諾氟沙星的殘留可能對(duì)兒童造成健康風(fēng)險(xiǎn)，需引起相關(guān)部門的高度重視。

參 考 文 獻(xiàn)：

[1] Kummerer K. Significance of antibiotics in the environment[J]. J. Antimicrob. Chemother.， 2003， 52（1）： 5-7.

[2] Zhu Y G， Johnson T A， Su J Q， et al. Diverse and abundant antibiotic resistance genes in Chinese swine farms[J]. Proc. Natl. Acad. Sci. USA， 2013， 110（9）： 3435-3440.

[3] Thiele-Bruhn S. Pharmaceutical antibiotic compouds in soils—a review[J]. Journal of Plant Nutrition & Soil Science， 2003， 166（4）：546.

[4] Leal R M P， Figueira R F， Tornisielo V L， et al. Occurrence and sorption of fluoroquinolones in poultry litters and soils from Sao Paulo State， Brazil[J]. Sci. Total Environ.， 2012， 432（16）： 344-349.

[5] Zhang Z J， Shen J G， Wang H， et al. Attenuation of veterinary antibiotics in full-scale vermicomposting of swine manure via the housefly larvae （Musca domestica）[J]. Sci. Rep.， 2014， 4： 6844.

[6] Leclercq S O， Wang C， Zhu Y， et al. Diversity of the tetracycline mobilome within a Chinese pig manure sample[J]. Appl. Environ. Microbiol.， 2016， 82（21）： 6454-6462.

[7] Kuchta S L， Cessna A J. Lincomycin and spectinomycin concentrations in liquid swine manure and their persistence during simulated manure storage[J]. Arch. Environ. Contam. & Toxicol.， 2009， 57（1）： 1-10.

[8] Hanna N， Sun P， Sun Q， et al. Presence of antibiotic residues in various environmental compartments of Shandong province in eastern China： its potential for resistance development and ecological and human risk[J]. Environ. Int.， 2018，114：131-142.

[9] Jin C X， Si X W， Wang Z Y， et al. Distribution and risk assessment of sulfonamides antibiotics in soil and vegetables from feedlot livestock[J]. Environ.Sci.，2016，37（4）：1562-1567.

[10]鮑陳燕， 顧國(guó)平， 徐秋桐， 等. 施肥方式對(duì)蔬菜地土壤中8種抗生素殘留的影響[J]. 農(nóng)業(yè)資源與環(huán)境學(xué)報(bào)， 2014， 31（4）： 313-318.

[11]Martinez J L. The role of natural environments in the evolution of resistance traits in pathogenic bacteria[J]. Proc. Biol. Sci.， 2009， 276（1667）： 2521-2530.

[12]Lundborg C S， Tamhankar A J. Antibiotic residues in the environment of South East Asia[J]. BMJ， 2017， 358（s1）： j2440.

[13]邰義萍， 莫測(cè)輝， 李彥文， 等. 長(zhǎng)期施用糞肥土壤中喹諾酮類抗生素的含量與分布特征[J]. 中國(guó)環(huán)境科學(xué)， 2010， 30（6）： 816-821.

[14]任紅蕾，張蓬，李凱，等. 水中氟喹諾酮類抗生素光降解過(guò)程中抑菌活性的變化[J]. 環(huán)境化學(xué)， 2014，33 （5）： 753-759.

[15]翟鳳英， 何宇納， 馬冠生， 等. 中國(guó)城鄉(xiāng)居民食物消費(fèi)現(xiàn)狀及變化趨勢(shì)[J]. 中華流行病學(xué)雜志，2005，26（7）：485-488.

[16]Global Environment Monitoring System-Food Contamination Monitoring and Assessment Programme（GMES/Food），Codex Committee on Pesticide Residue. Guidelines for predicting dietary intake of pesticide residues[Z]. WHO/FSF/FOS.

[17]Alternative Strategies and Regulatory Affairs Division，Pest Ma-nagement Regulatory Agency. Assessing exposure from pesticides in food—a users guide[S]. Canada： Health Canada， 2003.

[18]趙晶， 畢春娟， 陳振樓， 等. 上海市崇明島養(yǎng)殖場(chǎng)周邊環(huán)境中氟喹諾酮類抗生素的含量特征[J]. 生態(tài)與農(nóng)村環(huán)境學(xué)報(bào)， 2017， 33（2）： 120-126.

[19]吳小蓮， 莫測(cè)輝， 嚴(yán)青云， 等. 東莞市蔬菜基地蔬菜中喹諾酮類抗生素污染特征及健康風(fēng)險(xiǎn)[J]. 中國(guó)環(huán)境科學(xué)， 2013， 33（5）： 910-916.

[20]陳志宇， 蘇繼影， 欒冬梅. 畜禽糞便堆肥技術(shù)研究進(jìn)展[J]. 當(dāng)代畜牧， 2004 （10）： 41-43.

[21]Li X W， Xie Y F， Li C L， et al. Investigation of residual fluoroquinolones in a soil-vegetable system in an intensive vegetable cultivation area in Northern China[J]. Sci. Total Environ.， 2014， 468/469： 258-264.

[22]Li N， Ho K W K， Ying G G， et al. Veterinary antibiotics in food， drinking water， and the urine of preschool children in Hong Kong[J]. Environ. Int.， 2017， 108： 246-252.

[23]Poulsen M N， Pollak J， Bailey-Davis L， et al. Associations of prenatal and childhood antibiotic use with child body mass index at age 3 years[J]. Obesity （Silver Spring）， 2017， 25（2）： 438-444.