朱見深 王進文 張慶 駱延波 李璐璐 胡明 宋新慧 戴美學(xué) 齊靜 劉玉慶
摘要:獸用抗生素的廣泛使用引起腸道細菌嚴(yán)重的抗藥性和菌群生態(tài)紊亂,并可能導(dǎo)致抗藥性人畜共患病原菌的傳播,給公共衛(wèi)生帶來嚴(yán)峻挑戰(zhàn),因此通過糞菌移植從動物源頭降低腸道菌群的抗藥性勢在必行。本試驗首先通過16S rDNA高通量測序技術(shù)比較糞菌移植供體SPF蛋雞及普通商品肉雞的糞便菌群,然后經(jīng)泄殖腔滴注方式接種1日齡SPF雛雞,于7日齡和35日齡測定移植后受體糞便菌群的微生物組,用瓊脂稀釋法測定移植前后腸道指示菌株大腸桿菌的抗藥性水平。結(jié)果表明,商品肉雞糞便菌群擁有更高的多樣性,而SPF蛋雞糞便菌群組成更為均一。除了共同擁有較多的厚壁菌門細菌,商品肉雞還含有較多的擬桿菌門細菌而SPF蛋雞則含有較多的變形菌門細菌。在屬水平上,商品肉雞的優(yōu)勢菌屬是糞棲桿菌屬、擬桿菌屬和別樣桿菌屬,而SPF蛋雞的優(yōu)勢菌屬為腸球菌屬、埃希-志賀菌屬以及克雷伯氏桿菌屬。藥敏試驗結(jié)果表明,SPF蛋雞擁有對抗生素極為敏感的菌群,商品肉雞擁有較高的抗生素抗藥性菌群。將兩組糞便菌群移植給新生雛雞后,抗藥性水平得到傳遞。該結(jié)果說明通過SPF雞糞菌移植雛雞,能安全地從源頭降低腸道菌群抗藥性,抵抗家禽養(yǎng)殖環(huán)境中高抗藥性病原菌的侵害,為遏制動物源細菌抗藥性提供一種新的解決方法。
關(guān)鍵詞:抗藥性;SPF雞;糞菌移植;16S rDNA高通量測序;腸道菌群
中圖分類號:S852.6文獻標(biāo)識號:A文章編號:1001-4942(2018)07-0006-07
Abstract The widespread use of veterinary antibiotics causes serious bacterial resistance and gut bacterial ecological disturbance, as well as the spread of antibiotic-resistant zoonotic pathogens, which posing a serious challenge to public health. Therefore, it is imperatived to reduce the gut bacterial resistance from the source of animals through fecal micorbiota transplantation (FMT). Firstly, the 16S rDNA high-throughput sequencing technology was used to analyze the fecal microbiota of SPF laying hens and ordinary commercial broilers to select appropriate donor. Then one-day-old SPF chicks were inoculated by cloaca inoculation, and analysis of fecal microbiota was conducted at the 7-and 35-day-age respectively after transplantation. Furthermore, the agar dilution method was used to determine the level of antibiotic resistance of the intestinal indicator strain E. coli before and post transplantation. The results showed that the fecal microbiota of commercial broilers had higher alpha diversity, while that of SPF laying hens was more uniform. In addition to sharing the same Firmicutes in common, commercial broilers had more Bacteroidetes and SPF laying hens had more Proteobacteria. At the genus level, the dominant genus of commercial broilers were Faecalibacterium, Bacteroides and Alistipes, while SPF laying hens were Enterococcus, Eich-Shigella and Klebsiella. The results of antimicrobial susceptibility testing showed that E. coli strains of SPF laying hens were very sensitive to testing antibiotics, while commercial broilers had a higher antibiotic-resistant flora. After the two groups of fecal microbiota were transplanted into newborn chicks, the level of antibiotic resistance was transferred. These results suggested that FMT from SPF chickens to chicks could safely reduce the intestinal bacterial resistance from source and resist the invading of the high-resistant pathogenic bacteria in the poultry breeding environments, which providing a new solution to repress the bacterial resistance of animals.
Keywords Antimicrobial resistance; SPF chicken; Fecal microbiota transplantation;16S rDNA high-throughput sequencing; Intestinal flora
抗生素是一把四刃劍[1],其不合理使用加速了抗藥菌和抗藥基因的產(chǎn)生及其在環(huán)境中的傳播,導(dǎo)致很多抗生素失效,使一些感染無法治愈,成為全球公共衛(wèi)生的一大威脅[2,3];另外,青霉素類、喹諾酮類、氨基糖苷類及碳青霉烯類抗生素都是廣譜抗生素,在使用這些抗生素時難免“波及無辜”,破壞宿主正常的共生微生物群[4],而共生微生物群與宿主的健康息息相關(guān),菌群紊亂會導(dǎo)致許多疾病[5]。使用抗生素(如鏈霉素)會促使宿主細胞及菌群代謝改變,而其代謝產(chǎn)物會促進一些病原菌(鼠傷寒沙門氏菌、大腸桿菌、艱難梭菌)的生長[6,7]。因此,減少抗生素使用勢在必行。
為解決抗藥性問題及減少抗生素的使用,目前發(fā)展出許多應(yīng)對策略,包括研發(fā)新的抗菌藥物、應(yīng)用噬菌體療法及利用益生菌等[8-10]。隨著菌群研究的成熟,通過調(diào)節(jié)菌群進行病原菌感染治療及清除抗藥菌成為一種新穎、有效的策略[11]。
糞菌移植(fecal microbiota transplantation,F(xiàn)MT)是一種重塑腸道菌群的方法,是治療腸道菌群紊亂導(dǎo)致疾病的重要手段[12]。目前FMT應(yīng)用于人類治療艱難梭菌感染(CDI)取得了巨大成功[13]。但是關(guān)于動物養(yǎng)殖中的FMT相對落后,在豬上FMT僅有數(shù)篇文獻可查,這些文獻多研究如何改善豬的腸道健康及提高生長效果[14,15]。在雞上FMT的研究更少之又少,基于此,本研究嘗試?yán)眉S菌移植手段降低商品肉雞存在的高抗藥性問題,以期為降低細菌高抗藥性現(xiàn)狀提供一種新的解決途徑。
1 材料與方法
1.1 糞菌移植供體菌群的制備
分別選擇商品肉雞和SPF蛋雞作為菌群供體進行糞菌移植研究,其中商品肉雞來源于山東泰安某肉雞屠宰場,42日齡(標(biāo)記為Broiler),SPF蛋雞來源于山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院家禽研究所SPF雞場,200日齡(標(biāo)記為SPF)。無菌采集二者的新鮮盲腸內(nèi)容物,在生物安全柜內(nèi)稱取10 g盲腸內(nèi)容物置于無菌燒杯內(nèi),加入無菌PBS緩沖液,配制成100 mL懸液,攪拌使懸液均一。將均一懸液轉(zhuǎn)移至2個50 mL無菌離心管,1 800 r/min離心10 min使懸液中的大顆粒沉降。將離心后的懸液用經(jīng)過滅菌的三層濾布(紗布、80目濾布、150目濾布)分別進行過濾,最后獲得均一、棕色的接種液。
1.2 糞菌移植受體雛雞的選擇、分組及接種方式
受體SPF雛雞來源于山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院家禽研究所SPF雞場,1日齡,隨機分為3組,每組20只,分別為商品肉雞菌群接種組(標(biāo)記為R_B),SPF雞菌群接種組(標(biāo)記為R_S)及PBS接種對照組(標(biāo)記為Con)。分別吸取50 μL不同組別的新鮮接種液,對1日齡雛雞進行泄殖腔滴注。每組分籠飼養(yǎng)至35日齡,自由采食和飲水,溫度設(shè)置為第1 d 36℃,以后每7 d降低2℃,直至35日齡。
1.3 糞菌移植前后腸道菌群的16S rDNA高通量測序及分析
1.3.1 DNA 提取和PCR擴增 根據(jù)E.Z.N.A. Soil試劑盒(Omega Bio-Tek, Norcross, GA, USA)說明書進行供體和受體糞樣總DNA抽提,DNA濃度和純度利用NanoDrop 2000進行檢測,利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA提取質(zhì)量;用338F (5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′)和806R (5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′) 引物對V3-V4可變區(qū)進行PCR擴增,擴增程序為:95℃預(yù)變性3 min;95℃變性30 s,55℃退火30 s,72℃延伸30 s,共27個循環(huán);最后72℃延伸10 min(PCR儀:ABI GeneAmp 9700型)。擴增體系為20 μL:5×FastPfu緩沖液4 μL,2.5 mmol/L dNTPs 2 μL,引物(5 μmol/L)各0.8 μL,F(xiàn)astPfu聚合酶0.4 μL,DNA模板0.2 μL,補ddH2O至20 μL。
1.3.2 Illumina Miseq測序 使用2%瓊脂糖凝膠回收PCR產(chǎn)物,利用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit (Axygen Biosciences, Union City, CA, USA)進行純化,Tris-HCl洗脫,2%瓊脂糖電泳檢測。利用QuantiFluorTM-ST(Promega, USA) 進行檢測定量。根據(jù)Illumina MiSeq 平臺(Illumina, San Diego, USA)PE300標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程將純化后的擴增片段構(gòu)建文庫。構(gòu)建文庫步驟:連接“Y”字形接頭;使用磁珠篩選去除接頭自連片段;利用PCR擴增進行文庫模板的富集;氫氧化鈉變性, 產(chǎn)生單鏈DNA片段。利用Illumina公司的Miseq PE300平臺進行測序(上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司)。
1.3.3 數(shù)據(jù)處理 原始測序序列使用Trimmomatic軟件質(zhì)控,使用FLASH軟件進行拼接:設(shè)置50 bp的窗口,如果窗口內(nèi)的平均質(zhì)量值低于20,從窗口開始截去后端堿基,去除質(zhì)控后長度低于50 bp的序列;barcode需精確匹配,引物允許2個堿基的錯配,去除模糊堿基;根據(jù)重疊堿基(overlap)將兩端序列進行拼接,overlap需大于10 bp,并去除無法拼接的序列。使用UPARSE軟件(version 7.1,http://drive5.com/uparse/),根據(jù)97%的相似度對序列進行操作分類單元(operational taxonomic unit,OTU)聚類;使用UCHIME軟件剔除嵌合體。利用RDP classifier (http://rdp.cme.msu.edu/) 對每條序列進行物種分類注釋,比對Silva數(shù)據(jù)庫(SSU123),設(shè)置比對閾值為70%。
1.4 糞菌移植前后腸道優(yōu)勢菌株大腸桿菌的鑒定及藥敏試驗
糞菌移植前,將供體菌群,即商品肉雞和SPF雞的糞便菌群分別劃線麥康凱培養(yǎng)基選擇性篩選大腸桿菌,然后用質(zhì)譜法進行鑒定。糞菌移植后,35 d的飼養(yǎng)時間內(nèi)每隔1 d每組隨機收集3個受體SPF雛雞的新鮮糞樣,用同樣的方法進行大腸桿菌的分離鑒定。
將質(zhì)譜鑒定獲得的供體和受體菌群中的優(yōu)勢大腸桿菌菌株,利用瓊脂稀釋法進行藥敏試驗。選擇的藥物為氨芐西林、氟苯尼考、新霉素、多西環(huán)素、頭孢噻呋、阿莫西林-克拉維酸、慶大霉素和多黏菌素8種。根據(jù)美國臨床和實驗室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(CLSI)的標(biāo)準(zhǔn)進行結(jié)果判定,統(tǒng)計抗藥率及最小抑菌濃度(minimum inhibitory concentration,MIC)頻率分布[16]。
2 結(jié)果與分析
2.1 糞菌移植供體菌群多樣性分析
通過OTU聚類分析發(fā)現(xiàn),商品肉雞(Broiler)糞便菌群含有378個OTU,SPF蛋雞(SPF)含有127個OTU,兩組共同含有92個OTU,而特有的OTU,SPF蛋雞糞便菌群僅含35個,低于商品肉雞的286個(圖1A)。從α多樣性指數(shù)(Chao指數(shù))比較可以發(fā)現(xiàn)商品肉雞糞便菌群組成的豐富度及多樣性較SPF蛋雞糞便菌群都高(Welchs t檢驗,P<0.05),SPF蛋雞糞便菌群組成更為均一(圖1B)。考慮到兩組雞糞便菌群α多樣性水平不同,β多樣性或許存在差異,我們基于OTUs繼續(xù)分析,以Weighted UniFrac算法對菌群組成進行進化距離聚類分析,發(fā)現(xiàn)SPF的3個重復(fù)樣本距離近,作為一組,而Broiler的3個重復(fù)樣本為另一組(圖1C)。同樣的,在基于OTUs以Bray-Curtis算法計算的主坐標(biāo)分析(PCoA,principal coordinates analysis)中,兩組樣本也分散開(圖1D)。
2.2 糞菌移植供體菌群結(jié)構(gòu)組成差異比較
通過進化關(guān)系及PCoA分析發(fā)現(xiàn)兩組雞糞便菌群不同,于是進一步統(tǒng)計兩組雞糞便菌群分類學(xué)組成的不同。結(jié)果在分類學(xué)門(Phylum)水平上,SPF蛋雞(SPF)主要由厚壁菌門(Firmicutes,59.91%)、變形菌門(Proteobacteria,39.59%)組成;而商品肉雞(Broiler)的優(yōu)勢菌門也是厚壁菌門(68.31%),而第二優(yōu)勢菌門卻為擬桿菌門(Bacteroidetes,25.84%),還含有少量的變形菌門(2.60%),而且兩組糞便菌群在變形菌門和擬桿菌門組成結(jié)構(gòu)上存在顯著差異,而在厚壁菌門上差異不顯著。在屬水平上,SPF蛋雞糞便菌群主要由腸球菌屬(Enterococcus,42.56%)、埃希-志賀菌屬(Escherichia-Shigella,31.75%)和克雷伯氏桿菌屬(Klebsiella,7.02%)組成,而商品肉雞糞便菌群主要由糞棲桿菌屬(Faecalibacterium,13.26%)、別樣桿菌屬(Alistipes,12.51%)和擬桿菌屬(Bacteroides,12.17%)組成,而且這些菌屬在兩組中的相對豐度都存在顯著差異(表1)。
2.3 糞菌移植供體菌群優(yōu)勢菌株大腸桿菌的抗藥性水平分析
經(jīng)過麥康凱培養(yǎng)基選擇性分離培養(yǎng)和質(zhì)譜鑒定,商品肉雞和SPF蛋雞分別獲得19株和25株大腸桿菌。利用瓊脂稀釋法對這44株大腸桿菌的抗藥率與MIC頻率分布進行了統(tǒng)計,結(jié)果表明商品肉雞組對選定的7種抗生素的抗藥率均高于SPF蛋雞組,SPF蛋雞組對頭孢噻呋、阿莫西林-克拉維酸兩種抗生素存在低水平抗藥菌株,對其他抗生素皆敏感(圖2A);從整體上看,Broiler組中大腸桿菌MIC分布集中于數(shù)值較大范圍,而SPF組相對集中于數(shù)值較小范圍(圖2B),進一步說明SPF組抗藥性水平較低,而Broiler組抗藥性水平較高。
2.4 糞菌移植對受體雛雞腸道菌群微生物組的影響
選擇7日齡和35日齡受體雛雞的糞便進行菌群組成分析,結(jié)果表明糞菌移植對受體雛雞微生物組的影響程度小于受體雛雞日齡增長帶來影響。經(jīng)單因素方差分析(one-way ANOVA)發(fā)現(xiàn),在分類學(xué)門水平上,厚壁菌門和變形菌門在6個小組中存在顯著差異(圖3B)。而在分類學(xué)屬水平上,受體雛雞的優(yōu)勢菌為乳酸桿菌屬(Lactobacillus)和埃希-志賀菌屬,且乳酸菌屬、埃希-志賀菌屬以及腸球菌屬在6個小組中存在極顯著差異(圖3A)。
2.5 糞菌移植對雛雞腸道優(yōu)勢菌株大腸桿菌抗藥性的影響
將具有不同抗藥性水平的糞便菌群移植給受體雛雞,并在移植后35日內(nèi),對雛雞每隔1 d采集一次新鮮糞便,分離優(yōu)勢菌株大腸桿菌,并經(jīng)質(zhì)譜鑒定,將各組鑒定后的大腸桿菌(肉雞組46株,SPF組41株,對照組40株),經(jīng)藥敏試驗分析得知,接種SPF雞糞便菌群的雛雞組(R_S)糞菌中的大腸桿菌對所測試的8種藥物的抗藥性水平明顯低于接種商品肉雞的受體雛雞組(R_B),甚至低于對照組(Con)(圖4)。同時還發(fā)現(xiàn)供體抗藥性水平較高時,接種后抗藥性水平也較高。該結(jié)果說明糞菌移植可將供體糞便大腸桿菌抗藥性水平傳遞給受體雛雞,達到降低細菌抗藥性的目的。
3 討論與結(jié)論
本研究首先通過16S rDNA高通量測序技術(shù)分析了在密閉環(huán)境中養(yǎng)殖的SPF蛋雞與在開放環(huán)境中養(yǎng)殖的普通商品肉雞的糞便菌群組成,并比較了二者糞便中大腸桿菌對抗生素的抗藥性水平,結(jié)果顯示兩種供體的菌群組成存在很大差異,普通商品肉雞的腸道菌群多樣性優(yōu)于SPF蛋雞,而SPF蛋雞糞便菌群組成更為均一。很多文獻介紹散養(yǎng)或放養(yǎng)的雞腸道菌群多樣性相比于籠養(yǎng)的更加豐富,這表明與外界環(huán)境的接觸對雞腸道菌群的發(fā)展起到一定作用[17,18]。除了共同擁有較多的厚壁菌門細菌,商品肉雞含有更多的擬桿菌門細菌,而SPF蛋雞含有更多變形菌門細菌。商品肉雞的優(yōu)勢菌屬是糞棲桿菌屬、擬桿菌屬,SPF蛋雞的優(yōu)勢菌屬為腸球菌屬、埃希-志賀菌屬以及克雷伯氏桿菌屬,而我們先前的研究結(jié)果(數(shù)據(jù)未展現(xiàn))發(fā)現(xiàn)SPF蛋雞的優(yōu)勢菌屬為乳桿菌屬,這可能是個體差異導(dǎo)致的菌群差異。由于SPF雞無特定病原,飼養(yǎng)環(huán)境嚴(yán)格無菌而且不使用抗生素,因此SPF雞腸道內(nèi)棲息的菌群對抗生素敏感,而商品肉雞養(yǎng)殖場環(huán)境中的細菌多具有高抗藥水平,因此其腸道內(nèi)定殖的菌多為高抗菌。同時試驗結(jié)果表明,SPF蛋雞糞便中大腸桿菌對多種抗生素的抗藥性水平明顯低于普通商品肉雞。因此根據(jù)抗藥性水平篩選確定SPF雞糞便菌群可以作為糞菌移植的優(yōu)良供體。
我們將SPF蛋雞和商品肉雞的糞便菌群移植給1日齡腸道幾乎無菌的SPF雛雞,飼養(yǎng)至35日齡,觀察糞菌移植對受體雛雞腸道微生物組成及大腸桿菌抗藥性的影響,發(fā)現(xiàn)糞菌移植使受體雛雞糞便菌群同組之間更為均一,但總體來看糞菌移植對受體雛雞糞便菌群的影響程度小于日齡帶來的影響。有研究發(fā)現(xiàn)飼料添加有機酸對雞腸道菌群的影響程度小于日齡帶來的影響,說明雞本身的遺傳與生理在腸道菌群的動態(tài)變化中起到重要作用[19]。也有研究將糞便菌群通過口服、在孵化中的胚上涂抹雞盲腸內(nèi)容物等方式移植給受體,結(jié)果一定程度上能夠表明受體菌群的發(fā)展與最初的接種或移植存在關(guān)系,但結(jié)果的重復(fù)性不是很好[20]。
不同的菌群組成會影響宿主的體重和免疫指標(biāo)[21,22],在本試驗中還發(fā)現(xiàn)接受糞菌移植的不同組雛雞體重、免疫指標(biāo)無顯著差異(數(shù)據(jù)未展示)。但最重要的是,將兩組糞便菌群移植給新生雛雞后,抗藥性水平得到了傳遞,即受體雛雞SPF組的抗藥性水平(抗藥率及MIC分布)相比普通商品肉雞及對照組顯著降低。這為解決家禽養(yǎng)殖環(huán)境中的高抗藥性現(xiàn)狀提供了出路。
FMT多用于治療人的艱難梭菌感染(CDI)[23],近來研究發(fā)現(xiàn)FMT在治愈CDI的同時,患者腸道內(nèi)其他抗藥菌伴隨著艱難梭菌也消失了[24],F(xiàn)MT不僅可以減少患者體內(nèi)抗生素抗藥基因的種類及數(shù)量,而且能清除大部分病原菌。動物剛出生時是菌群定殖的關(guān)鍵時期[25],選擇在雛雞進入養(yǎng)殖場之前將對抗生素敏感的SPF雞糞便菌群移植給新生雛雞,使對抗生素敏感的菌群在雛雞腸道定殖,對抗養(yǎng)殖場原有環(huán)境的抗藥性菌群,是降低抗藥性的可行途徑。
展望糞菌移植在動物養(yǎng)殖中的應(yīng)用,還有諸多問題,例如,如何篩選安全有效的供體,如何實現(xiàn)供體菌群的標(biāo)準(zhǔn)化及規(guī)?;苽洌绾芜x擇最佳接種方式,如何提高供體菌群在受體中的定殖效率,F(xiàn)MT非特異和特異治療的機制研究等只有將這些因素研究透徹,才能使FMT的應(yīng)用更加規(guī)范、有效。
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