肉雞產(chǎn)業(yè)鏈主要抗藥性菌株的分離鑒定與抗藥性分析

賈紀美 朱見深 駱延波 李璐璐 胡明 趙敏 楊勝福 劉曉文 戴美學(xué) 齊靜 劉玉慶

摘要：為分析肉雞產(chǎn)業(yè)鏈各環(huán)節(jié)主要抗藥性菌株的流行狀況，保證食源性公共衛(wèi)生安全，本試驗采集肉雞養(yǎng)殖、屠宰及加工各環(huán)節(jié)的樣本108份，通過6種不同含藥物培養(yǎng)基初步篩選抗藥性菌株，經(jīng)VITEK2自動微生物鑒定和自動藥敏檢測，并與微量肉湯稀釋法藥敏試驗進行比較。結(jié)果表明，從肉雞產(chǎn)業(yè)鏈各環(huán)節(jié)共鑒定獲得664株細菌，其中前三位的優(yōu)勢細菌為大腸桿菌375株（56.5%）、肺炎克雷伯菌110株（16.6%）和奇異變形桿菌79株（11.9%）。微量肉湯稀釋法藥敏試驗結(jié)果顯示，大腸桿菌、肺炎克雷伯菌和奇異變形桿菌對阿莫西林/克拉維酸、多西環(huán)素抗藥率都在90%以上，對環(huán)丙沙星和丁胺卡那霉素抗藥率在34.6%～87.0%之間，對美羅培南敏感。三種抗藥菌顯示多重抗藥性特征，集中在三、四重抗藥水平。VITEK2自動藥敏試驗結(jié)果顯示，大腸桿菌對氨芐西林、頭孢唑啉抗藥率分別是98.3%、92.6%；全部對厄他培南、亞胺培南敏感。肺炎克雷伯菌對氨芐西林、氨芐西林/舒巴坦抗藥率分別是97.3%、89.1%；大部分對厄他培南和亞胺培南敏感，肺炎克雷伯菌的抗藥性水平普遍稍高于大腸桿菌，二者呈正相關(guān)性。微量肉湯稀釋法和VITEK2自動藥敏試驗兩種方法重疊使用了環(huán)丙沙星和丁胺卡那霉素，檢測結(jié)果差異不顯著。肉雞產(chǎn)業(yè)鏈各環(huán)節(jié)大腸桿菌的抗藥性顯著高于EUCAST數(shù)據(jù)庫的結(jié)果，建議相關(guān)部門應(yīng)加強細菌抗藥性監(jiān)測，并逐步降低抗藥性，保障食品安全和公共衛(wèi)生。

關(guān)鍵詞：肉雞；抗藥性；大腸桿菌；肺炎克雷伯菌；鑒定；藥敏試驗

中圖分類號：S852.6文獻標識號：A文章編號：1001-4942（2018）07-0013-07

Abstract In order to explore the prevalence of main antibiotic-resistant strains in the industrial chain of broiler chickens and ensure food-borne public health safety， we collected 108 samples of broiler chickens from different spots of breeding， slaughtering and processing， and screened antibiotic-resistant strains through 6 different antimicrobial-containing culture media. The VITEK2 was used for automatically microbiological identification and automatic antimicrobial susceptibility testing（AST）， and the result was compared with that by broth microdilution method. The results showed that a total of 664 strains of bacteria were identified from different aspects of the broiler industrial chain. Among them， 375 strains （56.5%） of Escherichia coli， 110 strains （16.6%） of Klebsiella pneumoniae and 79 strains （11.9%） of Proteus mirabilis were the top three dominant bacteria. The result of broth microdilution method showed that the resistance rates to amoxicillin/clavulanic acid and doxycycline of E. coli，K. pneumoniae and P. mirabilis were all more than 90%， while 34.6%～87.0% of resistance rates to ciprofloxacin and amikacin. All isolated strains were sensitive to meropenem. Furthermore， these antibiotic-resistant bacteria exhibited multidrug resistance and tended to triple and quadruple resistance levels. AST of VITEK2 CDCAST card showed that the resistance rates to ampicillin and cefazolin of E. coli were 98.3% and 92.6% respectively， and all isolated E. coli strains were sensitive to ertapenem and imipenem. The resistance rates to ampicillin， ampicillin/sulbactam of K. pneumoniae were 97.3% and 89.1% respectively， and the majority strains was sensitive to ertapenem and imipenem. Whats more， the resistance rate of K. pneumoniae was generally higher than that of E. coli， and there was a positive correlation on resistance rate between them. Antibiotic ciprofloxacin and amikacin were both used in the methods of broth microdilution method and VITEK2 automatic antibiotic susceptibility testing， and there was no significant difference between the two methods. The antibiotic resistance level of E. coli in broiler industrial chain was significantly higher than that of EUCAST. It is suggested that relevant departments should strengthen the surveillance of bacterial antibiotic resistance， and gradually reduce the high antibiotic resistance， so as to ensure food safety and public health.

Keywords Broiler chicken； Antimicrobial resistance； Escherichia coli； Klebsiella pneumoniae； Identification； Antimicrobial sensitivity testing

近年來，隨著肉雞養(yǎng)殖集約化程度的日益提高和抗菌藥物的廣泛應(yīng)用，造成動物源抗藥菌株不斷增多，抗藥機制日趨復(fù)雜[1]，給動物疾病防治帶來嚴峻挑戰(zhàn)。動物源抗藥菌和抗藥基因可以通過不同環(huán)節(jié)傳遞給人類，危害人類及公共健康[2]。無論在發(fā)達國家還是發(fā)展中國家，由病原微生物引起的食源性疾病已成為食品安全中的重大問題[3]。

細菌病是肉雞養(yǎng)殖過程中常見的疾病之一。細菌抗藥性問題導(dǎo)致一些條件致病性病原微生物引起的疾病得以傳播和流行。最常見的雞大腸桿菌病頻發(fā)，且越來越難以用藥物治愈。另外，以前并不常見的細菌如肺炎克雷伯菌、奇異變形桿菌、陰溝腸桿菌、小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌等引起的疾病現(xiàn)在也頻繁發(fā)生[4]，使得家禽臨床發(fā)病情況越來越復(fù)雜，給臨床防治細菌病造成很大困難。

大腸桿菌（Escherichia coli）[5]、 肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae）[6-8]和奇異變形桿菌（Proteus mirabilis）[9，10]都是重要的條件致病菌，且能造成多種動物發(fā)病，也能感染人類，是人畜共患傳染病病原，應(yīng)引起足夠的重視。本試驗采集肉雞養(yǎng)殖、屠宰和加工等環(huán)節(jié)的樣本，利用不同的藥物培養(yǎng)基初步篩選出樣品中的優(yōu)勢抗藥菌株，經(jīng)鑒定獲得大腸桿菌、肺炎克雷伯菌、奇異變形桿菌三種主要抗藥菌，并對這些菌株進行細致的藥敏試驗，分析其抗藥性水平，以期為降低肉雞產(chǎn)業(yè)鏈細菌抗藥性奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 標準菌株

大腸桿菌標準菌株E.coli ATCC25922，由山東省畜禽疫病防治與繁育重點實驗室保存。

1.2 藥品和藥敏鑒定卡

注射用鹽酸萬古霉素、阿莫西林/克拉維酸鉀購自山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司；注射用頭孢哌酮/舒巴坦購自輝瑞制藥有限公司；注射用頭孢噻肟鈉購自齊魯制藥有限公司；亞胺培南、美羅培南購自中國藥品生物制品檢定所。多西環(huán)素、乳酸環(huán)丙沙星、丁胺卡那霉素獸藥原粉購自臨沂福本正藥業(yè)有限公司。藥敏鑒定卡CDCAST購自梅里埃診斷產(chǎn)品（上海）有限公司。

1.3 主要培養(yǎng)基及試劑

MH培養(yǎng)基（MHA）、MH肉湯（MHB）、伊紅美藍培養(yǎng)基、麥康凱培養(yǎng)基、腦心浸液培養(yǎng)基均購自北京陸橋技術(shù)責(zé)任有限公司；TSA購自英國OXOID公司。

1.4 試驗方法

1.4.1 樣品采集 選取山東某大型肉雞養(yǎng)殖、加工及屠宰場，于2013年6月，用無菌棉拭子采集商品肉雞場健康雞肛拭子50份、病死雞肛拭子9份、病死雞肝臟拭子9份、飼養(yǎng)員鼻拭子2份；采集健康蛋雞肛拭子10份、飼養(yǎng)員鼻拭子8份；采集屠宰場待宰雞鼻拭子9份，分割雞肉的體表、雞心、雞肝、雞翅、雞腿、雞胸、洗滌水共11份。共計采集樣品108份。將拭子樣品放入含少量無菌生理鹽水的EP管中，帶回實驗室。

1.4.2 抗性藥板配制 分別配制亞胺培南（16 mg/mL）、頭孢哌酮/舒巴坦（64/16 mg/mL）、阿莫西林/克拉維酸鉀（8/4 mg/mL）的麥康凱培養(yǎng)基，環(huán)丙沙星（4 mg/mL）、丁胺卡那霉素（64 mg/mL）、多西環(huán)素（16 mg/mL）的腦心浸液培養(yǎng)基，用于抗藥菌的初步篩選。

1.4.3 抗藥菌株的篩選與分離培養(yǎng) 分別取100 μL各樣品生理鹽水涂布于上述配制的6種藥物培養(yǎng)基上，至37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18～24 h。從每個藥物平板上挑取形態(tài)相似數(shù)量較多的其中一個單菌落，再經(jīng)過伊紅美藍培養(yǎng)基篩選優(yōu)勢菌株，最后劃線于MHA培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18～24 h。用棉簽刮取MHA培養(yǎng)基上菌苔，保種到30%的甘油肉湯中，編號，-20℃保藏。

1.4.4 抗藥菌株的生化鑒定 取上試甘油菌液無菌劃線于TSA培養(yǎng)基，置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18～24 h。將3 mL無菌生理鹽水加入清潔塑料管中，用無菌棉簽接種3～5個單菌落至鹽水管中，混勻制成菌懸液，用已校正的VITEK 2比濁儀調(diào)至0.5～0.7麥氏單位的菌懸液。配置好的菌懸液在接種試卡前，放置時間不能超過30 min。將菌懸液管及GN卡置于載卡臺上。使用VITEK 2 System，將載卡臺置于儀器中自動鑒定。

1.4.5 鑒定菌株的微量肉湯稀釋法藥敏試驗 利用微量肉湯稀釋法對主要分離菌（大腸桿菌、肺炎克雷伯菌和奇異變形桿菌）進行阿莫西林/克拉維酸鉀、乳酸環(huán)丙沙星、丁胺卡那霉素、美羅培南、多西環(huán)素、頭孢哌酮/舒巴坦6種藥物的敏感性試驗，大腸桿菌標準菌株E.coli ATCC25922作為質(zhì)控菌株，根據(jù)美國臨床和實驗室標準協(xié)會（CLSI）標準判定藥敏結(jié)果[11]。

1.4.6 鑒定菌株的CDCAST卡藥敏試驗 選擇含有18種抗生素的CDCAST卡，使用VITEK2上機對主要分離菌（大腸桿菌和肺炎克雷伯菌）進行自動測定藥敏試驗。藥物包括氨芐西林、氨芐西林/舒巴坦、哌拉西林/他唑巴坦、頭孢唑林、頭孢替坦、頭孢他啶、頭孢曲松鈉、頭孢吡肟、氨曲南、厄他培南、亞胺培南、丁胺卡那霉素、慶大霉素、妥布霉素、乳酸環(huán)丙沙星、左氧氟沙星、呋喃妥因、甲氧芐氨嘧啶/磺胺甲惡唑。大腸桿菌標準菌株E.coli ATCC25922作為質(zhì)控菌株，根據(jù)CLSI標準判定藥敏結(jié)果[11]。

2 結(jié)果與分析

2.1 肉雞產(chǎn)業(yè)鏈各環(huán)節(jié)主要抗藥菌的分離與鑒定

本試驗共采集樣品108份，經(jīng)不同藥物平板初步篩選抗性菌株，通過VITEK 2 System生化鑒定共獲得664株細菌，包括抗亞胺培南菌株119株，抗頭孢哌酮/舒巴坦菌株16株，抗阿莫西林/克拉維酸鉀菌株144株，抗環(huán)丙沙星菌株127株，抗丁胺卡那霉素菌株128株，抗多西環(huán)素菌株130株；經(jīng)不同藥板篩選，其主要抗性菌株為大腸桿菌375株（56.5%），肺炎克雷伯菌110株（16.6%）和奇異變形桿菌79株（11.9%），其他菌株的分離鑒定數(shù)量相對較少（表1）。

2.2 微量肉湯稀釋法和VITEK2自動藥敏試驗結(jié)果

微量肉湯稀釋法藥敏試驗結(jié)果顯示，大腸桿菌、肺炎克雷伯菌和奇異變形桿菌對阿莫西林/克拉維酸、多西環(huán)素抗藥性較高，抗藥率都在90%以上；對乳酸環(huán)丙沙星和丁胺卡那霉素抗藥性次之，抗藥率在34.6%～87.0%之間；而所有菌株都對美羅培南十分敏感（圖1A）。對于選定的抗生素，用于藥敏試驗的370株大腸桿菌五重抗藥有8株（2.2%）；四重抗藥92株（24.9%），三重抗藥149株（40.3%），二重抗藥103株（27.8%）。108株肺炎克雷伯菌中五重抗藥23株（21.3%）；四重抗藥49株（45.4%），三重抗藥22株（20.4%），二重抗藥5株（4.6%）。79株奇異變形桿菌中五重抗藥2株（2.5%）；四重抗藥29株（36.7%），三重抗藥38株（48.1%），二重抗藥8株（10.1%）（圖1B）。大腸桿菌、肺炎克雷伯菌、奇異變形桿菌基本在三、四重抗藥水平。而VITEK2的CDCAST卡藥敏試驗結(jié)果顯示，大腸桿菌對氨芐西林、頭孢唑林抗藥性最高，抗藥率分別是98.3%、92.6%；全部對厄他培南、亞胺培南敏感。肺炎克雷伯菌對氨芐西林、氨芐西林/舒巴坦抗藥性最高，抗藥率分別是97.3%、89.1%；大部分對厄他培南和亞胺培南敏感，敏感率均為93.6%，對哌拉西林/他唑巴坦、頭孢替坦敏感性也較高。本試驗中肺炎克雷伯菌的抗藥性水平普遍高于大腸桿菌（圖1C）。

微量肉湯稀釋法和VITEK2自動藥敏試驗兩種方法中重疊使用了乳酸環(huán)丙沙星和丁胺卡那霉素。微量肉湯稀釋法藥敏試驗中，大腸桿菌對乳酸環(huán)丙沙星和丁胺卡那霉素的抗藥率分別是63.5%、34.6%，肺炎克雷伯菌的抗藥率分別是87.0%、69.4%；VITEK2自動藥敏試驗中，大腸桿菌對兩者的抗藥率分別是65.6%、29.2%，肺炎克雷伯菌對兩者的抗藥率分別是81.8%、66.4%。兩種方法的藥敏試驗結(jié)果差異不顯著（P>0.05）。

2.3 大腸桿菌與肺炎克雷伯菌抗藥性水平相關(guān)性

通過對大腸桿菌和肺炎克雷伯菌對選定抗生素的抗藥率統(tǒng)計，并經(jīng)Spearman 相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，大腸桿菌與肺炎克雷伯菌的抗藥性水平存在極顯著正相關(guān)關(guān)系（P<0.001），即對于同種抗生素，大腸桿菌抗藥率高則肺炎克雷伯菌的抗藥率也高，反之也是如此（圖2）。

2.4 肉雞產(chǎn)業(yè)鏈環(huán)節(jié)主要抗藥菌對4種主要抗生素的MIC頻率分布

單純分析抗藥率雖能在一定程度上反映菌株的抗藥性水平，但是具體的MIC分布更能說明菌株的抗藥性程度。通過MIC統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)，抗藥率較高的抗生素其MIC集中分布于數(shù)值較高處，另外大腸桿菌、肺炎克雷伯菌和奇異變形桿菌對阿莫西林/克拉維酸鉀抗藥率不僅高而且MIC的數(shù)值也集中于較高處（圖3）。

2.5 與EUCAST數(shù)據(jù)庫中大腸桿菌抗藥性水平比較

通過與EUCAST數(shù)據(jù)庫中大腸桿菌的MIC分布進行比較發(fā)現(xiàn)，本試驗中的大腸桿菌MIC多分布在數(shù)值較高處，而EUCAST相對處于數(shù)值較低處（圖4），僅有大腸桿菌對丁胺卡那霉素的抗藥性水平與EUCAST相當。

3 討論與結(jié)論

本試驗從肉雞養(yǎng)殖、屠宰和加工等環(huán)節(jié)采集108份樣本，經(jīng)過不同的藥物培養(yǎng)基初篩及進一步的生化鑒定，共獲得664株抗性菌株，包含22個種，其中以大腸桿菌（56.5%）、肺炎克雷伯菌（16.6%）和奇異變形桿菌（11.9%）為最優(yōu)勢菌株，這三種菌都是條件致病菌，由于此次試驗未做致病性研究，不能確定分離菌株與其致病性的關(guān)系。其他菌株的分離鑒定率較低，這可能與我們設(shè)定的藥物、培養(yǎng)基、培養(yǎng)條件及人為篩選可培養(yǎng)的優(yōu)勢菌株有一定關(guān)系。

微量肉湯稀釋法與VITEK2自動藥敏試驗法的檢測結(jié)果差異不顯著。根據(jù)兩者檢測數(shù)據(jù)綜合分析，大腸桿菌、肺炎克雷伯菌對四環(huán)素類、青霉素類抗生素（除哌拉西林/他唑巴坦外）、氨基糖苷類抗生素抗藥率較高，對碳青霉烯類抗生素敏感，而對頭孢菌素類抗生素存在不同程度的抗藥。據(jù)陳靜[12]、江飆[13]、賴婧[14]、李娜[15]、Pantozzi[16]等報道，不同時間、地點試驗菌株對獸醫(yī)臨床常用藥抗藥性不同，但都表現(xiàn)出多重抗藥，且抗藥性較高。

全球每年消耗的抗生素大多數(shù)被用于食源性動物養(yǎng)殖業(yè)，且濫用現(xiàn)象嚴重，報道屢見不鮮，抗藥性菌株不可避免地產(chǎn)生。抗藥基因又可隨細菌繁殖垂直傳代，也可通過攜帶可轉(zhuǎn)移遺傳因子包括質(zhì)粒、轉(zhuǎn)座子和噬菌體等使抗藥性擴散傳播。動物體內(nèi)尤其腸道是非常豐富和復(fù)雜的菌種庫和基因庫，抗藥基因可能會隨時轉(zhuǎn)移。動物源抗藥菌可以通過多種途徑傳遞給人類，如動物性食品—消費鏈、與動物直接接觸、水源污染、空氣傳播和受到動物排泄物污染的農(nóng)產(chǎn)品等[17]，威脅人類的健康，使人類承擔更大的食品安全和生命健康風(fēng)險[18]。本試驗分離鑒定的三種條件性致病菌對多種抗生素都表現(xiàn)出非常高的抗藥率及多重抗藥性特征，但對動物臨床上很少使用的碳青霉烯類抗生素相對比較敏感。建議相關(guān)部門加強肉雞產(chǎn)業(yè)鏈各環(huán)節(jié)主要流行菌株的抗藥性檢測，從源頭上切斷產(chǎn)業(yè)鏈抗藥菌和抗性基因向人類的傳播，規(guī)范、合理、科學(xué)、有序地選擇藥物預(yù)防和治療，及早采取措施干預(yù)，是遏制細菌抗藥性的重要舉措[19]。

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